Analyse des supercomplexes de la chaîne de transport d'électrons mitochondriaux avec électrophorèse native, essais en gel et électroélution

L’objectif global de l’électrophorèse native en combinaison avec les dosages en gel, l’immunobuvardage et l’électroélution native est de préserver et d’analyser l’assemblage des supercomplexes mitochondriaux. Cette méthode peut aider à répondre à la question de savoir comment les complexes protéiques de la chaîne de transport d’électrons mitochondriaux s’assemblent en supercomplexes en fonction de nombreux facteurs, notamment les besoins bioénergétiques et les conditions physiologiques et pathologiques. Le principal avantage de cette technique est que, si elle est effectuée correctement, l’intégrité physiologique et la fonctionnalité des supercomplexes mitochondriaux sont préservées tout au long du long processus d’isolement.

Cette méthode peut également être appliquée pour étudier la dynamique de l’assemblage de supercomplexes et pour analyser les complexes protéiques dans la membrane plasmique, ainsi que dans d’autres membranes intracellulaires. Lors de la préparation des tests en gel, il est absolument essentiel que toutes les pièces utilisées pour l’électrophorèse native ne soient pas contaminées par des détergents, car elles contribueront à une désintégration des supercomplexes mitochondriaux. Coupez une ou plusieurs voies d’un gel natif transparent et transférez-les dans un récipient étiqueté.

Pour effectuer le dosage du complexe 1, combinez 10 millilitres de tampon de dosage avec 25 milligrammes de tétrazolium bleu de nitro et 100 microlitres de 10 milligrammes par millilitre de NADH. Ajoutez-le à la voie de gel natif clair excisée ou à la zone d’intérêt. Suivez l’apparition de bandes bleues après une légère agitation sur un rocker pendant au moins trois minutes.

Ensuite, fixez le gel dans 10 à 20 millilitres de solution d’acide acétique ou lavez-le dans cinq millimolaires de Tris pH 7,4 pour arrêter la réaction. Prenez des photos pour la documentation. Pour effectuer le dosage du complexe 5, obtenez un gel, une voie ou une zone d’intérêt à partir d’un gel natif bleu ou d’un gel natif clair.

Incuber l’échantillon pendant deux heures en l’agitant doucement dans 10 à 20 millilitres de tampon de dosage, plus ou moins cinq microgrammes par millilitre d’oligomycine à température ambiante. Après l’incubation, remplacez le tampon par 14 millilitres de tampon de dosage frais. Ajoutez ensuite, dans l’ordre, 190 microlitres d’une molaire de sulfate de magnésium, 27,28 milligrammes de nitrate de plomb, 60 milligrammes d’ATP et 75 microlitres d’oligomycine.

Incuber avec une agitation douce et surveiller la présence d’un précipité blanc, car les bandes sur les gels traités à l’oligomycine donneront des bandes non dépendantes du complexe 5. Fixez le gel dans un fixateur à base de méthanol car les solutions acides dissoudront le précipité de plomb. Photographiez les résultats et poursuivez avec le transfert de protéines et l’immunoblottage, comme décrit dans le protocole textuel.

Le jour de l’électroélution, placez une fritte au fond de chaque tube de verre à utiliser. Si nécessaire, placez le tube en verre dans le tampon d’élution et poussez la fritte de l’intérieur vers le bas du tube. Poussez le tube en verre avec la fritte dans le module de l’Electro-Eluter.

Mouillez l’œillet avec un tampon d’élution et faites glisser le tube en verre en place. Assurez-vous que le haut des tubes de verre est au même niveau que l’œillet. Fermez les œillets vides avec des bouchons.

Ensuite, placez un capuchon de membrane humide au bas de l’adaptateur en silicone et remplissez l’adaptateur avec un tampon d’élution. Pipetez lentement le tampon et l’adaptateur de haut en bas pour éliminer les bulles d’air autour de la membrane de dialyse. Faites glisser l’adaptateur rempli de tampon au bas du tube en verre.

Ensuite, retirez toutes les bulles qui apparaissent sur la fritte à l’intérieur du tube en verre. Remplissez chaque tube en verre avec le tampon d’élution. Placez les bandes excisées du BN-PAGE dans les tubes en verre.

Coupez de gros morceaux en petits morceaux. Assurez-vous que la hauteur de remplissage à l’intérieur du tube de verre est d’environ un centimètre. Ensuite, placez l’ensemble du module dans le réservoir.

Ajoutez environ 600 millilitres de tampon d’élution froide dans le réservoir. Assurez-vous que les capuchons d’adaptation en silicone sont immergés dans le tampon. Placez une barre d’agitation au fond du réservoir avant d’éluer les protéines pendant quatre heures à 350 volts dans une chambre froide.

Une fois l’élution terminée, retirez le module Electro-Eluter du réservoir tampon et placez-le dans un évier ou un bol. Si un bouchon a été utilisé, retirez-le pour vider la chambre tampon supérieure. Retirez le tampon de chaque tube en verre et jetez-le.

Assurez-vous que l’adaptateur en silicone reste en place et que le liquide sous la fritte n’est pas perturbé ou secoué. Ensuite, retirez délicatement l’adaptateur en silicone, ainsi que le capuchon de la membrane du bas du tube en verre. Pipetez le contenu du capuchon en silicone dans un microtube.

Avec 200 microlitres supplémentaires de tampon d’élution, rincez le capuchon en silicone et ajoutez-le au microtube. Répétez ce processus pour tous les tubes en verre. Conservez les bouchons de membrane réutilisables en les plaçant dans un tampon d’élution contenant 0,5 milligramme par millilitre d’azoture de sodium, et réfrigérez-les.

Les supercomplexes des mitochondries cardiaques sont visualisés ici par des dosages en gel. Des voies de gel natif transparent sont utilisées pour les dosages en gel pour le complexe 1 et le complexe 5. La spécificité du signal peut être évaluée en utilisant des inhibiteurs, comme l’oligomycine pour l’ATP-synthase.

Les dosages en gel fournissent des informations sur la taille d’un complexe protéique, avec une activité du complexe 1 ou du complexe 5, mais pas sur sa composition. Le gel natif bleu présente des bandes de complexes protéiques qui peuvent être excisés pour l’électroélution. Après l’électroélution, l’éluat est utilisé pour des analyses plus approfondies, comme les dosages en gel, la coloration à l’argent des protéines éluées par électrophorèse native ou dénaturante et le western blot.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois jours si elle est correctement exécutée. Ces trois jours comprennent l’isolement des mitochondries, la réalisation d’une maxi électrophorèse native bleue pendant la nuit et l’immunobuvardage. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et d’identifier les supercomplexes mitochondriaux à l’aide de l’électrophorèse native, des dosages en gel et de l’électroélution.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que les supercomplexes mitochondriaux sont fragiles. La congélation et la décongélation des échantillons doivent être réduites au minimum. L’électrophorèse et l’électroélution natives doivent être effectuées sur de la glace ou dans la chambre froide.

Les implications de ces techniques vont au-delà de la définition de la composition physique de chaque supercomplexe. Parce que les supercomplexes sont capturés dans leur forme native, des tests fonctionnels peuvent être effectués. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie mitochondriale pour réévaluer la compréhension de l’activité du transport d’électrons mitochondriaux et de ses conséquences pour les patients atteints de maladies mitochondriales.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la HPLC, la spectroscopie de masse, la microscopie électronique ou le patch clamping peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que la composition moléculaire, la structure ou les propriétés électrophysiologiques des complexes protéiques isolés.