L'isolement de la population latérale dans la leucémie lymphoblastique aiguë de cellules T induite par Myc dans le poisson zèbre

L'objectif général de cette procédure est d'isoler les cellules de la population latérale à partir d'un modèle de zebrafish présentant une leucémie aiguë lymphoblastique à cellules T induite par myc. Le test de la population latérale a été utilisé pour identifier des populations de cellules souches et progénitrices dans de nombreux tissus normaux et cancéreux. Toutefois, il n'a pas encore été appliqué à des modèles de cancer chez le zebrafish.

Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet l'isolement prospectif d'une population de cellules dans le T-ALL du zebrafish qui pourrait être enrichie en activité de cellules souches cancéreuses. Bien que la méthode que nous décrivons ici ait des applications étendues dans la recherche sur la leucémie chez le zebrafish, elle pourrait également s'appliquer à d'autres types cellulaires malins et non malins du zebrafish. Les personnes novices dans cette méthode pourraient éprouver des difficultés, car celle-ci est sensible aux variations subtiles.

Bien que la méthode semble simple, une optimisation est nécessaire pour chaque type de cellule testé. Préparez 20 millilitres de FBS inactivé par la chaleur à 10 % dans du PBS 0,9x. Ajoutez un millilitre de la solution FBS/PBS à un flacon contenant un sel de sodium d'héparine doté de 300 unités de l'anticoagulant.

Ensuite, à l’aide d’un microscope épifluorescent, sélectionner les poissons dont les cellules tumorales ont envahi 50 pour cent du corps, ou les poissons identifiés comme ayant des difficultés à manger ou à nager. Euthanasier le poisson en le transférant dans une solution de un à deux milligrammes par millilitre de tricaine dans de l’eau pour poissons. Observer le mouvement des branchies et les battements cardiaques pour confirmer l’euthanasie.

Après avoir retiré la tête du poisson, injecter à l’aide d’une pipette 100 microlitres de solution d’héparine dans sa cavité corporelle afin d’éliminer les globules rouges en excès. Aspirer tout liquide qui s’écoule et le transférer à l’aide d’une pipette dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Ensuite, à l’aide de nouvelles pointes de pipette, rincer la cavité corporelle deux fois supplémentaires, ou jusqu’à ce que le liquide de rinçage ne contienne plus de sang, puis jeter le liquide recueilli lors de tous les rinçages.

Pour recueillir les cellules leucémiques, injecter 100 microlitres de solution FBS/PBS dans la cavité corporelle préalablement lavée. Sous un microscope stéréo, appliquer une pression douce sur le corps du poisson à l’aide d’une pipette pour expulser les cellules tumorales. Recueillir le liquide expulsé dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.

Répétez l'isolement jusqu'à ce que la majorité des cellules tumorales soient récoltées. Rassemblez toutes les cellules dans le même tube microcentrifuge de 1,5 millilitre et conservez la suspension obtenue à température ambiante. Ensuite, mélangez les cellules tumorales isolées en pipetant doucement afin de dissocier les agrégats cellulaires.

Filtrer la suspension cellulaire à travers un filtre tamis de 40 micromètres. Rincer le filtre une à deux fois avec 100 microlitres de FBS/PBS. Une fois filtré, conserver les cellules à température ambiante.

Enfin, dans un nouveau tube, mélanger deux microlitres de la suspension cellulaire avec 18 microlitres de solution stérile de bleu de Trypan à 0,04 pour cent. Déposer 10 microlitres de la suspension obtenue sur une hématocytomètre et dénombrer les cellules tumorales fluorescentes viables. Il est important de recueillir un échantillon pur de cellules de LAL-T.

La concentration de Hoechst 33342 utilisée ici est basée sur le nombre de cellules tumorales vivantes recueillies. Des débris cellulaires supplémentaires ou des cellules non tumorales peuvent interférer avec le test. Avant la coloration des cellules, diluez le colorant Hoechst dans de l’eau exempte de nucléase afin d’obtenir une solution de travail à un milligramme par millilitre.

Conserver la solution préparée recouverte de papier d'aluminium à quatre degrés Celsius. Ensuite, dissoudre 49,1 milligrammes de vérapamil dans un millilitre de DMSO afin d'obtenir une solution inhibitrice de 100 micromolaire. Préparer ensuite l'échantillon en ajoutant du FBS/PBS, 2,5 microlitres de DMSO, 15 microlitres de colorant Hoechst à un milligramme par millilitre et 106 cellules tumorales dans un tube fax, pour un volume final d'un millilitre.

Pour préparer le témoin, ajouter du FBS/PBS, 2,5 microlitres de vérapamil à 100 millions de molaire, 15 microlitres de colorant Hoechst à un milligramme par millilitre, puis ajouter 10 puissance 6 cellules tumorales pour un volume final d'un millilitre. Incuber l'échantillon et le témoin dans un bain-marie à 28 degrés Celsius à l'abri de la lumière pendant 120 minutes. Après l'incubation, placer immédiatement les cellules sur de la glace et les maintenir à l'abri de la lumière.

Centrifuger les cellules à 300 ×g à 4 °C pendant six minutes. Ensuite, éliminer le surnageant et laver les cellules avec 1 mL de FBS/PBS. Centrifuger à nouveau les cellules à 300 ×g à 4 °C pendant six minutes.

Une fois les cellules en pellet, éliminer le surnageant et re-suspendre les cellules dans un millilitre de FBS/PBS. Conserver les échantillons à quatre degrés Celsius jusqu'au tri cellulaire. Quinze minutes avant le tri cellulaire, ajouter deux microlitres de solution mère d'iodure de propidium à un milligramme par millilitre par chaque millilitre de suspension cellulaire.

Ensuite, vortexer soigneusement les échantillons. Analyser les suspensions cellulaires de leucémie lymphoblastique aiguë T chez le poisson zèbre marquées à l’aide d’un trieur cellulaire activé par fluorescence. Exciter les échantillons à l’aide d’un laser UV pour l’analyse du colorant Hoechst et d’un laser de 488 nanomètres pour la détection des cellules de leucémie lymphoblastique aiguë T positives pour l’iodure de propidium ou la GFP.

Le nombre de cellules, la concentration de colorant, la température d'incubation et la durée d'incubation peuvent nécessiter une optimisation pour chaque type cellulaire utilisé. De plus, toute modification de ces paramètres peut modifier considérablement les résultats du test. Pour identifier la population latérale parmi les cellules de LLA-T isolées du poisson-zèbre, on commence par exclure les débris cellulaires et les agrégats cellulaires.

L'absorption d'iodure de propidium et l'expression de la GFP au sein d'une population cellulaire unique sont ensuite analysées afin d'identifier les cellules tumorales vivantes. Pour visualiser la population latérale, les émissions bleue et rouge du colorant Hoechst sont ensuite comparées. La population latérale apparaît comme une traînée faiblement fluorescente de cellules s'étendant depuis le côté gauche de la population cellulaire principale vers l'axe de la fluorescence bleue.

Les résultats présentés ici proviennent d'une analyse de la population latérale réalisée sur deux échantillons différents de cellules tumorales. Une population latérale a été identifiée dans les deux échantillons. Toutefois, les différents échantillons tumoraux contenaient des nombres variables de cellules de la population latérale.

Quel que soit l'échantillon de tumeur analysé, le traitement de l'échantillon avec un inhibiteur de l'efflux tel que le vérapamil a entraîné la disparition du signal observé pour les cellules précédemment identifiées, confirmant ainsi davantage le phénotype de la population latérale. Une fois maîtrisée, la technique de la population latérale sur un T-ALL de poisson zèbre peut être réalisée en moins de quatre heures si elle est effectuée correctement et comme nous l'avons présentée ici. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de se souvenir des étapes qui ont été optimisées pour le T-ALL du poisson zèbre, telles que la température et la durée d'incubation, la concentration du colorant et l'inhibiteur de l'efflux.

Ces paramètres peuvent nécessiter des ajustements selon les systèmes expérimentaux. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que l'isolement d'ARN ou des tests de transplantation in vivo, peuvent être réalisées avec les cellules de la population latérale triées afin d'aborder des questions relatives à la fonctionnalité et à la régulation génique de ces cellules. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler la population latérale de cellules à partir d'une leucémie lymphoblastique aiguë T chez le poisson zèbre.