Name: La technique du fractionneur optique pour estimer les nombres de cellules dans un modèle de rat de thérapie électroconvulsive (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Découvrez la technique du fractionneur optique pour quantifier la neurogenèse dans l'hippocampe de rat après stimulation électroconvulsive. Cette méthode stéréologique fournit des estimations précises et sans biais des populations cellulaires.

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Nous remercions Susanne Sørensen pour l&#39;assistance technique habile. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation Velux; La fondation Jascha; Fondation Aase et Ejnar Danielsens; Hartmann Brothers Foundation; Directeur Jacob Madsen et Fondation Olga Madsens; Docteur Sofus Carl Emil Friis et femme Doris Friis &#39;Trust; La fondation de 1870; Fondation Torben et Alice Frimodts et Fondation pour la recherche neurologique. L&#39;édition de manuscrit a été effectuée par Inglewood Biomedical Editing.

Toutes les procédures animales ont été effectuées conformément aux directives de l&#39;Inspection danoise de l&#39;expérimentation animale et approuvées par le comité local d&#39;éthique pour les animaux expérimentaux. 1. Traitement des tissus NOTE: Après perfusion transcardiale et post fixation dans 4% de paraformaldéhyde (PFA) dilué dans du tampon phosphate 0,2 M pendant une nuit à 4 ° C, les cerveaux sont transférés à 30% de saccharose dans une solution salée tamponnée au phosphate (PBS) pendant trois jours à 4 ° C. Par la suite, les cerveaux sont congelés sur de la glace sèche en poudre et conservés à -80 ° C jusqu&#39;à la section. <ol><li> Séparez les hémisphères droit et gauche le long de la ligne médiane du cerveau en utilisant un scalpel, puis choisissez un ou l&#39;autre hémisphère au hasard dans le premier cerveau, puis décale systématiquement entre l&#39;hémisphère droit et l&#39;hémisphère gauche ( figure 1A ). Monter l&#39;hémisphère échantillonné sur un disque d&#39;échantillon avec l&#39;axe long perpendiculaire au disqueEn utilisant un support de montage. </li><li> Placez les conteneurs multidiseurs numérotés pour pré-refroidissement dans le cryostat. </li><li> Montez le disque dans le cryostat et coupez l&#39;intégralité de l&#39;hippocampe (Bregma 1,80 à - 7,04 16 ) dans des sections de 80 μm d&#39;épaisseur dans le plan coronal ( Figure 1B ). <ol><li> Placez toutes les sections échantillonnées consécutivement dans les récipients multidis refroidis, afin de s&#39;assurer que les sections sont maintenues en coupe. </li><li> Couvrez complètement les sections avec cryoprotecteur et maintenez les récipients à -20 ° C jusqu&#39;à l&#39;utilisation ultérieure. </li></ol></li></ol> 2. Immunomarquage REMARQUE: Pour suivre les sections individuelles tout au long de la procédure de coloration, placez les sections échantillonnées dans des filets de coloration à 25 puits. Utilisez chaque 5 e section, en donnant un nombre final moyen de 12 (8-16) sections par hippocampe pour l&#39;immunocoloration et le comptage de cellules ultérieur. <ol><li>Avant le sous-échantillonnage de chaque nième section avec un démarrage aléatoire entre la section 1 et la section n ( Figure 1C ), transférez les conteneurs de -20 ° C à la température ambiante (RT). </li><li> Utilisez par exemple un pinceau, pour transférer les sections dans l&#39;ordre numérique vers les filets de coloration à 25 puits placés dans des boîtes de Petri remplies de PBS. REMARQUE: à partir de ce point, conservez les sections dans les filets de coloration qui sont placés dans des assiettes en verre assorties sur un agitateur orbital (section 2.3 à 2.9). </li><li> Transférer les filets de coloration aux plats de verre correspondants et laver les sections deux fois pendant 10 minutes dans du PBS à TA avant incubation dans du peroxyde d&#39;hydrogène à 3% (H 2 O 2 ) dilué dans de l&#39;eau distillée (dH 2 O) pendant 20 minutes. </li><li> Transférer les sections à trois solutions différentes d&#39;acide chlorhydrique (HCl) (1 M à 0 ° C pendant 10 min, 2 M à la RT pendant 10 min et 2 M à 37 ° C pendant 20 min) avant neutralisation dans du tétraborate de sodium 0,1 M uneT RT pendant 20 min. </li><li> Après 3 x 10 minutes d&#39;incubation dans du Triton X-100 à 1% dilué dans du PBS (tampon de lavage), transférer les sections dans un tampon de lavage contenant 10% de sérum bovin fœtal (solution bloquant) pendant 1 heure à la RT. </li><li> Incuber les sections pendant 48 h à 4 ° C dans une solution de blocage diluée à la souris anti-BrdU diluée à 1: 100. </li><li> Laver les sections 3 x 10 min dans un tampon de lavage et incuber pendant 48 h dans de la peroxydase de raifort raide dilué 1:10 dans un tampon de lavage. </li><li> Transférer les sections en PBS pendant 5 × 10 min, puis pendant 7 minutes dans 0,01% de diaminobenzidine (DAB) diluée dans du PBS avant qu&#39;elles ne soient transférées dans une solution DAB similaire contenant 0,02% de H 2 O 2 pendant 10 minutes à la RT. </li><li> Compléter une série de lavages (2 × 10 min dans PBS et 2 × 10 min dans un tampon phosphate sans chlorure de sodium ajouté) et monter les sections en ordre numérique sur des lames de microscope. </li><li> Séchez les sections pendant environ 30 minutes avant le contre-colorant avec du crésyleviolet. </li><li> Placez les lames du microscope dans une crémaillère. </li><li> Réhydratez les sections pendant 10 min dans des boîtes de coloration par glissement contenant de la dH 2 O, puis transférez les diapositives à 0,02% de violette de crêle dans du dH 2 O pendant 15 min. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.12 avant que les sections ne soient déshydratées trois fois dans de l&#39;éthanol (96% pendant 5 min et 99% pendant 2 × 2 min). </li><li> Placez les sections en xylène pendant 2 × 15 min et glissez les glissières à l&#39;aide d&#39;un milieu de séchage rapide pour le montage. </li><li> Enfin, laissez les glissières glissées pendant environ 24 h avant qu&#39;elles puissent être utilisées pour la microscopie. </li></ol> 3. Estimation du nombre total de neurones marqués par BrdU en utilisant le fractionneur optique NOTE: Effectuer une étude pilote comprenant quelques animaux pour déterminer les paramètres d&#39;échantillonnage optimaux, tels que le nombre de sections à analyser et le nombre de disecteurs optiques dans les sections échantillonnées. Ce pilote fournit également unCV préliminaire (écart type / moyenne) et la possibilité d&#39;ajuster la CE (voir la section 3.9.3) pour obtenir une précision satisfaisante des estimations déterminées par l&#39;enquêteur (pour plus de détails, voir ci-dessous). De même, effectuez une analyse de distribution z pour traiter les points suivants: rétrécissement du tissu, qualité de la coloration dans la section et répartition des cellules dans l&#39;axe z 14 . <ol><li> Vérifiez l&#39;épaisseur du tissu dans les sections pour confirmer qu&#39;ils sont adaptés à l&#39;utilisation du fractionneur optique, par exemple, il est assez épais pour la hauteur du capteur choisie, y compris les zones de protection (voir ci-dessous). NOTE: L&#39;épaisseur du tissu est une mesure dans plusieurs endroits dans la région d&#39;intérêt. <ol><li> Placez les diapositives sur la phase motorisée du microscope et allumez le logiciel stéréologique préféré. </li><li> Déterminez la zone d&#39;intérêt en utilisant un objectif de faible grossissement (2X ou 4X) avant de passer à un 100X huile-immErsion objective (voir figure 2A ). </li><li> À l&#39;aide d&#39;un point spécifique d&#39;un cadre de comptage ( p. Ex. Au niveau ou à côté d&#39;un coin), localisez le haut de la section en vous déplaçant le long du plan focal jusqu&#39;à ce que certaines fonctions de la section apparaissent en mise au point. Enregistrez cette position z en 0 (voir la figure 2B ). </li><li> Déplacez le plan focal vers le bas à travers le tissu jusqu&#39;à ce que le même point spécifique du cadre de comptage soit au dernier niveau z de tissu en mise au point et marquez cette position. L&#39;épaisseur locale du tissu est définie de 0 à ce point final et peut être lue sur l&#39;axe z. Enregistrez l&#39;épaisseur du tissu (voir Figure 2B ). </li></ol></li><li> Documenter la pénétration complète de la tache et la répartition des cellules dans l&#39;épaisseur totale de la section. NOTE: La distribution des neurones marqués par BrdU sert de guide pour déterminer les zones de garde requises. Bien qu&#39;une distribution uniforme des cellules soit critique, elleEst acceptable d&#39;observer moins de cellules près du haut et du bas de la section, ce qui indique l&#39;effet des capuchons perdus (pour plus de détails, voir Dorph-Petersen et al., 2009). <ol><li> Énumérer les neurones marqués par BrdU et enregistrer leur position z avec l&#39;épaisseur de la section locale mesurée dans l&#39;angle sélectionné de chaque cadre de comptage. </li><li> Tracer le nombre de neurones BrdU positifs en fonction de leur position z. </li></ol></li><li> Fixer la hauteur des zones de protection et de protection en fonction de l&#39;épaisseur moyenne de la section et de la répartition des cellules (voir 3.1 et 3.2). REMARQUE: la hauteur du disector doit être inférieure à l&#39;épaisseur de la section pour éviter les artefacts proches des surfaces. Ce risque est contourné en incluant des zones de garde en haut et en bas de la section. </li><li> Déterminez la longueur d&#39;étape entre les disecteurs. <ol><li> Déterminez la région d&#39;intérêt sur toutes les sections à analyser et enregistrez les zones. </li><li> Additionnez ces zones, puis divisez bY le nombre de disecteurs à placer dans cette zone. NOTE: Selon l&#39;expérience précédente, un bon point de départ implique 75 sondes. Cela fournira une approximation de la zone et des positions d&#39;échantillonnage correspondantes (une étape ) (pour plus de détails, voir West, 2012). </li><li> Prenez la racine carrée d&#39;une étape , qui fournira la taille xy-step. </li></ol></li><li> Déterminez la taille du cadre de comptage. <ol><li> Définissez la taille du cadre de comptage sur une unité arbitraire et effectuez un échantillonnage pilote de neurones BrdU positifs en utilisant les paramètres obtenus aux sections 3.3 et 3.4. REMARQUE: la taille doit être déterminée de manière empirique par essai et erreur, mais il est recommandé de l&#39;ajuster pour permettre l&#39;échantillonnage de 2 à 3 cellules par disector 8 . </li></ol></li><li> À la suite de cette étape finale de l&#39;étude pilote, commencer l&#39;échantillonnage cellulaire. NOTE: Les paramètres d&#39;échantillonnage obtenus devraient donner lieu à des chiffres d&#39;environ 150-200 cellules iN chaque animal qui est suffisant pour obtenir un design stéréologique efficace 8 . </li><li> Comptez les neurones BrdU-positifs en utilisant un objectif d&#39;immersion à l&#39;huile 100 × et un grossissement final de 2000-3000 ×. Dans chaque désecteur optique, identifiez les neurones marqués par BrdU qui sont clairement reconnus par la caractéristique d&#39;intérêt (dans la présente étude, le critère est celui où se situe le bord d&#39;attaque du neurone marqué par BrdU pour la première fois) Dans le cadre de comptage ou touchez les lignes d&#39;inclusion ( Figure 2B ). Ne comptez pas les neurones positifs pour BrdU qui, lorsqu&#39;ils sont clairement reconnus par la caractéristique d&#39;intérêt à l&#39;intérieur de la hauteur du conducteur, touchent les lignes d&#39;exclusion. Il est essentiel de suivre scrupuleusement ces règles de comptage tout au long de la totalité de la quantification stéréologique. NOTE: Au fur et à mesure que BrdU incorpore dans toutes les cellules séparatrices, la morphologie est utilisée pour distinguer les neurones et les autres types de cellules. NeuLes caractéristiques RON sont un noyau clairement défini avec un cytoplasme neutre et un nucléolus sombre. Les cellules positives à BrdU sont reconnues comme des neurones nouvellement formés en fonction de leur taille relativement plus grande par rapport aux cellules gliales. Il convient de mentionner que dans les études de prolifération à court terme (par exemple &lt;24 h), la double coloration utilisant des marqueurs neuronaux immatures peut être une condition préalable 17 . </li><li> Estimez le nombre total de neurones BrdU positifs dans chaque cerveau en multipliant le nombre total de cellules comptées (Σ Q - ) avec les fractions d&#39;échantillonnage réciproques: <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55737/55737eq1.jpg" /> pour <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55737/55737eq2.jpg" /> où <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55737/55737eq3.jpg" /> Q- est l&#39;épaisseur moyenne de la section pondérée en nombre, h est la hauteur du disector, étant donné que la fraction d&#39;échantillonnage de la zone, ssf est la section sLa fraction d&#39;amplification et t i est l&#39;épaisseur de la section dans la ième zone de comptage avec un nombre de cellules de <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55737/55737eq4.jpg" /> Dans le désisteur 14 , 18 . </li><li> Calculer le coefficient d&#39;erreur (CE) 8 qui est la variance d&#39;échantillonnage des neurones BrdU positifs dans un échantillonnage systématiquement aléatoire uniforme (SURS). <ol><li> Tout d&#39;abord, calculer le bruit , qui est égal au nombre total de neurones BrdU-positifs comptés: <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55737/55737eq5.jpg" /></li><li> Ensuite, calculez la variance dans SURS: NOTE: Nous avons jugé la superficie et le nombre de cellules dans l&#39;hippocampe pour changer en douceur d&#39;une section à l&#39;autre et par conséquent utilisé &quot;classe de lissage&quot; m = 1 (1/240) 8 , 19 <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55737/55737eq6.jpg" /> où <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55737/55737eq7.jpg" /> <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55737/55737eq8.jpg" /> <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55737/55737eq9.jpg" /> P i est le nombre de points comptés pour l&#39;objet dans la ième section et n est le nombre de sections 4 , 20 . </li><li> Enfin, calculez le CE de l&#39;estimation: REMARQUE: En général, une précision optimale est généralement obtenue lorsque la valeur CE est inférieure à la moitié du CV observé, comme OCV 2 = ICV 2 + CE 2 , où OCV est le CV observé et ICV est le CV 4 inhérent. <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55737/55737eq10.jpg" /></li></ol></li></ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55737/55737fig1.jpg" /> FFigure 1: Illustration schématique montrant le traitement des tissus selon les principes du fractionneur utilisés dans la présente étude. Après l&#39;expérimentation, les hémisphères sont séparés et l&#39;hémisphère droit ou gauche est choisi systématiquement et aléatoirement (A). Le cerveau complet s&#39;étendant sur tout l&#39;hippocampe est coupé en sections coronales de 80 μm d&#39;épaisseur (B), après quoi chaque 5ème section est sous-échantillonnée, commençant de façon aléatoire entre les sections 1 à 5, pour l&#39;immunocoloration finale et la quantification stéréologique (C). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55737/55737fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55737/55737fig2.jpg" /> Figure 2: Illustration montrant la procédure d&#39;échantillonnage stéréologique à l&#39;aide de disecteurs optiques. (A) Après traitement histologique, le hIppocampal GCL / SGZ a été délimité et les disecteurs optiques appliqués de manière uniforme et aléatoire sur la région. (B) Dans les disecteurs optiques (à gauche), les neurones BrdU-positifs ont été comptés seulement si leur caractéristique d&#39;intérêt était clairement reconnue dans la hauteur du conducteur et située à l&#39;intérieur du cadre de comptage ou en touchant la ligne d&#39;inclusion (à droite). Les neurones touchant la ligne d&#39;exclusion n&#39;ont pas été comptés. Barres d&#39;échelle = 10 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55737/55737fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont pas d&#39;intérêts financiers concurrents.

En utilisant ECS comme une méthodologie pour induire la neurogénèse, on trouve une augmentation immédiate de 260% dans la formation de nouveaux neurones BrdU positives dans l&#39;hippocampe. Dans ce bassin de neurones générés de façon aiguë, nous avons trouvé 40% d&#39;attrition du 1er au trois mois, avec près de 50% des neurones nouvellement formés survivent au moins 12 mois après le traitement 10 , 11 . Le comptage des neurones marqués par BrdU a suivi un schéma d&#39;échantillonnage strict, dans lequel l&#39;ensemble de l&#39;hippocampe a été coupé dans des sections de 80 μm d&#39;épaisseur suivies d&#39;un sous-échantillonnage de chaque 5ème section avec un départ d&#39;échantillonnage aléatoire entre la section un et la section cinq. La fourniture de ces sections est choisie d&#39;une manière aléatoire systématique, ceci est manifestement une excellente méthode pour réduire la variance du résultat final, sans comptage exhaustif 1 . Ce schéma d&#39;échantillonnage nous a permis de compter les neurones BrdU-positifs en moyenne de 12 (8-16) hippocampAl dans chaque cerveau de rat, avec une précision finale de 9 à 11%. Lors de l&#39;utilisation de la méthode du fractionneur, il est essentiel de connaître la fraction de la hauteur de section dans laquelle le comptage est effectué, car le retrait et la déformation des tissus se produisent fréquemment lors du traitement histologique 14 . En effet, nous avons constaté un important retrait de l&#39;épaisseur dans cette étude. En outre, il convient de noter que le retrait différentiel du tissu peut se produire, tel que présenté dans Dorph-Petersen et al. 2001. Cependant, tant que la structure d&#39;intérêt complète est disponible pour l&#39;analyse, ces limitations n&#39;entraînent pas une polarisation du nombre total de particules, c&#39;est -à- dire des neurones positifs pour BrdU. Dans les études où le retrait des tissus est un problème particulier, il faut toujours dire que les résultats sont obtenus dans des tissus déformés. Dans cette étude, nous avons compté une hauteur de 10 μm. Les sections de la présente étude avaient une épaisseur moyenne finale de 26 μm, un 5 μmZone de protection en haut et une zone de protection de 11 μm (moyenne) au bas de la section. Ces paramètres sont acceptables car les zones de protection devraient être approximativement du diamètre des particules échantillonnées. Après la délimitation de la GCL / SGZ, les disecteurs ont été répartis de manière uniforme au hasard dans la zone délimitée. Les disecteurs doivent être positionnés avec une longueur d&#39;étape fixe qui optimise l&#39;échantillonnage et le comptage pour obtenir des estimations efficacement avec une précision déterminée par l&#39;enquêteur. La précision optimale est habituellement atteinte en comptant jusqu&#39;à 150-200 cellules dans chaque structure d&#39;intérêt 5 . Dans la présente étude, nous avons compté un moyen de 133 (gamme 33-372) de neurones BrdU positives dans chaque hippocampe de rat. En raison d&#39;un faible nombre de cellules chez certains des animaux de contrôle, nos comptages de neurones BrdU positifs sont tombés en dessous du nombre généralement acceptable de cellules nécessaires pour obtenir une précision appropriée, ce qui a entraîné des valeurs CE relativement élevées pour ces cas. HCependant, comme nous avons obtenu des valeurs CE de moins de la moitié des valeurs CV (voir la section de résultats représentatifs), l&#39;échantillonnage et le comptage supplémentaires n&#39;étaient pas nécessaires. Les valeurs CV élevées montrent que la plus grande contribution à la variation observée provient de la variation biologique. En effet, nous pourrions affirmer que le nombre moyen de neurones BrdU positifs dans la présente étude était plus élevé que nécessaire. Par exemple, dans un groupe de rats, nous avons atteint une valeur CE de 9% et avons observé une valeur CV de 43%. Dans ce cas particulier, nous aurions pu viser une précision d&#39;environ 20%. En résumé, la précision du nombre total de neurones BrdU positifs dans la présente étude est suffisante en ce sens qu&#39;elle capture des effets de traitement réels sur le nombre réel de particules. En raison de la variation biologique assez importante dans certains groupes d&#39;animaux, les mêmes estimations auraient pu être obtenues avec une précision acceptable, en dépit de moins de dépenses d&#39;effort. Les écarts biologiques élevés au sein des groupes ne peuvent queÊtre compensé par l&#39;augmentation du nombre d&#39;animaux. On pourrait soutenir que l&#39;étalon-or pour l&#39;obtention de nombres de cellules exactes implique un comptage exhaustif de tous les objets d&#39;intérêt. Cependant, dans la plupart des études du cerveau, ce n&#39;est pas une possibilité en raison du grand nombre de cellules. Bien que beaucoup plus efficace que le comptage exhaustif des cellules, le fractionneur optionnel prend beaucoup de temps par rapport au dépistage simple des différences dans le nombre de cellules, ce qui est préférable si le nombre précis de cellules n&#39;est pas essentiel. Notre expérience montre que des différences de plus de 20 à 30% peuvent être détectées uniquement par des procédures de dépistage. Si elle est effectuée correctement, l&#39;échantillonnage utilisant une stéréologie basée sur le design fournit des estimations impartiales et précises de manière efficace 1 . La propriété impartiale de la stéréologie produit des estimations qui, lorsqu&#39;elles sont répliquées, s&#39;approchent de la vraie population, et améliorent la reproductibilité de laEstimation 21 . Dans un premier temps, un échantillon représentatif de l&#39;ensemble de la structure d&#39;intérêt (dans cette étude, GCL / SGZ hippocampique) doit être obtenu, ce qui permet d&#39;estimer dans un sous-ensemble statistiquement valide des sections 4 . Pour obtenir un nombre approprié de sections et de sondes de comptage, nous appliquons SURS, ce qui réduit la variance par rapport à l&#39;échantillonnage aléatoire 8 . En outre, SURS garantit que les particules d&#39;intérêt dans la structure sont échantillonnées avec les mêmes probabilités, indépendamment de leur taille, leur forme, leur orientation et leur répartition dans la structure. En tant que telle, la stéréologie doit être fortement recommandée lorsque l&#39;on obtient des estimations précises et impartiales est un aspect central du projet.

La quantification des cellules dans une structure tridimensionnelle (3-D) peut nécessiter l&#39;obtention d&#39;estimations basées sur des principes impartiaux. Même aujourd&#39;hui, les études utilisent fréquemment des méthodes bidimensionnelles (2-D) pour signaler les données des structures 3-D. Cependant, ces méthodes ne considèrent pas la nature hétérogène de la structure en termes de forme et de distribution des cellules, ce qui entraîne des limites méthodiques; Ils font des hypothèses au sujet de la structure d&#39;intérêt 3-D et les résultats ne font pas référence à la structure complète. Ces limitations réduisent la sensibilité et la précision des méthodes et augmentent le risque d&#39;erreurs 1 . Le biais dans le comptage des cellules peut être évité par l&#39;application de la stéréologie basée sur le design, qui est d&#39;une importance générale pour obtenir des informations quantitatives sur le nombre de cellules dans un tissu ou une structure donné. Alors que la stéréologie était autrefois une méthode très longue, les progrès dans les procédures, les doucesWare et l&#39;imagerie, l&#39;a rendu plus efficace et largement applicable. La stéréologie implique des principes d&#39;échantillonnage statistique et une théorie géométrique stochastique pour fournir des outils efficaces pour l&#39;estimation du volume, de la surface, de la longueur et du nombre d&#39;objets dans une structure 3-D par échantillonnage dans les sections 2 -D 2 . Ainsi, la stéréologie permet d&#39;obtenir des données quantitatives impartiales sur les changements structurels dans les sections de tissus, ce qui donne des estimations moyennes du nombre réel, sans analyse exhaustive 1 . La stéréologie est définie comme l&#39;inférence statistique des paramètres géométriques à partir des informations échantillonnées. Cela peut être réalisé par un échantillonnage impartial, c&#39;est-à-dire un échantillonnage aléatoire systématique, des sections ainsi que des règles de comptage qui garantissent que tous les objets ont des probabilités égales d&#39;être comptés 3 . Bien que les résultats stéréologiques puissent avoir des degrés de précision différents, comme indiqué par le coefficient d&#39;erreur (CE), cela peut être une publicitéEn fonction de la variance biologique inhérente (coefficient de variance (CV)) en ajustant la quantité d&#39;échantillonnage requise 4 , 5 . Quelques études stéréologiques antérieures ont examiné les effets à court terme de la stimulation électroconvulsive (ECS) sur la plasticité de l&#39;hippocampe chez les rongeurs 6,7 . Les données de ces études montrent une augmentation initiale du nombre total de neurones ainsi qu&#39;une différenciation synaptique élevée suite à une ECS répétée. Cependant, ces études n&#39;examinent pas directement la neurogénèse, car elles n&#39;utilisent pas de marqueurs spécifiques pour la prolifération cellulaire. Nous présentons ici une application d&#39;une méthode stéréologique, la technique du fractionneur optique 8 , 9 , pour quantifier le nombre total de neurones nouvellement formés dans la couche de cellules granulaires d&#39;hippocampe de rat (GCL), y compris la zone sous-granulaire (SGZ) Comme leur long termeUrvival 10 , 11 . Nous avons soumis les rats à un calendrier clinique pertinent de ECS (trois fois par semaine pendant 3 semaines), qui est l&#39;un des stimulants les plus puissants de la neurogénèse 12 . Les animaux de contrôle ont été traités en utilisant la même procédure, mais sans passage de courant. Sur chacun des 21 jours d&#39;expérimentation, tous les rats ont été injectés par voie intrapéritonéale avec 5-bromo-2&#39;-désoxyuridine (BrdU) qui incorpore dans l&#39;ADN à la place de la thymidine pendant la division cellulaire 13 . Après l&#39;expérimentation, les rats ont été maintenus pendant quatre périodes différentes (24 heures, 3 mois, 6 mois et 12 mois). En utilisant le principe du fractionneur, nous avons obtenu une fraction connue de l&#39;hippocampe à l&#39;aide d&#39;un échantillonnage aléatoire uniforme des sections et des disques optiques appliqués (sondes 3-D) aux sections de tissu épais échantillonnées et immunostained. Il est particulièrement remarqué que les sections congelées s&#39;effondrent habituellement dans l&#39;axe z pendant le processusIng, et que les disques optiques basés sur l&#39;épaisseur moyenne pondérée en nombre de la section devraient être utilisés dans ce cas particulier 14 . Comme le plan focal des disecteurs optiques a été déplacé une distance connue vers le bas à travers la section, les neurones BrdU-positifs ont été comptés quand leur caractéristique d&#39;intérêt était clairement reconnue. Dans le domaine de la stéréologie, il y a un certain débat sur le nombre total de particules qui doivent être comptées 15 ; Typiquement 150-200 neurones sont comptés dans la structure d&#39;intérêt pour obtenir une précision adéquate, c&#39;est -à- dire un coefficient de 7-8% 8 . Les comptes neuronaux positifs pour BrdU ont été complétés en utilisant un logiciel stéréologique avec imagerie par un microscope standard équipé d&#39;une caméra et les objectifs suivants: 2X, 4X et 10X, ainsi qu&#39;un objectif 100X d&#39;immersion en huile (ouverture numérique = 1.40) et un étage motorisé . Les mouvements dans la direction z ont été mesurés avec un microcateur numérique. Le grossissement finalÉtait 3000X.

<table><tbody><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5'-bromo-2'deoxyuridine - BrdU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19-160</td><td></td></tr><tr><td>Cresyl Violet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042</td><td>Contient les matériaux suivants pour 1 L : 0,2 g de violet de crésyle ; 2,0 g d’acétate de sodium, 3 H2O ; 3 ml d’acide acétique glacial ; 1000 ml d’eau distillée</td></tr><tr><td>Cryoprotecteur</td> Capital <td>Region Pharmacy, DK</td><td>861334</td><td>Contient les matériaux suivants : saccharose ; polyvinylpyrrolidon PVP 40 ; phosphate de sodiumtampon (0,2 m) ; &nbsp ; éthylèneglycol ; Déminéralisée.</td></tr><tr><td>dH2O</td><td>Pharmacie de la région de la capitale, DK</td><td>817205</td><td></td></tr><tr><td>Diaminobenzidine &ndash ; DAB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td></td></tr><tr><td>Envision-HRP</td><td>DAKO</td><td>K4001</td><td>Polymère marqué à la peroxydase conjugué à des immunoglobulines anti-souris de chèvre</td></tr><tr><td>Éthanol - 70 %</td><td>Plum A/S</td><td>201098</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol - 96 %</td><td>Plum A/S</td><td>201104</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol - 99,9 %</td><td>Plum A/S</td><td>201111</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal de bovin</td><td>In vitro</td><td>BI-04-003-1A</td><td></td></tr><tr><td>H2O2 30 %</td><td>Capital Region Pharmacy, DK</td><td>896456</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>J. T. Baker</td><td>6081</td><td></td></tr><tr><td>Medium de montage</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>Tissue Tek</td></tr><tr><td>Mouse-anti-BrdU</td><td>Becton-Dickinson</td><td>347580</td><td></td></tr><tr><td>PBS buffer</td><td>Capital Region Pharmacy, DK</td><td>853436</td><td>pH = 7,4</td></tr><tr><td>PFA</td><td>VWR</td><td>28,794,295</td><td>pH = 7,4</td></tr><tr><td>Tampon phosphate&nbsp ;</td><td>Pharmacie de la région de la capitale, DK</td><td>866533</td><td>0,1 mol/l, pH 7,4</td></tr><tr><td>Milieu de montage à séchage rapide</td><td>Histolab Products AB</td><td>801</td><td></td></tr><tr><td>Pertex Sodium Tetraborate</td><td>Merck A/S</td><td>1 063 080 500</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Merck A/S</td><td>1 076 515 000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck A/S</td><td>1 086 031 000</td><td></td></tr><tr><td>Xylène</td><td>VWR</td><td>28 973 363</td><td></td></tr><tr><td><Nom>fort</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr>Cover <tr><td>slips</td><td>Menzel-Gl&auml ; ser</td><td>24x50 mm #0</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>&nbsp ; CM1860</td><td></td></tr><tr><td>Microcator numérique</td><td>Heidenhain</td><td>VRZ 401</td><td></td></tr><tr><td>Plats en verre</td><td>Brain Resaerch Laboratories</td><td>1256</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>Appareil photo microscope</td><td>Olympus</td><td>DP72</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td>SuperFrost+</td></tr><tr><td>Platine motorisée</td><td>Prior</td><td>H101A</td><td></td></tr><tr><td>Conteneurs multi-paraboliques</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6315-1CS</td><td>&nbsp ; Nuclon 12 puits</td></tr><tr><td>Logiciel New-Cast</td><td>Visiopharm</td><td>ver. 4.5.6.440</td><td></td></tr><tr><td>Objectif 2x</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan UW 2X</td><td></td></tr><tr><td>Objectif 4x</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Fluor 4X</td><td></td></tr><tr><td>Objectif 10x</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Fluor 10X</td><td></td></tr><tr><td>Objectif 100x immersion dans l’huile</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo Lambda DM 100X Huile</td><td>Ouverture numérique 1.40</td></tr><tr><td>Agitateur orbital</td><td>Gemini BV</td><td>CM-9</td><td>Sarstedt</td></tr><tr><td>Rack à lames</td><td>Sakura</td><td>4465</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de coloration de lames</td><td>Sakura</td><td>4457</td><td>Tissue-Tek</td></tr><tr><td>Disque à échantillons</td><td>Leica</td><td>14037008637</td><td></td></tr><tr><td>Filets de coloration</td><td>Brain Research Laboratories</td><td>2512</td><td>25 puits</td></tr></tbody></table>

la technique du fractionneur optique pour estimer les nombres de cellules dans un modèle de rat de thérapie électroconvulsive

The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy

Les méthodes stéréologiques sont conçues pour décrire les paramètres quantitatifs sans faire d&#39;hypothèses concernant la taille, la forme, l&#39;orientation et la répartition des cellules ou des structures. Ces méthodes ont été révolutionnaires pour l&#39;analyse quantitative du cerveau des mammifères, dans lequel les populations de cellules volumétriques sont trop élevées pour compter manuellement, et la stéréologie est maintenant la technique de choix chaque fois que des estimations de quantités tridimensionnelles doivent être extraites des mesures à deux dimensions sections. Toutes les méthodes stéréologiques sont en principe impartiales; Cependant, ils s&#39;appuient sur une connaissance appropriée de la structure d&#39;intérêt et des caractéristiques du tissu. La stéréologie est basée sur l&#39;échantillonnage homogène systématiquement aléatoire (SURS), avec un ajustement de l&#39;échantillonnage au niveau le plus efficace en matière de précision, fournissant des informations quantitatives et fiables sur toute la structure d&#39;intérêt. Ici, nous présentons le fractionneur optique en conjonction avec l&#39;immunohistochimie BrdU tO estiment la production et la survie des neurones nouvellement formés dans la couche de cellules granulaires (y compris la zone sous-granulaire) de l&#39;hippocampe de rat après stimulation électroconvulsive, qui est parmi les stimulateurs les plus puissants de la neurogenèse. La technique du fractionneur optique est conçue pour fournir des estimations du nombre total de cellules provenant de sections épaisses échantillonnées à partir de la structure complète. Les sections épaisses offrent l&#39;opportunité d&#39;observer les cellules dans leur totalité en 3-D, ce qui permet une classification cellulaire simple et robuste basée sur des critères morphologiques. Lorsqu&#39;il est correctement implémenté, la sensibilité et l&#39;efficacité du fractionneur optique fournissent des estimations précises avec une précision fixe et prédéterminée.

Paramètres d&#39;échantillonnage En analysant la distribution z dans une étude pilote ( Figure 3 ), nous avons trouvé une répartition uniforme des neurones BrdU positifs dans la hauteur du conducteur. Le rétrécissement des sections a été mesuré; L&#39;épaisseur moyenne finale était de 26,4 μm (19,0-32,0 μm) dans les coupes coupées à l&#39;origine à 80 μm. Sur la base de l&#39;épaisseur du tissu et de la distribution des neurones marqués par BrdU, la hauteur du capteur a été fixée à 10 μm, et les zones de protection en haut et en bas de la section ont été fixées à 5 μm et 4-17 μm respectivement. Selon la densité des cellules, la surface des cadres de comptage était de 1414 ou 5210 μm 2 . La longueur de l&#39;étape était de 220 μm dans les directions x et y et le comptage cellulaire a été effectué en moyenne 12 (gamme 8-16) par animal. Ces paramètres d&#39;échantillonnage ont donné une moyenne de 133 (gamme 33-372) BrdU- cellules positives comptées dans 173 (107-204) des disecteurs dans chaque hémisphère du cerveau. Par exemple, nous avons obtenu les valeurs CV et CE suivantes pour les estimations neuronales positives de BrdU chez les rats traités ECS: 24 heures: CV = 0,59, CE = 0,11; 3 mois: CV = 0,34, CE = 0,12; 6 mois: CV = 0,43, CE = 0,09; 12 mois: CV = 0,22, CE = 0,09. Nous avons quantifié le nombre total de neurones nouvellement formés et leur survie à long terme dans l&#39;hippocampe de rat après ECS en utilisant le fractionneur optique en conjonction avec une technique de coloration BrdU 10 , 11 . Les résultats finaux ont montré une neurogénèse basale dans les quatre groupes d&#39;animaux témoins, qui ne différait pas significativement en fonction du temps de survie ( figure 3 ). En outre, ECS a induit une augmentation significative du nombre total de neurones BrdU positifs à 24Heures (259%, p &lt;0,0001), 3 (229%, p &lt;0,001), 6 (152%, p &lt;0,05) et 12 mois (162%, p &lt;0,05) suite à l&#39;expérimentation, par rapport aux animaux témoins. <img alt="figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55737/55737fig3.jpg" /> Figure 3: Données quantitatives du nombre total de neurones BrdU positifs dans le GCL / SGZ de l&#39;hippocampe de rat 10 , 11 . Les barres horizontales représentent les valeurs moyennes. Abréviations: GCL, couche de granules; SGZ, zone sous-granulaire; H, heures; M, mois. **** p &lt;0,0001, *** p &lt;0,001 et * p &lt;0,05 par rapport au contrôle (n = 11-12 par groupe). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55737/55737fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Ici, nous présentons une méthode stéréologique, le fractionneur optique, utilisé pour quantifier la formation de nouveaux neurones et leur survie, dans l&#39;hippocampe du rat après une stimulation électroconvulsive. Lorsqu&#39;il est correctement implémenté, la sensibilité et l&#39;efficacité des méthodes stéréologiques garantissent des estimations précises avec une précision fixe et prédéterminée.

La technique du fractionneur optique pour estimer les nombres de cellules dans un modèle de rat de thérapie électroconvulsive

Stereological methods are designed to describe quantitative parameters without making assumptions about size, shape, orientation and distribution of cells ...

L'objectif général de cette étude stéréologique utilisant le fractionnement optique est d'obtenir des informations quantitatives, telles que le nombre total de cellules dans une région cérébrale spécifique, à l'aide de méthodes fondées sur des principes sans biais. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine de l'analyse quantitative, comme l'estimation du nombre total de cellules dans une structure d'intérêt complète. Un des principaux avantages de cette technique est qu'elle fournit des estimations précises avec une précision fixe et prédéterminée.Esther Kjaer Needham, co-auteure de l'article, illustre cette procédure. Commencez par un cerveau de rat fixé et congelé. À l'aide d'un scalpel, séparez les hémisphères droit et gauche le long de la ligne médiane du cerveau, puis choisissez au hasard l'un ou l'autre hémisphère dans le premier cerveau.Ensuite, alterner systématiquement entre l'hémisphère droit et l'hémisphère gauche. Puis, utiliser un milieu de montage pour fixer l'hémisphère choisi sur un disque d'échantillon, avec un axe longitudinal perpendiculaire au disque. Une fois l'hémisphère fixé sur le disque, placer un tube autour de l'hémisphère et le remplir de Tissue-Tek afin de recouvrir complètement l'hémisphère.Ensuite, placer les boîtiers multi-puits numérotés dans le cryostat pour les prérefroidir. Puis monter le disque d'échantillon dans le cryostat et couper entièrement l'hippocampe, en commençant aléatoirement, en sections de 80 micromètres d'épaisseur dans le plan coronal. Pendant la coupe, placer toutes les sections prélevées consécutivement dans les boîtiers multi-puits froids afin de garantir que les sections restent dans l'ordre de coupe.Lorsque tout l'hippocampe a été sectionné, recouvrir complètement les sections de cryoprotectant et conserver les récipients à moins 20 degrés Celsius jusqu'à utilisation ultérieure. Lorsque vous êtes prêt à commencer l'immunomarquage, laissez les sections atteindre la température ambiante. Utilisez ensuite un pinceau pour transférer une section sur cinq d'une série de sections hippocampiques vers des rétines de coloration à 25 puits placées dans des boîtes de Pétri remplies de PBS.Il devrait y avoir de huit à douze sections par hippocampe pour la coloration. Transférer les filets de coloration contenant les sections dans des boîtes en verre correspondantes contenant du PBS et laver les sections deux fois pendant 10 minutes dans du PBS. Incuber ensuite dans du peroxyde d'hydrogène à 3 % pendant 20 minutes.Après le lavage, transférez les sections dans trois solutions d'acide chlorhydrique. Ensuite, neutralisez avec du tétraborate de sodium 0,1 M à température ambiante pendant 20 minutes. Après trois incubations de 10 minutes avec changement de tampon de lavage à chaque fois, transférez les sections dans la solution de blocage pendant une heure à température ambiante.Incubez ensuite les sections dans l'anticorps anti-BrdU de souris dilué au 1/100 dans la solution de blocage pendant 48 heures à quatre degrés Celsius. Après l'incubation avec l'anticorps primaire, rincez trois fois pendant 10 minutes chacun dans le tampon de lavage. Incubez ensuite pendant 48 heures dans la peroxydase de raifort diluée au 1/10 dans le tampon de lavage.48 heures plus tard, transférez les sections dans du PBS pendant 10 minutes, et répétez pour un total de cinq lavages. Après le lavage, transférez les sections dans la solution de DAB pendant sept minutes. Ensuite, transférez-les dans la solution de DAB contenant 0,02 % de peroxyde d'hydrogène pendant 10 minutes.Après une série de lavages, montez les sections en ordre numérique sur des lames de microscope. Laissez sécher environ 30 minutes. Ensuite, faites sécher les échantillons à l'air en les plaçant dans un porte-lames.Ensuite, réhydratez les échantillons pendant 10 minutes dans une boîte de coloration contenant de l'eau distillée. Puis transférez les lames dans une solution de violet de crésyl à 0,02 % et de l'eau distillée pendant 15 minutes. Après avoir répété la coloration au violet de crésyl, réhydratez les sections à l'aide d'une série d'éthanol.Ensuite, déparaffinez les sections deux fois dans du xylène pendant 15 minutes à chaque fois. Enfin, ajoutez un milieu de montage à séchage rapide et posez une lame couvre-objet sur les lames. Après 24 heures, les lames peuvent être utilisées pour la microscopie.Commencez par vérifier l'épaisseur du tissu en plaçant d'abord les lames sur la platine motorisée du microscope, puis en ouvrant le logiciel de stéréologie. Délimitez la zone d'intérêt à l'aide d'un objectif de faible grossissement avant de passer à un objectif à immersion huile de 100x. Ensuite, choisissez un point précis dans un cadre de comptage, par exemple une zone adjacente à un coin, et repérez le sommet de la section en vous déplaçant le long du plan focal jusqu'à ce qu'un détail de la section apparaisse net. Enregistrez la position Z comme zéro. Ensuite, déplacez le plan focal vers le bas à travers le tissu jusqu’à ce que le dernier niveau Z du tissu soit au point, puis marquez cette position. L’épaisseur locale du tissu est définie du zéro à ce point final et peut être lue sur l’axe Z.Enregistrez l'épaisseur du tissu. L'épaisseur du tissu est mesurée à plusieurs endroits dans la région d'intérêt. La hauteur du dissector et des zones de garde, la taille du cadre de comptage, la longueur du pas et le grossissement final sont déterminées lors d'une étude pilote.Vous pouvez maintenant commencer à compter les neurones positifs pour la BrdU, généralement avec un grossissement final de 2000 à 3000×, en utilisant un objectif à immersion huile 60× ou 100× et une ouverture numérique élevée. Identifiez les neurones positifs pour la BrdU dans chaque cadre de comptage, mais n'incluez pas ceux qui touchent la ligne d'exclusion rouge. Comptez les neurones positifs pour la BrdU qui touchent la ligne d'inclusion verte ainsi que ceux qui se trouvent à l'intérieur des limites du cadre de comptage.Ne comptez que les neurones positifs pour la BrdU lorsque la caractéristique d'intérêt est clairement identifiable dans la hauteur du dissector. Les neurones partiellement visibles montrés ici ne sont pas comptés. Cette image montre le nombre total de neurones positifs pour la BrdU dans la couche des cellules granulaires de l'hippocampe et dans la zone sous-granulaire de l'hippocampe du rat.Les barres horizontales représentent les valeurs moyennes. Après la stimulation électroconvulsive, on observe une augmentation immédiate de 260 % de la formation de nouveaux neurones positifs pour la BrdU par rapport aux témoins traités. Dans ce pool de neurones nouvellement générés, on constate une perte de 40 % entre le premier jour et trois mois, avec près de 50 % des neurones nouvellement formés qui survivent 12 mois après le traitement.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'obtenir une estimation du nombre total de cellules dans une région cérébrale à l'aide de méthodes stéréologiques.

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Saisie par électrochocs (ECS) est un modèle animal expérimental de la thérapie par électrochocs pour dépression sévère. ECS dans le monde stimule l’activité dans l’hippocampe, conduisant à la synaptogénèse et la plasticité synaptique. Nous décrivons ici les méthodes pour l’induction de ECS chez les rats et pour fractionnement subcellulaire de leur hippocampe pour examiner les changements induits par saisie en protéines synaptiques.

Par électrochocs saisies chez le rat et le fractionnement de leur hippocampe pour examiner la saisie-induced Changes in densité postsynaptique protéines

Cet ouvrage présente un protocole étape par étape pour l’estimation non biaisée stéréologique des numéros des neurones dopaminergiques dans la substantia nigra de souris à l’aide d’équipement de microscopie standard (c'est-à-dire, un microscope optique, une table objet motorisé (x, y, z avion) et le logiciel du domaine public pour l’analyse d’image numérique.

Stéréologique Estimation du nombre de neurones dopaminergiques dans la Substantia Nigra de souris à l’aide de l’optique fractionnateur et l’équipement de microscopie Standard

Un protocole détaillé pour l’évaluation des afficheurs structurels et visuelles chez les rongeurs par réaction d’optocinétique et de tomographie par cohérence optique est présenté. Les résultats fournissent des indications précieuses pour la recherche ophtalmologique ainsi que neurologique.

Utilisant la tomographie par cohérence optique et réponse optocinétique comme lectures structurale et fonctionnelle de système visuel chez les souris et les Rats

Le rôle des gènes récemment découverts associés à la maladie dans la pathogénie des désordres neuropsychiatriques demeure obscur. Une technique bilatérale modifiée d’électroporation in utero permet le transfert de gènes dans de grandes populations de neurones et l’examen des effets causatifs des changements d’expression génétique sur le comportement social.

Un pipeline utilisant l’électroporation bilatérale in utero pour interroger les influences génétiques sur le comportement des rongeurs

Ici nous présentons une méthode automatisée pour la détermination semi-quantitative du nombre dopaminergique de neurone dans le substantia nigra compacta de substantia de rat.

Détermination semi-quantitative de la densité des neurones dopaminergiques dans la Substantia Nigra des modèles de rongeurs à l’aide de l’analyse automatisée d’images

Nous présentons ici un protocole pour effectuer une radiothérapie préclinique basée sur la tomographie par émission de positons dans un modèle de glioblastome de rat à l’aide d’algorithmes développés en interne pour optimiser la précision et l’efficacité.

Radiothérapie par peinture de dose basée sur la tomographie par émission de positons dans un modèle de rat de glioblastome à l’aide de la plate-forme de recherche sur les rayonnements de petits animaux

Ce protocole décrit l’utilisation de la microMS pour la spectrométrie de masse monocellulaire MALDI-2 guidée par fluorescence, permettant un profilage moléculaire amélioré des cellules neuronales primaires du rat.

Désorption/ionisation laser assistée par matrice guidée par fluorescence avec spectrométrie de masse de postionisation induite par laser de cellules neurales de rat individuelles

Découvrez la technique du fractionneur optique pour quantifier la neurogenèse dans l'hippocampe de rat après stimulation électroconvulsive. Cette méthode stéréologique fournit des estimations précises et sans biais des populations cellulaires.

La technique du fractionneur optique pour estimer les nombres de cellules dans un modèle de rat de thérapie électroconvulsive

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