Name: Technique explosive cochléaire murine néonatale en tant que In Vitro Outil de dépistage dans la recherche auditive (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Découvrez la préparation et la culture d'explants cochléaires murins néonataux pour la recherche auditive. Cette technique permet d'étudier les cellules ciliées et les neurones tout en accélérant le dépistage de composés thérapeutiques.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par les subventions du Département national de la surdité et des autres troubles de la communication, R01DC015824 (KMS) et T32DC00038 (soutenant SD), le ministère de la Défense accorde W81XWH-15-1-0472 (KMS), la Fondation Bertarelli (KMS) Nancy Sayles Day Foundation (KMS) et le Lauer Tinnitus Research Center (KMS). Nous remercions Jessica E. Sagers, BA pour des commentaires perspicaces sur le manuscrit.

Le protocole d&#39;étude a été approuvé par le Comité institutionnel pour les soins et l&#39;utilisation des animaux (IACUC) du Massachusetts Eye and Ear. Les expériences ont été réalisées selon le Code de déontologie de l&#39;Association médicale mondiale. 1. Préparation de la dissection <ol><li> Préparation de la table chirurgicale <ol><li> Utilisez 70% d&#39;éthanol pour désinfecter la table chirurgicale. </li><li> Placez deux plaques de préparation non stériles à côté du microscope. </li><li> Préparez le tiroir à instruments, y compris les ciseaux opératoires stérilisés par la chaleur, une poignée de scalpel, un micro-couteau et une pince (deux de chacun des # 4 et # 55). Placez le tiroir à instruments et une boîte de Pétri à fond de verre de 50 mm, à paroi claire, sur un tampon non stérile. </li><li> Obtenir une lame de scalpel stérile # 15; Un sac en plastique scellable ou un récipient (pour éliminer les carcasses conformément aux directives institutionnelles); Glace dans un seau; Et la solution stérile stérile Hank&#39;s Balanced Salt (HBSS). Placez ces objets sur leAutre caisse non stérile. </li><li> Transférer le HBSS dans un tube de laboratoire plastique de 50 mL et le mettre sur de la glace. </li></ol></li><li> Préparer la culture <ol><li> Préparez tous les matériaux dans un capot à flux laminaire. Pour chaque quatre spécimens, mettez quatre patins de verre ronds à 10 mm en plaques autoclavées dans les quatre incrustations de la boîte de Petri 35 mm à 4 puits. </li><li> Pour chaque 4 spécimens, mélangez un volume total de 300 μL composé de ce qui suit dans un tube de microcentrifugeuse: 10 μL d&#39;adhésif tissulaire, 285 μL de NaHC03 et 5 μL de NaOH. </li><li> Mettez 45 μL de la solution résultante sur chaque patte de recouvrement et laissez-le pendant au moins 20 min à la RT; Cette solution peut être laissée sur la lamelle pendant plusieurs heures mais ne peut pas être laissée O / N. </li><li> Placez une ou deux boîtes de pétri à 4 po de 35 mm à l&#39;intérieur d&#39;une boîte de Petri de 10 cm afin de créer deux barrières contre la contamination. </li><li> Préparer un milieu de culture contenant 98% de milieu d&#39;aigle modifié de Dulbecco (DMEM), 1% de N-2 et 1% d&#39;ampicilline (65 μL par puits dans un tube de (micro) centrifugeuse). Réchauffer la solution à 25 ° C avant l&#39;utilisation. </li></ol></li></ol> 2. Dissection de l&#39;échantillon de cochléaire murin <ol><li> Décapitation de la souris néonatale <ol><li> Obtenir une boîte de Petri en plastique de 60 mm et vaporiser 70% d&#39;éthanol dans son couvercle afin que la surface soit humide. </li><li> Versez le HBSS froid du tube de laboratoire en plastique dans la partie inférieure du plastique de 60 mm et la boîte de Petri à fond transparent et à paroi transparente de 50 mm. Rangez le tube de laboratoire en plastique et les deux boîtes de pétri sur glace pour garder le tissu à froid chaque fois qu&#39;il ne se dissipe pas. </li><li> Placez une souris néonatale P3-P5 sur glace dans un doigt de coupure d&#39;un gant latex et attendez jusqu&#39;à ce que l&#39;hypothermie induit une perte de conscience (environ 1 à 3 minutes). </li><li> Détachez la souris rapidement avec des ciseaux opérationnels et jetez le corps dans le sac en plastique scellable. Mettez la tête de neonate coupée dans le70% d&#39;éthanol dans le couvercle de la boîte en Petri en plastique de 60 mm. </li></ol></li><li> Dissection macroscopique de l&#39;os temporel <ol><li> Retirer la peau du crâne en faisant une coupe superficielle de l&#39;extrémité antérieure à l&#39;extrémité postérieure (directement sur le suture sagittale) en utilisant la lame du scalpel. </li><li> Coupez les deux canaux auditifs externes avec la lame du scalpel et pliez la peau avant pour exposer le crâne entier. REMARQUE: Bien qu&#39;aucun microscope à dissection ne soit habituellement nécessaire pour cette étape, il peut être utilisé pour une meilleure visualisation. </li><li> Ouvrez le crâne le long de la suture sagittale en utilisant la lame de scalpel # 15. Assurez-vous de couper le crâne en déplaçant doucement la lame vers le haut et vers le bas de l&#39;avant vers la postérieure pour éviter la compression des cochlées. REMARQUE: Le crâne ne devrait pas être ossifié à cet âge et devrait être facilement coupé. </li><li> Retirer et jeter le museau en faisant une coupe verticale directement postérieure aux orbites en utilisant le scalpel # 15lame. NOTE: La partie postérieure du crâne doit encore contenir le cerveau et les cochlées. </li><li> Éliminer le cerveau antérieur, le cervelet et le tronc cérébral par une dissection émoussée avec une pince # 4. </li></ol></li><li> Extraction microscopique des cochlées <ol><li> Ajustez le microscope (grossissement 6,5 x) et la source lumineuse en plaçant la pince sous la portée et en optimisant l&#39;éclairage et la mise au point. </li><li> Placez les deux moitiés du crâne dans la boîte à pétales en plastique de 60 mm remplie de HBSS froid. </li><li> Expliquez complètement la cochlée / e, identifiable comme étant adjacente à l&#39;artère stapédiale environnante (une artère tortueuse dans l&#39;os temporel) et séparez manifestement l&#39;organe de l&#39;os temporel en utilisant des pinces n ° 4. </li><li> Transférer la cochlée dans la boîte de Petri à 50 mm, à paroi claire et à fond de verre et positionner le plat sous le microscope. </li><li> Placez la boîte en Petri en plastique de 60 mm avec l&#39;autre moitié du crâne sur la glace. </Li&gt; <li> Retirez la cochlée du système vestibulaire et dissérez soigneusement la capsule oculaire cochléaire (typiquement cartilagineuse à cet âge) avec une pince # 4. Utilisez les pince # 55 pour toutes les étapes supplémentaires. </li></ol></li><li> Etapes finales du traitement des tissus <ol><li> Continuer avec le traitement du tissu de l&#39;oreille interne en séparant soigneusement le ligament spirale adhérent à l&#39;organe de Corti du reste de la cochlée et du modiolus à l&#39;aide du micro-couteau ou de deux pinces. <ol><li> Couper dans la zone plus sombre et translucide à la crevasse entre le ligament spirale et la région des cellules capillaires et procéder à l&#39;élimination subséquente du ligament spirale en le saisissant à l&#39;aspect le plus bas et en le dégageant doucement en se déplaçant apicalement. </li></ol></li><li> Placez l&#39;échantillon pour obtenir une vue longitudinale et sagittale de la cochlée et coupez la cochlée en deux à trois sections en utilisant le micro-couteau, en classant ces sections comme apical, (moyen,) et bTour d&#39;horizon. Retirez le tissu supérieur et inférieur à la couche réelle de cellules capillaires et de neurites afin d&#39;obtenir une pièce d&#39;explant cochléaire qui peut être placée horizontalement sur la boîte à pétrole. REMARQUE: une taille appropriée pour une adhérence stable au plat de culture est approximativement de moitié d&#39;un tour cochléaire. </li><li> Retirer la membrane tectoriale, une couche translucide très mince immédiatement supérieure à l&#39;organe de Corti, en la pelant doucement avec une pince. </li><li> Retirez la membrane de Reissner, immédiatement supérieure aux SGN, en la touchant avec une pince des deux côtés et en l&#39;épluchant. REMARQUE: Retirez les zones de cellules capillaires endommagées situées latéralement en les coupant avec le micro-couteau. </li></ol></li></ol> 3. Transfert de spécimens aux plaques de culture <ol><li> Enlevez les 45 μl de solution adhésive tissulaire des quatre pattes de recouvrement. Lavez chaque patte de couverture avec 50 μL d&#39;H 2 O stérile. Aspirez l&#39;eau. </li><li> Prenez la pipette de 1 mL. Mouiller la pointe de la pipette avec environ 120 μL de DMEM pour empêcher l&#39;échantillon d&#39;adhérer à l&#39;intérieur de la pointe. </li><li> Transférer les spécimens individuellement à l&#39;aide de la pipette de 1 mL. Pipettez un maximum de 70 μL de la boîte à pétales à fond de verre, petit, à paroi clochée et à fond clair, et placez l&#39;échantillon avec le liquide sur l&#39;une des 4 inlays (préparé avec des pattes de recouvrement) dans la boîte à pétre de 4 puits . </li><li> Vérifiez sous le microscope (grossissement 50X) que l&#39;échantillon est dans l&#39;orientation correcte. Assurez-vous que la zone des cellules ciliées à partir de laquelle la membrane tectoriale a été retirée est orientée vers le haut. Assurez-vous que la membrane basilaire, avec la partie basale basée du modiolus, fait face vers le bas et adhère à la lamelle. <ol><li> Si l&#39;échantillon est orienté à l&#39;envers lors de l&#39;inspection, déposez le HBSS qui reste dans la pointe de la pipette dans l&#39;incrustation et repositionnez la pièce jusqu&#39;à ce qu&#39;elle soit correctement orientée. NONTE: Cela empêchera les cellules capillaires de flotter en milieu de culture sans support structurel de la lamelle, ce qui pourrait entraîner une dégénérescence. </li></ol></li><li> Aspirer l&#39;excès de HBSS en utilisant la pipette de 1 mL. Attendre 15 s. </li><li> Pipetter 60 μL du milieu de culture chaud préparé (98% de DMEM, 1% de N-2 et 1% d&#39;ampicilline) directement sur l&#39;échantillon. Veillez à ne pas toucher l&#39;échantillon avec la pipette. Remplacer les couvercles intérieurs et extérieurs des boîtes de pétri et incuber O / N à 37 ° C. </li><li> Remettre toutes les solutions stockées dans leurs endroits appropriés, éliminer les carcasses et les déchets résiduels, décontaminer la table chirurgicale selon les directives institutionnelles ( par exemple, utiliser de l&#39;éthanol ou de l&#39;hypochlorite), nettoyer et autoclaver les instruments et jeter les objets tranchants dans le récipient approprié . </li></ol> 4. Ajout de culture finale Médias et substances intéressantes REMARQUE: Les explants cochléaires seront prêts à être utilisés 10 à 16 heures plus tard. <ol><li> Préparer un mixtuRe 97% de DMEM, 1% de sérum bovin fœtal (FBS), 1% de N-2 et 1% d&#39;ampicilline (65 μL par puits dans un tube de microcentrifugeuse, chauffez la solution à 25 ° C avant l&#39;utilisation). </li><li> Ajoutez d&#39;autres substances intéressantes aux solutions pour les groupes de traitement respectifs. Si des substances fluorescentes sont ajoutées ( p. Ex. Virus de la fluorescence verte (GFP) -expressing virus, dans une publication récente, une concentration de 10 10 GC de virus Adeno-Associés (AAV) a été utilisée pendant 48 h dans 50 μL) 18 , protégez-vous contre lumière. </li><li> Transférer les boîtes de Petri contenant l&#39;explantée cochléaire de l&#39;incubateur et les placer sous la hotte à flux laminaire. </li><li> Aspirez l&#39;ancien milieu de culture (sans FBS) avec la pipette des inlays. </li><li> Ajouter 60 μl par puits du milieu de culture chaude (traitement) préparé (97% de DMEM, 1% de FBS, 1% de N-2, 1% d&#39;ampicilline et les substances intéressantes). </li><li> Remettre la boîte de Petri dans l&#39;incubateur (37 ° C). </li><li> View rPar exemple au microscope pour identifier les signes de contamination, la migration cellulaire ou le détachement de l&#39;explant cochléaire et effectuer une coloration après un maximum de 7 jours. </li></ol> 5. Immunofluorescence - Jour 1 <ol><li> Préparez la solution de blocage (94% de solution salée tamponnée au phosphate (PBS), 5% de sérum normal de chèvre ou de cheval (NGS / NHS, selon les anticorps secondaires) et 1% de tensioactif non ionique (voir le tableau des matériaux )) et le stock Une solution d&#39;anticorps (98,6% de PBS, 1% de NHS et 0,4% de tensioactif non ionique avec les anticorps respectifs). NOTE: Les anticorps comprennent le lapin anti-Myo7A à une concentration de 1: 400+ (myosine 7A, pour les cellules capillaires interne et externe) et anti-TuJ1 de souris 1: 200+ (β-tubuline, pour SGN) OU souris (IgG1) anti -CtBP2 1: 200+ (protéine de liaison c-terminale, pour présynapse), souris (IgG2a) anti-PSD95 1: 50+ (densité postsynaptique, post-synapse) et anti-NF-H 1: 1000+ (neurofilament, Pour SGN et fibres nerveuses). &quot;+&quot; MeaNs &quot;ou plus haut.&quot; </li><li> Aspirez le milieu de culture à l&#39;aide d&#39;une pipette. Veillez à ne pas toucher l&#39;échantillon. </li><li> Sous le capot de flux laminaire, rincer les explosifs cochléaires deux fois avec du PBS stérile, en plaçant les échantillons sur un agitateur pendant 5 min après chaque lavage. </li><li> Fixez le tissu dans du paraformaldéhyde à 4% (PFA - ATTENTION) pendant 20 minutes sur le shaker (sous le capot). Aspirez le PFA. </li><li> Appliquer 60 μL de PBS sur les explants cochléaires et placer la boîte de Petri sur un agitateur pendant 5 min. Aspirez le PBS. Répétez 3x. </li><li> Placez les explants cochléaires dans une solution de blocage préparée (94% de PBS, 5% de NHS et 1% de tensioactif non ionique) pendant 30 minutes sur l&#39;agitateur. </li><li> Placez les explants cochléaires dans une solution d&#39;anticorps stock préparée (98,6% de PBS, 1% de NHS et 0,4% de tensioactif non ionique) avec les anticorps primaires respectifs (vortex avant utilisation) O / N sur un compteur à la RT. REMARQUE: Enrouler les boîtes de Petri avec des serviettes en papier humide enfermées dans une pellicule en plastique (ou une feuille d&#39;aluminium si le solut ajoutéIon contient des matériaux fluorescents tels que des virus exprimeurs de GFP) pour garder la vaisselle humide et pour éviter l&#39;évaporation de la solution d&#39;anticorps O / N. </li></ol> 6. Immunofluorescence - Jour 2 <ol><li> Préparer la tache 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (300 nM) et utiliser la solution d&#39;anticorps stock pour obtenir les mélanges d&#39;anticorps secondaires appropriés, complémentaires aux anticorps primaires à l&#39;étape 5.1. ( P. Ex ., Chèvre anti-lapin 488 1: 200+ et chèvre anti-souris 568 1: 200+ OU chèvre anti-souris (IgG1) 568 1: 1000+, chèvre anti-souris (IgG2a) 488 1: 500+, Et chèvre anti-poulet 647 1: 200+ OU Phalloidine 568 1: 200+ (pour les cellules capillaires interne et externe)). </li><li> Aspirer la solution primaire d&#39;anticorps. </li><li> Appliquer 60 μL de PBS sur les explants cochléaires et placer la boîte de Petri sur un agitateur pendant 5 min. Aspirez le PBS. Répétez 3x. </li><li> Placez les explants cochléaires dans une solution d&#39;anticorps stock préparée (98,6% de PBS, 1% de NHS et 0,4% de tensioactif non ionique) avec les resAnticorps secondaires pectifs (vortex avant utilisation) pendant 1,5 h sur un comptoir et protéger contre la lumière. </li><li> Aspirer la solution d&#39;anticorps secondaire et rincer les explants cochléaires avec une tache DAPI (placer sur un agitateur pendant 1 min puis aspirer). </li><li> Appliquer 60 μL de PBS sur les explants cochléaires et placer la boîte de Petri sur un agitateur pendant 5 min. Aspirez le PBS. Répétez 3x. </li><li> Utilisez une pince pour retirer les lamelles avec des échantillons de la plaque à 4 puits, les immerger dans un récipient rempli d&#39;H 2 O distillé et sécher les lamelles en les mettant verticalement en contact avec des serviettes en papier. </li><li> Placez une goutte de support de protection antifade sur la glissière du microscope et inversez les lamelles pour immerger le tissu tourné vers le bas dans le milieu. </li><li> Scellez la lamelle en utilisant un vernis à ongles transparent couvrant le bord (sans écraser l&#39;échantillon sous le verre). Laisser les lames situées à plat dans une zone couverte, loin de la lumière pendant 15 à 20 min jusqu&#39;à ce qu&#39;elles soient sèches et froides.Placez-les dans une boîte ou examinez-le sous le microscope confocal. REMARQUE: la coloration fluorescente est mieux conservée en stockant les diapositives à 4 ou -20 ° C. </li></ol> 7. Confocal Imaging <ol><li> Obtenez une vue d&#39;ensemble et des images agrandies pour l&#39;organe de la région de Corti, y compris les neurites et les SGN. REMARQUE: Paramètres standard pour le processus d&#39;imagerie: Format de 1 024 x 1 024 pixels, vitesse de 400 Hz, image moyenne de 3, 20% d&#39;intensité laser globale, et habituellement lentille 20X et 63X avec immersion à l&#39;huile (potentiellement combinée avec un zoom numérique 2X). Les paramètres de canal pour le protocole de coloration DAPI, Myo7A et TuJ1 sont décrits ci-dessus: 405 5% DAPI, &quot;Smart Gain&quot; 766.8V, &quot;Smart Offset&quot; 0.0% - 488 15% isothiocyanate de fluorescéine (FITC), &quot;Smart Gain&quot; 622.2V , &quot;Smart Offset&quot; 0,0% - 561 13% d&#39;isothiocyanate de tétraméthylrhomadine (TRITC), &quot;Smart Gain&quot; 562,4V, &quot;Smart Offset&quot; 0,0%. </li><li> Fusionnez les images dans une pile z en utilisant leLogiciel pour obtenir une projection d&#39;axe z. </li></ol>

<ol><li>Mathers, C., Smith, A., Concha, M. Global burden of hearing loss in the year. World Health Organization (WHO). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf">http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf</a> (2000).</li>
<li>Geleoc, G. S., Holt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sound+strategies+for+hearing+restoration%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sound strategies for hearing restoration).</a> Science. 344 (6184), 1241062(2014).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+age-related+hearing+loss+by+early+noise+exposure%3A+evidence+of+a+misspent+youth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth.</a> J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+insult+to+injury%3A+cochlear+nerve+degeneration+after+%26%2334%3Btemporary%26%2334%3B+noise-induced+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after &#34;temporary&#34; noise-induced hearing loss.</a> J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li>
<li>Makary, C. A., Shin, J., Kujawa, S. G., Liberman, M. C., Merchant, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+primary+cochlear+neuronal+degeneration+in+human+temporal+bones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Age-related primary cochlear neuronal degeneration in human temporal bones.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 12 (6), 711-717 (2011).</li>
<li>Jensen, J. B., Lysaght, A. C., Liberman, M. C., Qvortrup, K., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+and+delayed+cochlear+neuropathy+after+noise+exposure+in+pubescent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Immediate and delayed cochlear neuropathy after noise exposure in pubescent mice.</a> PLoS One. 10 (5), (2015).</li>
<li>Landegger, L. D., Psaltis, D., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+audiometric+thresholds+do+not+predict+specific+cellular+damage+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Human audiometric thresholds do not predict specific cellular damage in the inner ear.</a> Hear Res. , 83-93 (2016).</li>
<li>Wang, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+Activity+of+Cochlear+Hair+Cells+Triggered+by+Fluid+Secretion+Mechanism+in+Adjacent+Support+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous Activity of Cochlear Hair Cells Triggered by Fluid Secretion Mechanism in Adjacent Support Cells.</a> Cell. 163 (6), 1348-1359 (2015).</li>
<li>Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+vs+type+II+spiral+ganglion+neurons+exhibit+differential+survival+and+neuritogenesis+during+cochlear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development.</a> Neural Dev. 6, (2011).</li>
<li>Dinh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+interfering+RNA+against+Bax+attenuates+TNFalpha-induced+ototoxicity+in+rat+organ+of+Corti+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Short interfering RNA against Bax attenuates TNFalpha-induced ototoxicity in rat organ of Corti explants.</a> Otolaryngol Head Neck Surg. 148 (5), 834-840 (2013).</li>
<li>Mazurek, B., Yu, Y., Haupt, H., Szczepek, A. J., Olze, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salicylate+modulates+Hsp70+expression+in+the+explanted+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Salicylate modulates Hsp70 expression in the explanted organ of Corti.</a> Neurosci Lett. 501 (2), 67-71 (2011).</li>
<li>Kao, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+osteoprotegerin+expression+in+the+inner+ear+causes+degeneration+of+the+cochlear+nerve+and+sensorineural+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Loss of osteoprotegerin expression in the inner ear causes degeneration of the cochlear nerve and sensorineural hearing loss.</a> Neurobiol Dis. 56, 25-33 (2013).</li>
<li>Jan, T. A., Chai, R., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+LacZ-expressing+cells+from+mouse+inner+ear+tissues+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolating LacZ-expressing cells from mouse inner ear tissues using flow cytometry.</a> J Vis Exp. (58), e3432(2011).</li>
<li>Haque, K. D., Pandey, A. K., Kelley, M. W., Puligilla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+embryonic+mouse+cochlear+explants+and+gene+transfer+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Culture of embryonic mouse cochlear explants and gene transfer by electroporation.</a> J Vis Exp. (95), e52260(2015).</li>
<li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> J Vis Exp. (36), (2010).</li>
<li>Mulvaney, J. F., Dabdoub, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+time+lapse+imaging+of+mouse+cochlear+explants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants.</a> J Vis Exp. (93), e52101(2014).</li>
<li>Wang, Q., Green, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+neurotrophin-3+in+synapse+regeneration+by+spiral+ganglion+neurons+on+inner+hair+cells+after+excitotoxic+trauma+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional role of neurotrophin-3 in synapse regeneration by spiral ganglion neurons on inner hair cells after excitotoxic trauma in vitro.</a> J Neurosci. 31 (21), 7938-7949 (2011).</li>
<li>Landegger, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+AAV+vector+enables+safe+and+efficient+gene+transfer+to+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear.</a> Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).</li>
<li>Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+Factors+from+Human+Vestibular+Schwannomas+Can+Cause+Cochlear+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage.</a> Sci Rep. 5, 18599(2015).</li>
<li>Soares, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+derived+from+human+vestibular+schwannomas+associated+with+poor+hearing+damage+cochlear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells.</a> Neuro Oncol. , (2016).</li>
<li>Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerated+synapses+between+postnatal+hair+cells+and+auditory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 14 (3), 321-329 (2013).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ouabain-induced+cochlear+nerve+degeneration%3A+synaptic+loss+and+plasticity+in+a+mouse+model+of+auditory+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Ouabain-induced cochlear nerve degeneration: synaptic loss and plasticity in a mouse model of auditory neuropathy.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 15 (1), 31-43 (2014).</li>
<li>Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+after+noise+exposure%3A+acceleration+of+cochlear+synaptopathy+in+%26%2334%3Brecovered%26%2334%3B+ears%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in &#34;recovered&#34; ears.</a> J Neurosci. 35 (19), 7509-7520 (2015).</li>
<li>Barclay, M., Constable, R., James, N. R., Thorne, P. R., Montgomery, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+sensory+stimulation+alters+the+molecular+make-up+of+glutamatergic+hair+cell+synapses+in+the+developing+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea.</a> Neuroscience. , 50-62 (2016).</li>
<li>Zinn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Silico+Reconstruction+of+the+Viral+Evolutionary+Lineage+Yields+a+Potent+Gene+Therapy+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector.</a> Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).</li>
<li>Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genome+size+on+AAV+vector+packaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Effect of genome size on AAV vector packaging.</a> Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).</li>
<li>Shu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Adeno-Associated+Viral+Vectors+That+Target+Neonatal+and+Adult+Mammalian+Inner+Ear+Cell+Subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of Adeno-Associated Viral Vectors That Target Neonatal and Adult Mammalian Inner Ear Cell Subtypes.</a> Hum Gene Ther. , (2016).</li>
<li>Kao, S. Y., Soares, V. Y., Kristiansen, A. G., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+TRAIL-DR5+pathway+promotes+sensorineural+degeneration+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of TRAIL-DR5 pathway promotes sensorineural degeneration in the inner ear.</a> Aging Cell. 15 (2), 301-308 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Les chercheurs doivent perfectionner la technique de dissection avant d&#39;effectuer des expériences impliquant des explants cochléaires. Les cellules ciliées sont généralement endommagées lors des dissections effectuées au début de la courbe d&#39;apprentissage, et un moment particulièrement problématique pour leur intégrité est l&#39;élimination de la membrane tectoriale, qui nécessite des mains régulières, des outils appropriés et une expérience. Pour économiser du temps et des ressources, un contrôle visuel devrait...

La perte auditive sensorielle (SNHL) reflète les dommages causés à l&#39;oreille interne ou à la voie auditive ascendante. Bien que la perte auditive soit le déficit sensoriel le plus fréquent chez les humains 1 , les traitements curatifs n&#39;existent pas encore 2 . Bien que les implants cochléaires ou auditifs du tronc cérébral puissent rétablir un certain degré d&#39;audition chez les patients atteints de SNHL grave à profond, l&#39;audition fournie par ces dispositifs est encore très différente de l&#39;audition &quot;naturelle&quot;, en particulier lors des tentatives de compréhension de la parole dans le bruit ou de l&#39;écoute musicale. Bien que la dégénérescence des cellules capillaires ait longtemps été considérée comme la conséquence principale des événements auditifs traumatiques ( p. Ex., Exposition au bruit élevé), il existe de plus en plus de preuves que les synapses transmettant l&#39;information des cellules capillaires au nerf auditif sont au moins aussi vulnérables aux traumatismes acoustiques 3 , 4 , 5 </sup<html> &gt; , 6 . Étant donné que les seuils audiométriques humains, l&#39;étalon-or actuel pour l&#39;évaluation de la fonction auditive, ne prédisent pas un dommage cellulaire spécifique dans l&#39;oreille interne, des outils plus raffinés sont nécessaires pour détecter la dégénérescence cellulaire dès que possible et pour initier un traitement adéquat 7 . Des traitements pharmaceutiques prometteurs pour la perte d&#39;audition sont souvent testés sur des cultures cellulaires homogènes in vitro , mais de tels systèmes ne modélisent pas précisément le micro-environnement cochléaire. On sait que les cellules cochléaires sécrètent des facteurs trophiques qui influent sur d&#39;autres types de cellules dans la cochlée 8 , 9 , un processus crucial in vivo qui se perd lorsque l&#39;organe de Corti 10 , 11 ou Spiral Ganglion Neurons (SGN) 12 est cultivé isolément ou lorsque Les marqueurs moléculaires sont analysésLes études in vivo qui peuvent être nécessaires pour la validation des données in vitro pour établir de nouveaux traitements personnalisés pour la perte d&#39;audition dans la poursuite de la «médecine de précision» nécessitent des ressources et des temps importants. Cela est particulièrement important lorsque l&#39;on considère Combien d&#39;effort est nécessaire pour parfaire et effectuer des injections membranaires de l&#39;oreille moyenne ou des fenêtres rondes avec des tests auditifs et la dissection subséquente de la totalité des cochléaires. Le criblage efficace de composés prometteurs dans des cultures organotypiques ex vivo connues sous le nom d&#39;explants cochléaires fournit une alternative économique et fiable 14 , 15 , 16 , 17 . Cet article décrit un protocole permettant de générer, de maintenir et d&#39;évaluer des explants cochléaires traités. Les applications spécifiques pour ce modèle sont soulignées, y compris son utilisation dans le dépistageDe composés potentiellement thérapeutiques et l&#39;évaluation comparative de vecteurs viraux pour la thérapie génique. Une approche d&#39;explant ex vivo permet aux chercheurs de visualiser les effets d&#39;un traitement donné sur différentes populations cellulaires in situ , en facilitant l&#39;identification des mécanismes spécifiques du type cellulaire et le raffinement ultérieur des thérapies ciblées. Dans l&#39;ensemble, cette technique fournit un modèle pour étudier la cochlée ex vivo tout en préservant les interférences vitales entre les types de cellules très différents qui coexistent dans la cochlée.

<table><tbody><tr><td>Ampicilline, sel de sodium</td><td>Invitrogen</td><td>11593-027</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-CtBP2, souris (IgG1)</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>612044</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-Myo7A, lapin</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-NF-H, poulet</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5539</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-PSD95, souris (IgG2a)</td><td>Anticorps Inc.</td><td>75-028</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-TuJ1, souris</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak Adhésif pour cellules et tissus, 5 mg</td><td>Corning</td><td>354241</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 15 mL Tubes à centrifuger, fond conique, graduation,</td><td>Greiner Bio-One</td><td>stérile 188161</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Boîte de culture cellulaire, 100 x 20 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Boîte de culture cellulaire, 35 x 10 mm, 4 anneaux intérieurs</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627170</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture cellulaire CELLSTAR, 60 x 15 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 50 mL Tubes à centrifuger, fond conique, graduation,</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Vernis à ongles transparent</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Plats à fond en verre transparent (verre 40mm), PELCO&reg ;, Sleeve/20, 50 x 7 mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>14027-20</td><td></td></tr><tr><td>Couvre-lames, rond, verre, 10 mm de diamètre, épaisseur #1, 0,13 - 0,16 mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td></td><td></td>260368</tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phénylindole, dichlorhydrate)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Eau distillée, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15230-162&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), teneur élevée en glucose, pyruvate, sans glutamine, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps (Dumostar)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Alcool éthylique (EtOH), pur, 200 proof, anhydre, &ge ; 99,5 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836-1L</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS), qualifié, régions approuvées par l’USDA, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10437-028&nbsp ;</td><td>Aliquote dans des tubes de 50 mL et conserver à -20&deg ; C chèvre congélateur</td></tr><tr><td>anti-poulet-647 anticorps secondaire</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21469</td><td></td></tr><tr><td>chèvre anti-souris (IgG)-568 anticorps secondaire</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>chèvre anti-souris (IgG1)-568 anticorps secondaire</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21124</td><td></td></tr><tr><td>chèvre anti-souris (IgG2a)-488 anticorps secondaire</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>chèvre anti-lapin-488 anticorps secondaire</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37116</td><td></td></tr><tr><td>H2O, stérile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>TMS-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS), calcium, magnésium, sans rouge de phénol, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Plateau à instruments avec couvercle Acier inoxydable</td><td>Mountainside Medical</td><td>TechMed4255</td><td></td></tr><tr><td>Micro couteau (dissection) &ndash ; coudé 30&deg ;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope, VistaVision, à code couleur, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm d’épaisseur, blanches, paquet de 72</td><td>VWR</td><td>16004-382</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X), 5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3, solution de bicarbonate de sodium à 7,5 %, 100 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>NaOH, solution d’hydroxyde de sodium, 1 L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>Sérum normal pour chevaux (NHS)</td><td>Invitrogen</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux opératoires</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6806</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA), qualité réactif, cristallin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Avant l’utilisation : Établir des procédures opérationnelles normalisées basées sur les protocoles disponibles en ligne</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023&nbsp ;</td><td>Autoclave avant utilisation</td></tr><tr><td>Phalloïdine, Alexa Fluor 568&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>Coussin de préparation, non stérile</td><td>Medline</td><td>05136CS</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation Safe-Lock, polypropylène, 0,5 mL</td><td>Autoclave</td><td>de 022363719</td><td>Eppendorf</td> avant utilisation</tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation Safe-Lock, polypropylène, 1,5 mL</td><td>Autoclave</td><td>de 022363204</td><td>Eppendorf</td> avant utilisation</tr><tr><td>Lames de scalpel - #15</td><td>Outils de science fine</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Manche de scalpel - #4</td><td>Outils de science fine</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000-C Stéréomicroscope</td><td>Zeiss°</td><td>000000-1106-133</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP5 microscope confocal</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X (tensioactif non ionique)</td><td>Integra</td><td>T756.30.30</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield support de montage anti-décoloration pour fluorescence</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sac à fermeture éclair, refermable, 4 x 6'' - 2 mm d’épaisseur</td><td>Zipline</td><td>0609132541599</td><td></td></tr></tbody></table>

technique explosive cochléaire murine néonatale en tant que<em&gt; in vitro</em&gt; outil de dépistage dans la recherche auditive

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Bien qu&#39;il y ait eu des progrès remarquables dans la recherche de l&#39;ouïe au cours des dernières décennies, il n&#39;y a toujours pas de remède contre la perte d&#39;audition sensorielle (SNHL), une affection qui entraîne généralement une perte ou une perte des structures mécanosensorielles délicates de l&#39;oreille interne. Des essais sophistiqués in vitro et ex vivo ont émergé ces dernières années, ce qui a permis de dépister un nombre croissant de composés potentiellement thérapeutiques tout en minimisant les ressources et en accélérant les efforts pour développer des remèdes pour SNHL. Bien que les cultures homogènes de certains types de cellules continuent à jouer un rôle important dans la recherche actuelle, de nombreux scientifiques s&#39;appuient maintenant sur des cultures organotypiques plus complexes d&#39;oreilles internes murines, également connues sous le nom d&#39;explants cochléaires. La préservation des structures cellulaires organisées à l&#39;intérieur de l&#39;oreille interne facilite l&#39;évaluation in situ de divers composants de l&#39;infrastructure cochléaire, y compris les cellules capillaires interne et externe, les neurones ganglionnaires en spirale, les neuronesItes, et les cellules de soutien. Nous présentons ici la préparation, la culture, le traitement et l&#39;immunocoloration des explants cochléaires murins néonataux. La préparation minutieuse de ces explants facilite l&#39;identification des mécanismes qui contribuent au SNHL et constituent un outil précieux pour la communauté de la recherche auditive.

Bien que de nombreux protocoles se concentrent sur l&#39;organe des explants de Corti, cette technique tente de préserver l&#39;anatomie de l&#39;ensemble du tournant cochléaire, y compris les SGN. Cela donne aux chercheurs la possibilité d&#39;analyser les effets d&#39;un traitement donné sur les neurites et somata des SGN en plus de l&#39;organe de Corti. Effectuer une dissection qui conserve une partie du modiolus, comme décrit ici, est plus difficile à utiliser que l&#39;explantation...

Le but de ce protocole est de démontrer la préparation, la culture, le traitement et l&#39;immunocoloration des explants cochléaires murins néonataux. La technique peut être utilisée comme outil de dépistage in vitro dans la recherche auditive.

Technique explosive cochléaire murine néonatale en tant que<em&gt; In Vitro</em&gt; Outil de dépistage dans la recherche auditive

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

L'objectif général de cette procédure est la préparation, la culture, le traitement et l'immunomarquage d'explants cochléaires murins néonataux destinés à être utilisés comme outil de criblage in vitro en recherche auditive. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche auditive, notamment en permettant l'étude simultanée des cellules ciliées cochléaires, des synapses, des neurites et des neurones dans un modèle ex vivo, ainsi qu'en fournissant des informations sur les mécanismes d'action de molécules nouvellement introduites dans la cochlée, y compris des facteurs présents dans les sécrétions humaines. Le principal avantage de cette technique réside dans l'accélération du processus de criblage de composés thérapeutiques candidats avant leur évaluation in vivo.Commencez avec une tête de nouveau-né fraîchement collectée, conservée dans de l'éthanol à 70 %, placée dans le couvercle d'une boîte de Pétri. Utilisez une lame de scalpel pour effectuer une incision superficielle dans la peau, de l'extrémité antérieure à l'extrémité postérieure du crâne. Ensuite, incisez les deux conduits auditifs externes et repliez la peau vers l'avant afin d'exposer tout le crâne.Ensuite, ouvrez le crâne le long de la suture sagittale en déplaçant doucement la lame du scalpel de haut en bas, de l'avant vers l'arrière, afin d'éviter toute compression de la cochlée. Retirez et jetez le museau en effectuant une incision verticale directement en arrière des orbites. La partie postérieure du crâne doit toujours contenir le cerveau et la cochlée.Ensuite, utilisez 4 pincettes pour disséquer par émoussage et éliminer le prosencéphale, le cervelet et le tronc cérébral. Placez les deux moitiés du crâne dans une boîte de Pétri en plastique de 60 millimètres remplie d'HBSS froide. Puis, à l’aide de 4 pincettes, exposez complètement la cochlée, qui est adjacente à l’artère stapédienne environnante, et séparez l’organe par émoussage de l’os temporal.Transférez le cochlée dans une boîte de Pétri en verre de 50 millimètres à fond clair contenant du HBSS et placez la boîte sous le microscope. Placez la boîte de Pétri en plastique de 60 millimètres contenant l'autre moitié du crâne sur de la glace. Ensuite, utilisez 4 pinces pour disséquer soigneusement la capsule otique cochléaire.À présent, utilisez un microcouteau ou deux paires de pinces de force 55 pour séparer délicatement le ligament spiral, adhérent à l'organe de Corti, du reste de la cochlée et du médialis. Cette opération peut être réalisée en saisissant le ligament spiral par sa partie la plus basale et en le déroulant doucement tout en progressant vers l'apex. Une fois le ligament spiral retiré, positionnez l'échantillon de manière à obtenir une vue sagittale longitudinale de la cochlée.Ensuite, couper l'oreille interne en deux ou trois sections à l'aide du microcouteau, en classant ces sections selon les tours apical et basal. Retirer le tissu situé au-dessus pour la pièce la plus apicale et en dessous pour la pièce la plus basale, jusqu'à la couche réelle des cellules ciliées et des neurites, afin que l'explant cochléaire puisse reposer horizontalement dans la boîte de Pétri. Puis, utiliser la pince pour saisir délicatement et détacher la membrane tectoriale, une fine couche translucide située immédiatement au-dessus de l'organe de Corti.L'étape la plus délicate sur le plan technique est probablement le retrait de la membrane téctoriale, mince et translucide, car on peut facilement endommager les cellules ciliées situées en dessous. En commençant par les bords du tissu, les cellules ciliées le long de tout l'explant sont préservées, sauf au niveau du bord même où le décollement de la membrane téctoriale a commencé. Enfin, retirez la membrane de Reissner située juste au-dessus des neurones du ganglion spiral en la pinçant avec une pince de chaque côté et en la décollant.L'échantillon cochléaire est désormais prêt à être mis en culture après avoir retiré les zones endommagées situées aux bords. Commencez la procédure de culture en humidifiant l'extrémité d'une pipette d'un millilitre avec environ 120 microlitres de DMEM afin d'empêcher l'explant d'adhérer à l'intérieur de la pointe. Utilisez ensuite la pointe pré-humidifiée pour prélever au maximum 70 microlitres depuis la boîte de Pétri à fond en verre, puis déposez l'échantillon accompagné du liquide sur l'un des quatre inserts présents dans la boîte de Pétri à quatre puits.Vérifiez au microscope que l’explant est dans l’orientation correcte. Assurez-vous que la zone des cellules ciliées dont la membrane tectoriale a été retirée est orientée vers le haut, et que la membrane basilaire accompagnée de la partie basale réduite du muscle medialis est orientée vers le bas et adhère au fond du lamelle. Si l’échantillon est orienté à l’envers lors de l’inspection, comme illustré ici, ajoutez du HBSS à partir de la pointe de la pipette et repositionnez le fragment jusqu’à ce qu’il soit correctement orienté.Une fois que l'explant est correctement orienté, aspirez l'excès de HBSS, puis attendez 15 secondes. Ensuite, ajoutez 60 microlitres de milieu de culture tiède directement sur l'échantillon, en prenant soin de ne pas toucher l'échantillon avec la pipette. Remettez les couvercles intérieur et extérieur de la boîte de Pétri et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius.Le lendemain, transférez l'explant cochléaire contenant les boîtes de Pétri de l'incubateur vers la hotte à flux laminaire. Aspirez le vieux milieu de culture ne contenant pas de SFB de l'emplacement. Ajoutez 60 microlitres par puits du milieu de traitement préparé et réchauffé.Remettez la boîte de Pétri dans l’incubateur jusqu’à la coloration des cultures, après un maximum de sept jours. Comme le montre cette image confocale, cette technique préserve l’anatomie de toute la spire cochléaire, y compris les neurones du ganglion spiral ou SGN, permettant d’analyser les effets du traitement sur les neurites et les somas des SGN, en plus de l’organe de Corti. Comme illustré ici, ces explants peuvent être utilisés pour comparer simultanément l’effet du traitement sur les spires apicale et basale après coloration immunofluorescente.Les cellules ciliées sont indiquées en vert et les structures neuronales apparaissent en rouge. Les synapses intactes peuvent être évaluées en marquant les protéines pré-synaptiques indiquées en rouge et les protéines post-synaptiques indiquées en vert, conjointement à la coloration des structures neuronales en bleu. Cette figure montre des images représentatives d’explants cochléaires apicaux et basaux après sept jours de culture, avec soit 3 % de FBS à gauche, soit 1 % de FBS à droite.Les cellules incubées dans un milieu contenant 3 % de SFB commencent à migrer entre les jours quatre et cinq, comme l'indiquent les flèches gris clair pour les cellules ciliées et les flèches rouges pour les neurites. Les explants cultivés dans un milieu contenant 1 % de SFB conservent leur intégrité organisationnelle jusqu'au jour sept. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de vérifier visuellement l'intégrité structurelle et l'orientation du tissu cochléaire avant d'ajouter le milieu de culture final et les substances d'intérêt.Après cette procédure, une reconstruction 3D peut être réalisée afin de confirmer la localisation spécifique aux types cellulaires des cellules exprimant la GFP au sein du médialis.

neonatal-murine-cochlear-explant-technique-as-an-vitro-screening-tool

Research

Recherche

JoVE Journal

Medicine

Médecine

Cette procédure décrit une méthode pour l'isolement et la culture de l'organe de Corti murin avec ou sans le limbe en spirale et les neurones du ganglion spiral. Nous démontrons également une méthode pour l'expression d'un gène rapporteur exogènes dans l'organe de Corti explant par électroporation.

Culture primaire et l&#39;électroporation plasmidique de l&#39;Organe de Corti murin.

L'oreille interne de souris est un organe placode dérivé sensorielle dont le développement du programme est élaboré pendant la gestation. Nous définissons...

Transfert de gènes à l&#39;oreille de souris en développement intérieur par<em&gt; In Vivo</em&gt; Électroporation

Imagerie en temps réel de la cochlée des mammifères embryonnaire est difficile parce que les processus de développement de la main fonctionnent sur un gradient temporel de plus de dix jours. Nous présentons ici une méthode pour la culture et l'imagerie des tissus embryonnaires des explants cochléaire pris d'une souris rapporteur fluorescent sur cinq jours.

À long terme Accéléré imagerie de souris cochléaires explants

Nous présentons une méthode qui décrit l’isolement et la culture d’explants cochléaires à partir d’oreilles internes embryonnaires de souris.  Nous démontrons également une méthode de transfert de gènes dans des explants cochléaires par électroporation à ondes carrées. La culture d’explants in vitro couplée à la technique de transfert de gènes permet aux chercheurs d’étudier les effets de la modification de l’expression des gènes au cours du développement.

Culture de souris embryonnaires cochléaires explants et Gene Transfer par électroporation

Diverses méthodes existent pour introduire des agents ototoxiques dans les cochlées de modèles animaux. Il s’agit d’un protocole chirurgical pour l’administration d’agents ototoxiques dans la niche de la fenêtre ronde. La procédure est fiable, crée des lésions intra-cochléaires ciblées et évite les dommages mécaniques à la microarchitecture. L’examen de l’auto-réparation/régénération cochléaire est possible.

L&#39;approche de la souris ronde-fenêtre pour ototoxiques Delivery Agent: Un rapide et fiable Technique d&#39;incitation à Cochlear dégénérescence cellulaire

Dans cette étude, nous décrivons l’approche postérieure canal semicirculaire comme une méthode fiable pour la livraison de gène oreille interne chez les souris néonatales. Nous montrons que la livraison de gène par l’intermédiaire du canal semicirculaire postérieur est capable de perfuse l’ensemble oreille interne.

Approche postérieure Canal semicirculaire pour la livraison de gène oreille interne chez les souris néonatales

Modèles animaux des implants cochléaires peuvent faire avancer les connaissances des bases technologiques de traiter la surdité permanente avec une stimulation électrique. Cette étude présente un protocole chirurgical pour assourdissant aiguë et de l’implantation cochléaire d’un tableau d’électrode dans la souris ainsi que l’évaluation fonctionnelle avec réponse auditif du tronc cérébral.

Implant cochléaire et les enregistrements de réponse électriquement évoqué auditif du tronc cérébral chez les souris C57BL/6

Le poussin est un organisme modèle rentable, accessible et largement disponible pour une variété d’études. Ici, une série de protocoles est détaillée pour comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents au développement et à la régénération de l’oreille interne aviaire.

Méthodes in ovo et ex ovo pour étudier le développement de l’oreille interne aviaire

Les porcs miniatures (mini-porcs) sont un modèle animal idéal pour la recherche sur les implants cochléaires. La chirurgie d’implantation cochléaire chez les mini-porcs peut être utilisée pour fournir des preuves initiales de la sécurité et de la performance potentielle de nouveaux réseaux d’électrodes et d’approches chirurgicales dans un système vivant similaire aux êtres humains.

Le cochon miniature : un grand modèle animal pour la recherche sur les implants cochléaires

Le protocole actuel met à jour les protocoles précédents et intègre des approches relativement simples pour la culture d’explants cochléaires de haute qualité. Cela permet une acquisition de données fiable et une imagerie haute résolution dans les cellules vivantes et fixes. Ce protocole s’inscrit dans la tendance actuelle à l’étude des cellules de l’oreille interne.

Explants cochléaires néonatals entiers comme modèle in vitro

Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’isolement et la culture des cellules ciliées cochléaires primaires de souris. Initialement, l’organe de Corti a été disséqué à partir de cochlées murines néonatales (âgées de 3 à 5 jours) au microscope. Par la suite, les cellules ont été digérées enzymatiquement dans une suspension unicellulaire et identifiées par immunofluorescence après plusieurs jours de culture.

Isolement et culture de cellules ciliées cochléaires primaires de souris néonatales

Découvrez la préparation et la culture d'explants cochléaires murins néonataux pour la recherche auditive. Cette technique permet d'étudier les cellules ciliées et les neurones tout en accélérant le dépistage de composés thérapeutiques.

Technique explosive cochléaire murine néonatale en tant que

Explorer plus de vidéos