Délivrance systémique des micro-ARN, à l’aide de Recombinant Adeno-associated Virus sérotype 9 pour traiter des maladies neuromusculaires chez les rongeurs

L’objectif global de cette méthode est de sélectionner et d’administrer un microARN à l’aide d’un vecteur viral adéno-associé recombinant. Ensuite, administrez-le aux muscles squelettiques et aux motoneurones des souris, et pour évaluer leur efficacité à améliorer les phénotypes de la maladie. Cette méthode peut aider à répondre à la question importante de savoir si une stratégie de silençage basée sur les microARN peut être utilisée pour traiter les affections neuromusculaires.

Le principal avantage de cette technique est l’utilisation du virus du sérotype 9 adéno-associé pour délivrer un microARN par circulation systémique à la moelle épinière et au muscle squelettique de souris, afin de réduire directement au silence un gène de la maladie cible. Divisez le stock de plasmides de microARN AAV en aliquotes de 100 à 200 microlitres contenant une charge virale de dix à cent billions de génomes par millilitre. Ensuite, chargez une aliquote dans une seringue et fixez-y une aiguille de calibre 27 à 30.

Maintenant, à l’aide d’un dispositif de contention de souris standard, sécurisez une souris avec sa queue exposée. Ensuite, nettoyez la queue avec de l’alcool à 70 % et placez un tampon chaud sous la queue pendant environ 30 secondes pour augmenter la vasodilatation. Maintenant, au niveau de la partie distale de la queue, insérez l’aiguille dans la veine de la queue avec le biseau vers le haut et à un angle peu profond, environ 15 degrés.

Ensuite, injectez le virus et attendez quelques secondes avant de retirer l’aiguille. Après avoir retiré l’aiguille, appliquez une pression modérée à l’aide de deux doigts pour arrêter tout saignement. Ensuite, retournez l’animal dans sa cage d’origine.

Lors de l’injection dans la veine caudale, il n’est pas rare de voir un éclair de sang dans le moyeu de l’aiguille. Lors de l’injection, il ne doit y avoir aucune résistance. Si la queue commence à blanchir et à gonfler, retirez l’aiguille et essayez à nouveau à proximité de l’emplacement d’entrée précédent.

Pour ces tests, les souris doivent être âgées de plus de quatre semaines et s’assurer de recueillir une mesure de base avant le traitement. La salle d’examen doit être calme et sombre, sans perturbations. Amenez les souris dans la pièce au moins 30 minutes avant d’effectuer des tests.

Ne dérangez pas les animaux pendant cette période d’acclimatation. Commencez par le test du fil de suspension. Prenez la souris par sa queue et placez-la au centre de la grille métallique.

Ensuite, soulevez la grille de 15 à 20 pouces et inversez lentement l’écran pour donner à la souris le temps d’ajuster sa prise. Une fois la grille complètement inversée, démarrez le chronomètre et enregistrez le temps de chute. Laissez la souris s’accrocher pendant 60 secondes, si elle tombe plus tôt, puis remettez-la sur la grille et répétez la procédure.

Si la souris reste bloquée pendant 60 secondes, enregistrez 60 secondes pour le score et remettez la souris dans sa cage. Attendez que chaque souris effectue trois essais pendant 60 secondes. Sinon, marquez le temps de suspension le plus long.

Après l’euthanasie de la souris, prélevez la moelle épinière, puis le muscle squelettique du quadriceps. Pour congeler les tissus récoltés, remplissez à moitié un bol en acier inoxydable de 2-méthylbutane et immergez le quart inférieur du bol dans de l’azote liquide. Attendez deux minutes avant de continuer.

Après quelques minutes, transférez l’échantillon dans le 2-méthylbutane. Lorsque l’échantillon devient blanc, transférez-le immédiatement dans un récipient noyé dans de la glace sèche. Plus tard, conservez l’échantillon à 80 degrés Celsius.

Pour l’analyse biochimique et la quantification des microARN, placez le tissu récolté dans un flacon cryogénique et congelez-le dans de l’azote liquide. Ensuite, conservez-le à 80 degrés Celsius. À l’âge de cinq semaines, des souris SBMA ont reçu une injection de cent billions de génomes d’AAV microR-298.

Les souris SBMA portent le transgène du récepteur des androgènes humains avec un tractus polyglutamine anormalement expansé. À dix semaines, ils développent normalement des signes de maladie neuromusculaire. La moelle épinière lombaire et le muscle quadriceps ont été prélevés à plusieurs moments après le traitement pour analyse.

La RT-PCR quantitative a montré que l’expression du micro-R298 atteignait un pic dans le muscle squelettique après huit semaines, et que l’expression atteignait un pic dans la moelle épinière à 12 semaines. Dix semaines après l’injection, la GFP a été détectée dans les deux tissus. Et l’expression de la GFP co-localisée avec le marqueur du motoneurone, la choline acétyltransférase.

Dans une expérience de suivi, des souris ont reçu au hasard une injection du virus, ou véhicule, à l’âge de sept semaines, puis ont été pesées et testées comportementalement chaque semaine, jusqu’à l’âge de 40 semaines. Dix semaines après l’injection, les souris traitées ont commencé à prendre du poids et à montrer une amélioration des performances motrices. La PCR quantitative en temps réel a révélé que le traitement réduisait les niveaux de transcription AR dans les tissus affectés.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’administrer un microARN à l’aide d’un vecteur viral adéno-associé recombinant par injection vain de queue. Et comment effectuer des tests comportementaux qui peuvent aider à évaluer l’efficacité du microARN délivré dans l’amélioration de l’atrophie et de la faiblesse des membres inférieurs chez la souris. L’implication de cette technique s’étend aux approches de thérapie génique, car une thérapie génique sûre et efficace nécessite un transfert spécifique de tissus ciblés du transgène thérapeutique.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons réalisé que les maladies causées par des mécanismes de gain de fonction toxiques, tels que SBMA, bénéficieraient d’une surexpression de microARN naturels ciblant spécifiquement la réparation à trois premiers objectifs de la transcription de la maladie.