Technique explosive cochléaire murine néonatale en tant que

L'objectif général de cette procédure est la préparation, la culture, le traitement et l'immunomarquage d'explants cochléaires murins néonataux destinés à être utilisés comme outil de criblage in vitro en recherche auditive. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche auditive, notamment en permettant l'étude simultanée des cellules ciliées cochléaires, des synapses, des neurites et des neurones dans un modèle ex vivo, ainsi qu'en fournissant des informations sur les mécanismes d'action de molécules nouvellement introduites dans la cochlée, y compris des facteurs présents dans les sécrétions humaines. Le principal avantage de cette technique réside dans l'accélération du processus de criblage de composés thérapeutiques candidats avant leur évaluation in vivo.

Commencez avec une tête de nouveau-né fraîchement collectée, conservée dans de l'éthanol à 70 %, placée dans le couvercle d'une boîte de Pétri. Utilisez une lame de scalpel pour effectuer une incision superficielle dans la peau, de l'extrémité antérieure à l'extrémité postérieure du crâne. Ensuite, incisez les deux conduits auditifs externes et repliez la peau vers l'avant afin d'exposer tout le crâne.

Ensuite, ouvrez le crâne le long de la suture sagittale en déplaçant doucement la lame du scalpel de haut en bas, de l'avant vers l'arrière, afin d'éviter toute compression de la cochlée. Retirez et jetez le museau en effectuant une incision verticale directement en arrière des orbites. La partie postérieure du crâne doit toujours contenir le cerveau et la cochlée.

Ensuite, utilisez 4 pincettes pour disséquer par émoussage et éliminer le prosencéphale, le cervelet et le tronc cérébral. Placez les deux moitiés du crâne dans une boîte de Pétri en plastique de 60 millimètres remplie d'HBSS froide. Puis, à l’aide de 4 pincettes, exposez complètement la cochlée, qui est adjacente à l’artère stapédienne environnante, et séparez l’organe par émoussage de l’os temporal.

Transférez le cochlée dans une boîte de Pétri en verre de 50 millimètres à fond clair contenant du HBSS et placez la boîte sous le microscope. Placez la boîte de Pétri en plastique de 60 millimètres contenant l'autre moitié du crâne sur de la glace. Ensuite, utilisez 4 pinces pour disséquer soigneusement la capsule otique cochléaire.

À présent, utilisez un microcouteau ou deux paires de pinces de force 55 pour séparer délicatement le ligament spiral, adhérent à l'organe de Corti, du reste de la cochlée et du médialis. Cette opération peut être réalisée en saisissant le ligament spiral par sa partie la plus basale et en le déroulant doucement tout en progressant vers l'apex. Une fois le ligament spiral retiré, positionnez l'échantillon de manière à obtenir une vue sagittale longitudinale de la cochlée.

Ensuite, couper l'oreille interne en deux ou trois sections à l'aide du microcouteau, en classant ces sections selon les tours apical et basal. Retirer le tissu situé au-dessus pour la pièce la plus apicale et en dessous pour la pièce la plus basale, jusqu'à la couche réelle des cellules ciliées et des neurites, afin que l'explant cochléaire puisse reposer horizontalement dans la boîte de Pétri. Puis, utiliser la pince pour saisir délicatement et détacher la membrane tectoriale, une fine couche translucide située immédiatement au-dessus de l'organe de Corti.

L'étape la plus délicate sur le plan technique est probablement le retrait de la membrane téctoriale, mince et translucide, car on peut facilement endommager les cellules ciliées situées en dessous. En commençant par les bords du tissu, les cellules ciliées le long de tout l'explant sont préservées, sauf au niveau du bord même où le décollement de la membrane téctoriale a commencé. Enfin, retirez la membrane de Reissner située juste au-dessus des neurones du ganglion spiral en la pinçant avec une pince de chaque côté et en la décollant.

L'échantillon cochléaire est désormais prêt à être mis en culture après avoir retiré les zones endommagées situées aux bords. Commencez la procédure de culture en humidifiant l'extrémité d'une pipette d'un millilitre avec environ 120 microlitres de DMEM afin d'empêcher l'explant d'adhérer à l'intérieur de la pointe. Utilisez ensuite la pointe pré-humidifiée pour prélever au maximum 70 microlitres depuis la boîte de Pétri à fond en verre, puis déposez l'échantillon accompagné du liquide sur l'un des quatre inserts présents dans la boîte de Pétri à quatre puits.

Vérifiez au microscope que l’explant est dans l’orientation correcte. Assurez-vous que la zone des cellules ciliées dont la membrane tectoriale a été retirée est orientée vers le haut, et que la membrane basilaire accompagnée de la partie basale réduite du muscle medialis est orientée vers le bas et adhère au fond du lamelle. Si l’échantillon est orienté à l’envers lors de l’inspection, comme illustré ici, ajoutez du HBSS à partir de la pointe de la pipette et repositionnez le fragment jusqu’à ce qu’il soit correctement orienté.

Une fois que l'explant est correctement orienté, aspirez l'excès de HBSS, puis attendez 15 secondes. Ensuite, ajoutez 60 microlitres de milieu de culture tiède directement sur l'échantillon, en prenant soin de ne pas toucher l'échantillon avec la pipette. Remettez les couvercles intérieur et extérieur de la boîte de Pétri et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius.

Le lendemain, transférez l'explant cochléaire contenant les boîtes de Pétri de l'incubateur vers la hotte à flux laminaire. Aspirez le vieux milieu de culture ne contenant pas de SFB de l'emplacement. Ajoutez 60 microlitres par puits du milieu de traitement préparé et réchauffé.

Remettez la boîte de Pétri dans l’incubateur jusqu’à la coloration des cultures, après un maximum de sept jours. Comme le montre cette image confocale, cette technique préserve l’anatomie de toute la spire cochléaire, y compris les neurones du ganglion spiral ou SGN, permettant d’analyser les effets du traitement sur les neurites et les somas des SGN, en plus de l’organe de Corti. Comme illustré ici, ces explants peuvent être utilisés pour comparer simultanément l’effet du traitement sur les spires apicale et basale après coloration immunofluorescente.

Les cellules ciliées sont indiquées en vert et les structures neuronales apparaissent en rouge. Les synapses intactes peuvent être évaluées en marquant les protéines pré-synaptiques indiquées en rouge et les protéines post-synaptiques indiquées en vert, conjointement à la coloration des structures neuronales en bleu. Cette figure montre des images représentatives d’explants cochléaires apicaux et basaux après sept jours de culture, avec soit 3 % de FBS à gauche, soit 1 % de FBS à droite.

Les cellules incubées dans un milieu contenant 3 % de SFB commencent à migrer entre les jours quatre et cinq, comme l'indiquent les flèches gris clair pour les cellules ciliées et les flèches rouges pour les neurites. Les explants cultivés dans un milieu contenant 1 % de SFB conservent leur intégrité organisationnelle jusqu'au jour sept. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de vérifier visuellement l'intégrité structurelle et l'orientation du tissu cochléaire avant d'ajouter le milieu de culture final et les substances d'intérêt.

Après cette procédure, une reconstruction 3D peut être réalisée afin de confirmer la localisation spécifique aux types cellulaires des cellules exprimant la GFP au sein du médialis.