Name: Transfert de la capacité de formation des glandes mammaires entre les cellules épithéliales basales mammaires et les cellules luminesnelles mammaires par des vésicules extracellulaires / des exosomes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Découvrez l'isolation des vésicules extracellulaires et exosomes des cellules épithéliales mammaires mésenchymateuses. Cette méthode permet de transférer les propriétés de cellules souches aux cellules luminales non souches.

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Ce travail a été soutenu par des subventions des Instituts nationaux de recherche en santé (05A1-CSPP16-014, HJL) et du Ministère de la science et de la technologie (MOST 103-2320-B-400-015-MY3, HJL).

Toutes les recherches impliquant des animaux ont respecté les protocoles approuvés par le Comité institutionnel sur les soins des animaux. 1. Isolation et validation de la vésicule extracellulaire / exosome <ol><li> Cellules basales épithéliales mammaires de culture, NAMEC 4 , avec un milieu frais exempt de sérum de 500 ml de MCDB 170, pH 7,4 + 500 ml de DMEM / F12 avec du bicarbonate de sodium (0,2438%); EGF (5 ng / mL); Hydrocoritisone (0,5 μg / mL); Insuline (5 μg / mL); Extrait d&#39;hypophyse bovine (BPE; 35 μg / mL); Et GW627368X (1 μg / mL) dans des plats de 15 cm. </li><li> Après avoir compté les cellules avec un hémocytomètre, semmez 1,2 x 10 6 cellules dans 12 ml de milieu par plat de 15 cm le jour 0 pendant 4 jours 4 . </li><li> Après 4 jours de culture, centrifuger le milieu de culture à 300 xg pendant 5 minutes en utilisant une centrifugeuse à table. Transférer le surnageant dans un tube conique ( Figure 1 ). </li><li> Centrifuger le surnageantÀ 2 000 xg pendant 20 min dans une centrifugeuse à table. Transférer le surnageant dans un tube à ultracentrifugation et laisser les cellules mortes et les débris cellulaires ( Figure 1 ). </li><li> Centrifuger le surnageant à 10 000 xg pendant 30 min à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un nouveau tube ultracentrifugeuse ( Figure 1 ). </li><li> Centrifuger le surnageant à 110 000 xg pendant 60 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre en suspension le granulat EV / exosome dans PBS ( Figure 1 ). </li><li> Centrifuger le surnageant à 110 000 xg pendant 60 min à 4 ° C. Retirer le surnageant. Remettre en suspension la granulés EV / exosome dans PBS ( Figure 1 ). Remettre en suspension la pastille isolée de 240-480 ml de milieu conditionné NAMEC dans 100 μL. </li><li> Mesurer la concentration en protéines de la suspension EV avec l&#39;analyse des protéines BCA. Assurez-vous que la concentration est d&#39;environ 20 à 40 μg / 100 μL. Conserver à -20 ° C pourAnalyse approfondie. </li><li> Mesurer la concentration et la taille des EV / exosomes par analyse de suivi des nanoparticules (NTA), comme décrit précédemment par Gardiner et al. 11 . Diluer les EV / exosomes (20 μg / 100 μL) avec PBS à 10 000 fois pour l&#39;analyse NTA. NOTE: Le résultat de l&#39;analyse NTA reflète le nombre et la taille des vésicules analysées. </li><li> Image des EV / exosomes avec microscopie électronique de transmission (TEM), comme décrit précédemment par Lin et al 4 . </li></ol> 2. Purification d&#39;exosome à l&#39;aide d&#39;un gradient de densité <ol><li> Remettre en suspension la pastille de 110 000 g de l&#39;étape 1.7 dans de l&#39;iodixanol à 40% (p / v) dans du PBS (2 ml). Superposer le mélange en séquence avec des aliquotes d&#39;iodixanol à 30%, 20%, 10% et 5% (p / v) dans du PBS (2 ml chacun) pour former un gradient de densité dans un tube à ultracentrifugation. </li><li> Centrifuger le mélange à 200 000 xg pendant 8 h à 4 ° C. </li><li> Recueillir chaque fraction de gradient (10 fractiOns; 1 ml / fraction) avec une pipette du haut du tube. </li><li> Analyser la présence de marqueurs d&#39;exosome ( p. Ex., CD81, CD9, CD63 et Tsg101) dans chaque fraction par SDS-PAGE 12 et Western blot. Charger 50 -LL de suspensions de chaque fraction sur un gel à 10% contenant 0,1% (p / v) de SDS et séparer les protéines en fractions par électrophorèse sur gel. </li><li> Transférer les protéines d&#39;un gel à une membrane de PVDF et incuber la membrane avec des anticorps contre les marqueurs d&#39;exosome ( p. Ex., CD81, CD9, CD63 et Tsg101) et la protéine GAPDH pendant la nuit ( Tableau des matériaux ) à 4 ° C. REMARQUE: le résultat identifie la fraction contenant des exosomes. </li></ol> 3. Étiquetage extracellulaire de la vésicule / exosome <ol><li> Suspendre les EV / exosomes, obtenus à l&#39;étape 1.7, dans 10 μM d&#39;ester de diacétate de succinimidyle de carboxyfluorescéine (CFSE) à 20 μg de protéine exosomale / 100 μL. Préparer un échantillon parallèle coNe réduisant que le CFSE et le PBS, traités de la même manière, comme un témoin négatif pour les tests d&#39;absorption EV / exosome ultérieurs. Laisser les mélanges à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> Suspendre les EV / exosomes dans 50x volume de PBS et centrifuger la suspension à 110 000 xg pendant 60 minutes à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre à nouveau le culot EV / exosome dans du PBS. Répétez l&#39;étape 3.2 une fois. </li><li> Suspendre les EV / exosomes dans le PBS à une concentration de 20 μg de protéine exosomale / 100 μL, puis filtrer les EV / exosomes à travers des membranes de 0,22 μm avant d&#39;ajouter les EV / exosomes aux cellules. </li></ol> 4. Essai extracellulaire de la vésicule / exosome <ol><li> Pour fabriquer un milieu de culture, mélanger 500 ml de MCDB 170, pH 7,4 + 500 ml de DMEM / F12 avec du bicarbonate de sodium (0,2438%); EGF (5 ng / mL); Hydrocoritisone (0,5 μg / mL); Insuline (5 μg / mL); Et BPE (35 μg / mL) 4 . Placer les cellules HMLE épithéliales mammaires humaines dans des plats à 6 puits (1 x 10 6 &lt;/ Sup&gt; cellules / puits) un jour avant le traitement EV / exosome. Ajouter des EV / exosome marqués par fluorescence CFSE de 2 μg / mL, obtenus à l&#39;étape 3.3, au milieu de culture des cellules HMLE pendant 2 à 6 h. Traiter les cellules HMLE du groupe de contrôle négatif avec la préparation parallèle, décrite à l&#39;étape 3.1. </li><li> Après l&#39;incubation de 2 à 6 heures, laver les cellules deux fois avec 4 ml de PBS à température ambiante. </li><li> Détachez les cellules avec 0,25% de trypsine pendant 10 min et ré-suspendez les cellules dans du PBS contenant 0,2% de FBS. Mesurer l&#39;absorption EV / exosome de l&#39;intensité de fluorescence dans les cellules en utilisant un analyseur de cellules de fluorescence 4 . Image des cellules traitées avec EVs / exosomes ou le contrôle négatif à l&#39;aide de microscopie confocale. NOTE: La fluorescence verte dans les cellules est causée par l&#39;absorption EV / exosome. Voir la légende de la figure 6 pour les paramètres du microscope. </li></ol> 5. Isolation des cellules épithéliales mammaires de la souris primaire <ol><lI&gt; Préparez des plats enduits de gélatine en ajoutant 12 ml de solution de gélatine à 0,1% à des plats de 10 cm. Placer les plaques dans un incubateur à 37 ° C pendant 30 min. Retirez la solution de gélatine et laissez les couvercles hors de la vaisselle dans un capot d&#39;écoulement laminaire pendant 4 h jusqu&#39;à ce que le revêtement de gélatine soit séché. </li><li> Dissectionnez les glandes mammaires numéro 2, 3, 4 et 5 ( Figure 2 ) à partir de souris C57BL / 6 vierges femelles de 12 semaines utilisant des ciseaux et coupez les glandes en petits morceaux (2 mm 2 ) à l&#39;aide d&#39;un rasoir. </li><li> Dissociez encore davantage la suspension de glandes mammaires (à partir de 10 souris) pendant 60 minutes à 37 ° C, une agitation de 120 tr / min avec 50 ml de DMEM / F12 contenant 0,2% de collagénase de type IV, 0,2% de trypsine, 5% de FBS, 5 μg / ml de gentamycine , Et 1x streptocoque. </li><li> Pellet en descendant les organoïdes épithéliaux du mélange par centrifugation à 350 xg pendant 10 min. </li><li> Suspendre les organoïdes épithéliaux dans 4 mL de DMEM / F12 avec 0,1 mg / mL d&#39;ADNase I pendant 5 minutes à température ambiante. Ajouter 6 mL de DMEM / F12 à une finaleVolume de 10 ml. </li><li> Centrifuger la suspension à 400 xg pendant 10 min à température ambiante et jeter le surnageant. </li><li> Remettre en suspension la pastille dans 10 mL de DMEM / F12. Centrifugez la suspension mais frappez le frein lorsque la vitesse atteint 400 x g. Jeter le surnageant. REMARQUE: En frappant le frein, les organoïdes épithéliaux sont rapidement massés en pellets, tandis que les fibroblastes, en tant que cellules individuelles, restent encore sur le surnageant. </li><li> Répétez l&#39;étape 5.6 et 5.7 5-7 fois. Ajouter une goutte de suspension à un hémocytomètre, puis vérifier le dégagement des fibroblastes du mélange organoïde sous microscopie après chaque cycle de centrifugation ( Figure 3 ). </li><li> Placer les organoïdes dans le plat revêtu de gélatine, obtenu à l&#39;étape 5.1, pendant 48 h avec DMEM / F12 contenant 1x ITS, 5% de FBS, 50 μg / ml de gentamycine, 10 ng / mL d&#39;EGF et 1x stylo-streptococèses. </li><li> Après 48 h, retirer les cellules flottantes dans la culture en remplaçant le milieu par un milieu de culture frais sans FBS (DMEM / F12 contenant 1x ITS, 50 μg / ml de gentamycine, 10 ng / mL EGF et 1x stylo-streptococèses). </li><li> Confirmez qu&#39;une monocouche de cellules épithéliales mammaires migre et se développe à partir des organoïdes épithéliaux attachés en 3 jours. </li></ol> 6. Séparation des cellules épithéliales mammaires basales / luminescales primaires <ol><li> Après la culture de 3 jours, détachez les cellules mammaires primaires de souris avec un mélange enzymatique naturel avec une activité enzymatique protéolytique et collagénolytique pendant 20 min. Neutraliser l&#39;activité enzymatique avec 5% de FBS dans du PBS. </li><li> Centrifuger la suspension à 450 xg pendant 10 min à température ambiante et jeter le surnageant. Remettre en suspension le culot cellulaire dans une solution à 5 mg / ml pendant 20 min. Neutraliser l&#39;activité enzymatique avec 5% de FBS dans du PBS. </li><li> Centrifuger la suspension à 450 xg pendant 10 min à température ambiante et jeter le surnageant. </li><li> Remis en suspension les cellules dans 100 ul de PBS avec 0,2% de FBS à une concentration de 10 7 cellules / mL avec le diluantAnticorps anti-CD49f et anti-EpCAM sur de la glace pendant 1 h dans l&#39;obscurité. </li><li> Lavez les cellules avec du PBS puis incupez les cellules avec un anticorps secondaire conjugué au fluorophore sur de la glace pendant 30 minutes dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver et ré-suspendre les cellules dans du PBS avec 0,2% de FBS. </li><li> Trier les cellules épithéliales mammaires EpCAM hi / CD49f lo luminal sur un trieur de cellules 4 . </li></ol> 7. Traitement extracellulaire de la vésicule / exosome <ol><li> Graisser les cellules epitheliales mammaires EpCAM hi / CD49f lo luminal triées de l&#39;étape 6.7 sur des boîtes à 6 puits revêtues de gélatine (2 x 10 5 cellules / puits) puis les traiter avec du PBS ou des EV / exosomes dérivés de NAMEC de 2 μg / mL Obtenu à l&#39;étape 1.7. </li><li> Pour assurer l&#39;efficacité biologique des EV / exosomes dans le traitement de culture à long terme, remplacer le milieu de culture cellulaire par un milieu frais contenant du PBS ou des EV / exosomes dérivés de NAMEC à 2 μg / mL tous les deux jours. Ne divisez pas la souris primaPendant les 10 jours de traitement. </li></ol> 8. Injection par graisse des cellules épithéliales mammaires <ol><li> Anesthésier une souris C57BL / 6 femelle de 3 semaines avec de l&#39;isofluorane à 2-3% d&#39;inhalation. </li><li> Placez la souris anesthésiée sur son dos. Retirez la fourrure sur le milieu de l&#39;abdomen avec un rasoir / crème capillaire et nettoyez le site chirurgical avec trois cycles alternatifs de 70% d&#39;alcool et de povidone-iode. </li><li> Faire une incision verticale de 1,5 cm à travers la peau le long de la région thoracique-inguinale ventrale avec des ciseaux et ensuite exposer alternativement les 4ème capsules de graisse mammaire droite et gauche. </li><li> Effacez chaque coussinet gras en éliminant le parenchyme des glandes avec des ciseaux. Localisez le ganglion lymphatique dans le tampon gras, puis retirez le parenchyme de la glande entière au-dessous du ganglion lymphatique. REMARQUE: les deux tiers de la graisse devraient rester en place. </li><li> Détachez les cellules obtenues à partir de l&#39;étape 7.2 avec un mélange enzymatique naturel (voir le tableau des matériaux ) avec une protéolytique aNd activité enzymatique collagénolytique pendant 10 min. Neutraliser l&#39;activité enzymatique avec 5% de FBS dans du PBS. </li><li> Centrifuger la suspension à 450 xg pendant 10 min à température ambiante et jeter le surnageant. Compter les cellules avec un hémocytomètre et suspendre les cellules dans du PBS à une concentration telle que 15 μL contient la dose cellulaire souhaitée (10 4 -10 2 cell / pad). </li><li> Injecter 15 μL de suspension de cellules épithéliales mammaires dans un tampon gras en utilisant une seringue en verre de 100 μl attachée à une aiguille 27G. </li><li> Répétez les étapes 8.4-8.7 pour le tampon gras de l&#39;autre côté. </li><li> Fermez la peau avec des clips enroulés. </li></ol> 9. Mammale Gland Whole Mount <ol><li> Euthanaser la souris avec une dislocation cervicale CO 2 plus 8 semaines après l&#39;injection cellulaire (étape 8.7). </li><li> Faire une incision verticale à travers la couche de peau de la région thoracique à la région inguinale à l&#39;aide de ciseaux, puis exposer les deux à droite et à gauche 4 mCoussinets gras gras. Enlevez les 4 th glandes mammaires ( Figure 2 ). </li><li> Posez les coussinets gras sur les lames de microscope en verre et fixez les coussinets gras avec le fixateur de Kahle (4% de formaldéhyde, 30% d&#39;EtOH et 2% d&#39;acide acétique glacial) à température ambiante pendant une nuit. Attention: le fixateur de Kahle est un irritant. Effectuez cette étape dans un capot chimique. </li><li> Laver les tampons gras dans 250 ml d&#39;EtOH à 70% pendant 15 minutes puis dans 250 ml de dH 2 O pendant 5 min. Tachez les tampons gras avec de l&#39;alun de carmin (1 g de carmin et 2,5 g de sulfate de potassium d&#39;aluminium dans 500 ml de dH2O) à température ambiante pendant une nuit. </li><li> Laver les tampons gras avec 250 ml d&#39;EtOH à 70% pendant 15 min, 250 ml d&#39;EtOH à 95% pendant 15 minutes et 250 ml d&#39;EtOH à 100% pendant 15 min. </li><li> Nettoyez les tampons gras dans le xylène pendant des jours et arrête l&#39;incubation au xylène lorsque les graisses se transforment. Attention: le xylène est un irritant. Effectuez cette étape dans un capot chimique. </li><li> Monter les diapositives avecÈme support de montage et prenez des images (2,400 ppp) des blocs de graisse à l&#39;aide d&#39;un scanner à glissière numérique. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Les exosomes portent souvent des caractéristiques des cellules qui les libèrent, et la quantité d&#39;exosomes libérés peut être induite par des stimuli 4 . Le milieu de culture des cellules peut être collecté et soumis à une ultracentrifugation différentielle pour la collecte EV / exosome ( figure 1 ). Il n&#39;existe actuellement aucun accord général sur une méthode idéale pour isoler EV / exosomes. La méthode optimale utilisée ici a été déterminée par l&#39;applic...

Les exosomes peuvent méditer la communication cellulaire en transférant des protéines membranaires et cytosoliques, des lipides et des ARN entre les cellules 1 . La communication à médiation exosome a été démontrée comme impliquant de nombreux processus physiologiques et pathologiques ( ex: présentation de l&#39;antigène, développement de la tolérance 2 et progression de la tumeur 3 ). Les exosomes ont souvent des contenus similaires à ceux des cellules sources qui les libèrent. Ainsi, les exosomes peuvent transporter des propriétés cellulaires spécifiques des cellules sources et transférer ces propriétés aux cellules qui les ingestion 4 . Les exosomes sont des vésicules membranaires à double couche de 50 à 150 nm et présentent des marqueurs spécifiques ( p. Ex., CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix et TSG101). Ainsi, les exosomes doivent être caractérisés par diverses méthodes pour différents aspects. La microscopie électronique à transmission peut être utilisée pour visualiser les vésicules membranairesTels que les exosomes 4 , 5 . L&#39;analyse de suivi des nanoparticules (NTA) et l&#39;analyse dynamique de la diffusion de la lumière (DLS) sont utilisées pour mesurer la taille et le nombre d&#39;exosomes purifiés 4 . La teneur en membrane lipidique des exosomes peut être vérifiée par gradient de densité. Les marqueurs exosomaux, tels que CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix et TSG101 6 , 7 , peuvent être mesurés par Western Blot. Les cellules basales mammaires ont la capacité de générer des glandes mammaires lorsqu&#39;elles sont implantées dans des tampons à graisse, tandis que les cellules luminaires ne peuvent pas 8 , 9 , 10 . Ainsi, les cellules basales mammaires sont également appelées unités reproductrices mammaires. En utilisant le modèle de cellules mammaires basales et luminales, on peut examiner la capacité des EV / exosomes à transférer les caractéristiques cellulaires entre différentes populations cellulaires. Ce travailDémontre la méthode de transfert de la capacité de formation de glande des cellules épithéliales basales mammaires aux cellules épithéliales luminescales mammaires en utilisant EVs / exosomes dérivés de cellules épithéliales basales mammaires. Les cellules épithéliales mammaires luminal ont acquis des propriétés basales après l&#39;ingestion d&#39;EV / exosomes sécrétés à partir de cellules basales et peuvent alors former des glandes mammaires 4 .

<table><tbody><tr><td>MCDB 170&nbsp ;</td><td>USBiological</td><td>M2162</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo</td><td>1250062</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100K ultracentrifugeuse</td><td>Beckman</td><td>393253</td><td></td></tr><tr><td>SW28 Ti Rotor</td><td>Beckman</td><td>342204</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Rotor</td><td>Beckman</td><td>331306</td><td></td></tr><tr><td>NANOSIGHT LM10</td><td>Malvern</td><td>NANOSIGHT LM10</td><td>pour l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA)</td></tr><tr><td>Optiprep² ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>Solution à 60 % (p/v) d’iodixanol dans l’eau (stérile).</td></tr><tr><td>Anticorps CD81</td><td>GeneTex</td><td>GTX101766</td><td>1:1 000 dans du lait écrémé en poudre à 5 % p/v, 1x TBS, 0,1 % Tween 20 à 4 &deg ; C, pendant la nuit&nbsp ;</td></tr><tr><td>Anticorps CD9</td><td>GeneTex</td><td>GTX100912</td><td>1:1 000 dans du lait écrémé en poudre à 5 % p/v, 1 x TBS, 0,1 % Tween 20 à 4 &deg ; C, pendant la nuit&nbsp ;</td></tr><tr><td>Anticorps CD63</td><td>Abcam</td><td>Ab59479</td><td>1:1 000 dans du lait écrémé en poudre à 5 % p/v, 1x TBS, 0,1 % Tween 20 à 4 &deg ; C, pendant la nuit&nbsp ;</td></tr><tr><td>Anticorps TSG101</td><td>GeneTex</td><td>GTX118736</td><td>1:1 000 dans du lait écrémé en poudre à 5 % p/v, 1x TBS, 0,1 % Tween 20 à 4 &deg ; C, pendant la nuit&nbsp ;</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>GeneTex</td><td>GTX100118</td><td>1:6 000 dans du lait écrémé en poudre à 5 % p/v, 1x TBS, 0,1 % Tween 20 à 4 &deg ; C, pendant la nuit&nbsp ;</td></tr><tr><td>CFSE (carboxyfluorescéine succinimidyl diacétate ester)</td><td>Thermo</td><td>V12883</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>analyseur de cellules à fluorescence</td></tr><tr><td>collagénase Type IV&nbsp ;</td><td>Thermo</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>trypsine</td><td>Thermo</td><td>27250018</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; ITS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3146</td><td>un mélange d’insuline humaine recombinante, de transferrine humaine et de sélénite</td></tr><tr><td>accutase</td> de sodium <td>ebioscience</td><td>00-4555-56</td><td>un mélange d’enzymes naturelles avec une activité enzymatique protéolytique et collagénolytique</td></tr><tr><td>dispase&nbsp ;</td><td>STEMCELL</td><td>7913</td><td>5 mg/mL = 5 U/mL</td></tr><tr><td>d’anticorps anti-CD49f</td><td>Biolegend</td><td>313611</td><td>1:50</td></tr><tr><td>d’anticorps anti-EpCAM</td><td>Biolegend</td><td>118213</td><td>1:200</td></tr><tr><td>FACSAria</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>trieur de cellules</td></tr><tr><td>carmin alun</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1022</td><td></td></tr><tr><td>cellules épithéliales mammaires humaines (cellules HMLE, NAMECs)</td><td></td><td></td><td>cadeaux du Dr Robert Weinberg</td></tr><tr><td>permount</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>bicarbonate de sodium</td><td>Zymeset&nbsp ;</td><td>BSB101</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-015</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocoritisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-H0888</td><td></td></tr><tr><td>Insuline&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-I9278</td><td></td></tr><tr><td>BPE (extrait hypophysaire bovin)</td><td>Hammod Cell Tech&nbsp ;</td><td>1078-NZ</td><td></td></tr><tr><td>GW627368X&nbsp ;</td>Plat <td>de culture 10009162</td><td></td> <td>Caïman</td></tr><tr><td>15 cm</td><td>Falcon&nbsp ;</td><td></td><td></td>353025</tr><tr><td>centrifugeuse de table</td><td>Eppendrof&nbsp ;</td><td>Centrifugeuse 3415R</td><td></td></tr><tr><td>tube ultracentrifuge</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>PBS (solution saline tamponnée au phosphate)&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>BCA Dosage des protéines</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>23228</td><td></td></tr><tr><td>Microscopie électronique à transmission</td><td>Hitachi</td><td>HT7700</td><td></td></tr><tr><td>gélatine&nbsp ;</td><td>STEMCELL</td><td>7903</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture 10 cm</td><td>Falcon&nbsp ;</td><td></td><td></td>353003</tr><tr><td>boîte de culture à 6 puits</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>femelle C57BL/6 souris</td><td>NLAC (National Laboratory Animal Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Bovin Serum)</td><td>BioWest&nbsp ;</td><td>S01520</td><td></td></tr><tr><td>gentamycine</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>15710072</tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>5PRIMER</td><td>2500120</td><td></td></tr><tr><td>isofluorane&nbsp ;</td><td>Halocarbure</td><td>NPC12164-002-25</td><td></td></tr><tr><td>formaldéhyde</td><td>MACRON</td><td>H121-08</td><td></td></tr><tr><td>EtOH (éthanol)</td><td>J.T. Baker</td><td>800605</td><td></td></tr><tr><td>acide acétique glacial</td><td>Panreac</td><td>131008.1611</td><td></td></tr><tr><td>sulfate</td><td>d’aluminium et de potassium Sigma-Aldrich</td><td>12625</td><td></td></tr><tr><td>Xylène&nbsp ;</td><td>Leica</td><td>3803665</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu ; m membranes</td><td>Merck Millipore</td><td>Millex-GP</td><td></td></tr><tr><td>AUTOCLIP Clips de plaie, 9 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>AUTOCLIP Applicateur de clip de plaie</td><td>BD Biosciences</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>CellMask&trade ; Rouge profond</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>Coloration de la membrane plasmique</td> <td>C10046</td></tr></tbody></table>

transfert de la capacité de formation des glandes mammaires entre les cellules épithéliales basales mammaires et les cellules luminesnelles mammaires par des vésicules extracellulaires / des exosomes

Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

Les cellules peuvent communiquer via des exosomes, des vésicules extracellulaires de 100 nm (EV) qui contiennent des protéines, des lipides et des acides nucléiques. Les vésicules extracellulaires dérivées des cellules épithéliales mammaires non adhérentes / mésenchymateuses (NAMEC) peuvent être isolées à partir du milieu NAMEC par ultracentrifugation différentielle. Sur la base de leur densité, les EV peuvent être purifiés par ultracentrifugation à 110 000 x g. La préparation EV de l&#39;ultracentrifugation peut être séparée davantage en utilisant un gradient de densité continue pour éviter la contamination par des protéines solubles. Les EV purifiés peuvent ensuite être évalués à l&#39;aide d&#39;une analyse de suivi des nanoparticules, qui mesure la taille et le nombre de vésicules dans la préparation. Les vésicules extracellulaires d&#39;une taille allant de 50 à 150 nm sont des exosomes. Les EV / exosomes dérivés de NAMEC peuvent être ingérés par des cellules épithéliales mammaires, qui peuvent être mesurées par cytométrie de flux et microscopie confocale. Certaines propriétés de cellules souches mammaires ( p. Ex., Capacité de formation de glandes mammaires) peuventÊtre transféré des NAMEC de type tige aux cellules épithéliales mammaires via les EV / exosomes dérivés de NAMEC. Les cellules épithéliales mammaires primaires primaires isolées EpCAM hi / CD49f lo luminal ne peuvent pas former de glandes mammaires après avoir été transplantées dans des tampons à graisse de souris, tandis que les cellules épithéliales mammaires basiques EpCAM lo / CD49f hi forment des glandes mammaires après une transplantation. L&#39;absorption des EV / exosomes dérivés de NAMEC par les cellules epitheliales mammaires EpCAM hi / CD49f lo luminal leur permet de générer des glandes mammaires après avoir été transplanté dans des graisses. Les EV / exosomes dérivés de cellules épithéliales mammaires de type tige transfèrent la capacité de formation de glandes mammaires aux cellules epitheliales mammaires EpCAM hi / CD49f lo luminal.

Comme il a été démontré que le blocage de la signalisation de PGE 2 / EP 4 déclenche la libération d&#39;EV / exosome à partir de cellules souches basales de type mammaire 4 , ce travail présente une méthode pour isoler les EV / exosomes induits de la culture de cellules basales épithéliales mammaires (NAMEC). Étant donné que les NAMEC sont cultivés dans un milieu exempt de sérum, il n&#39;existe pas d&#39;EVs / exosomes préexistants dérivés ...

Ce protocole décrit des méthodes pour purifier, quantifier et caractériser les vésicules extracellulaires (EV) / les exosomes provenant de cellules épithéliales mammaires non adhérentes / mésenchymateuses et pour les utiliser pour transférer la capacité de formation de glandes mammaires aux cellules épithéliales mammaires luminescentes. Les EV / exosomes dérivés de cellules épithéliales mammaires de type tige peuvent transférer cette propriété cellulaire vers des cellules qui ingerent les EV / exosomes.

Transfert de la capacité de formation des glandes mammaires entre les cellules épithéliales basales mammaires et les cellules luminesnelles mammaires par des vésicules extracellulaires / des exosomes

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

Les objectifs généraux de cette procédure sont d'isoler les vésicules extracellulaires et les exosomes transférant les propriétés de cellules souches à partir de cellules souches, et d'évaluer la capacité de transfert de « souche » de ces nanoparticules. Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles dans le domaine des cellules souches concernant la transmission, par des cellules ou des vésicules, des propriétés dérivées des cellules souches.Ou les exosomes peuvent transférer la propriété de cellule souche à une cellule non souche. Le principal avantage de cette technique est que la cellule souche induite provient d'une vésicule intracellulaire. Et les exosomes peuvent être utilisés pour reprogrammer directement une cellule non souche en cellule souche.Le chercheur postal LeMonsier, assisté par Pei-Ling, Wen-Tin et Shih-Yin, tous membres de mon laboratoire, démontrera la procédure. Commencez par semer 1,2 × 10⁶ cellules épithéliales mammaires non adhérentes/mésenchymateuses, ou NAMECs, dans 12 millilitres de milieu par boîte de 15 centimètres, pour une culture de quatre jours dans une incubateur de culture cellulaire. Au jour quatre, récoltez le milieu de culture pour une centrifugation à plateau tournant.Ensuite, transférez le surnageant dans un tube conique pour une deuxième centrifugation sur centrifugeuse de table. Puis, transférez le surnageant dans une nouvelle ultracentrifugeuse et effectuez une ultracentrifugation pendant 30 minutes. À la fin de la rotation, transférez le surnageant dans un nouveau tube d'ultracentrifugation et ultracentrifugez à nouveau le surnageant.Éliminer le surnageant et resuspendre le culot d'exosomes de vésicules extracellulaires dans du PBS pour une troisième ultracentrifugation. Ensuite, resuspendre le culot dans du PBS frais et ultracentrifuger les particules cellulaires une dernière fois. Éliminer le surnageant et resuspendre le culot de vésicules extracellulaires exosomes dans 100 microlitres de PBS.Ensuite, mesurer la concentration en protéines de la suspension de vésicules extracellulaires par dosage à l'acide bicinchoninique. La concentration devrait être d'environ 20 à 40 microgrammes par 100 microlitres. Pour mesurer la concentration et la taille des vésicules extracellulaires et des exosomes, diluer les particules cellulaires à deux microgrammes de protéine par 100 millilitres de PBS.Et analyser les particules par analyse de suivi de nanoparticules. Pour purifier les exosomes par gradient de densité, après la troisième ultracentrifugation, resuspendre le culot dans deux millilitres de solution à 40 % d’iodixanol dans du PBS. Puis recouvrir la suspension cellulaire de volumes séquentiels de deux millilitres de solutions à 30 %, 20 %, 10 % et 5 % d’iodixanol.Séparer la fraction cellulaire par ultracentrifugation en gradient de densité en utilisant une pipette pour récolter chacune des dix couches du gradient à la fin de la centrifugation. Ensuite, analyser la présence de marqueurs d'exosomes dans chaque fraction par électrophorèse SDS-PAGE et immunotransfert selon les protocoles standard, en utilisant des anticorps dirigés contre les marqueurs d'exosomes appropriés d'intérêt.Pour traiter les cellules épithéliales mammaires avec les vésicules extracellulaires et les exosomes, commencez par ensemencer deux fois dix puissance cinq cellules épithéliales mammaires luminaires Epcam hi-CD49f low triées par cytométrie de flux par plaque dans des plaques à six puits revêtues de gélatine. Ensuite, traitez chaque culture cellulaire avec deux microgrammes par millilitre de vésicules extracellulaires et d'exosomes dérivés de NAMEC. Remplacez le milieu de culture par des vésicules extracellulaires et des exosomes frais tous les deux jours pendant dix jours.À la fin de la période de traitement, placer une souris femelle C57BL6 âgée de trois semaines et anesthésiée en position dorsale, puis raser le pelage de l’abdomen médian. Désinfecter le site chirurgical à l’aide de trois cycles alternés d’alcool à 70 pour cent et de povidone-iode. Réaliser ensuite une incision verticale de un point cinq centimètre de longueur à travers la peau, le long de la région thoracique ventrale jusqu’à l’aine.Exposer alternativement les quatrièmes bourrelets graisseux mammaires droits et gauches. Localiser le ganglion lymphatique dans chaque bourrelet graisseux et retirer entièrement la glande périanhélale située sous le ganglion lymphatique. Ensuite, utiliser une enzyme naturelle possédant une activité prodialytique et cologénolytique afin de détacher les vésicules extracellulaires et les cellules épithéliales mammaires luminales traitées par des exosomes.Neutraliser l'activité enzymatique avec 5 % de FCS dans le PBS après dix minutes. Recueillir les cellules par centrifugation et éliminer le surnageant. Après numération, diluer les cellules à une concentration de un fois dix à la puissance deux à un fois dix à la puissance quatre cellules par 15 microlitres de PBS.Et utilisez une seringue en verre de 100 microlitres équipée d'une aiguille de calibre 27 pour injecter 15 microlitres de la suspension de cellules épithéliales mammaires dans chaque bourrelet adipeux. Ensuite, fermez la peau à l'aide de clips chirurgicaux. Huit semaines après l'injection, pratiquez une incision verticale à travers la peau, depuis la région thoracique jusqu'à la région inguinale, et exposez les deux bourrelets adipeux mammaires quatrièmes, droit et gauche.Retirer la quatrième glande mammaire et étaler les bourrelets adipeux sur des lames de microscope en verre individuelles. Ensuite, transférer les lames dans une hotte chimique et fixer les bourrelets avec des fixateurs collies pendant une nuit à température ambiante. Le lendemain matin, laver les échantillons dans 250 millilitres d'éthanol à 70 pour cent pendant 15 minutes.Suivi par 250 millilitres d'eau distillée pendant cinq minutes. Après le lavage à l'eau distillée, colorer les bourrelets graisseux au carmin alumine pendant une nuit à température ambiante. Suivi par une déshydratation par incubations successives dans de l'éthanol de concentration croissante de 15 minutes chacune.Après la dernière déshydratation, transférez les échantillons dans du zylène sous une hotte chimique jusqu'à ce que les bourgeons adipeux deviennent transparents. Ensuite, montez les lames avec un milieu de montage et utilisez un scanner numérique de lames pour acquérir des images des bourgeons adipeux à 2 400 points par pouce. La taille des vésicules isolées et du plateau d'ultracentrifugation est généralement d'environ 100 nanomètres, mesurée par analyse de suivi de nanoparticules.En outre, l'analyse par microscopie électronique en transmission de fractions ultracentrifugées du milieu conditionné de NAMEC révèle la présence de vésicules membranaires abondantes. Après séparation par gradient de densité comme vient de l'être démontré, les marqueurs d'exosomes peuvent être détectés dans la fraction à 20 % d'iodixanol. L'analyse cytométrique en flux de cellules épithéliales mammaires humaines du compartiment luminal traitées avec des vésicules extracellulaires et des exosomes d'origine namic marqués au CFSE révèle un signal CFSE dix fois plus élevé dans les cultures traitées aux exosomes.Indiquant la prise en charge spécifique des vésicules extracellulaires et des exosomes marqués au CFSE par les cellules épithéliales mammaires. Par ailleurs, alors que le contrôle négatif, les cellules épithéliales mammaires traitées au PBS, n'exhibent pas de signal CFSE, des preuves de la prise en charge des vésicules extracellulaires et des exosomes d'origine namic par les cellules traitées aux exosomes peuvent également être observées par microscopie confocale. Notamment, les bourgeons graisseux de souris injectées avec des cellules épithéliales mammaires luminales epCAMhi/CD49Flo triées par cytométrie en flux et traitées avec des vésicules extracellulaires et des exosomes d'origine NAMEC pendant dix jours ont acquis la capacité de former des glandes mammaires.Après son développement, cette technologie a ouvert la voie à nos chercheurs dans le domaine de la biologie des cellules souches. Pour explorer l'utilisation des cellules trans et des vésicules et exosomes dérivés de cellules souches en médecine régénérative et en reprogrammation cellulaire directe.

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Recherche

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Transfert de la capacité de formation des glandes mammaires entre les cellules épithéliales basales mammaires et les cellules luminesnelles mammaires par des vésicules extracellulaires / des exosomes (Vidéo) | JoVE Journal

Transfert de la capacité de formation des glandes mammaires entre les cellules épithéliales basales mammaires et les cellules luminesnelles mammaires par des vésicules extracellulaires / des exosomes

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