La perfusion DiI comme méthode de visualisation vasculaire dans Ambystoma mexicanum

L’objectif global de cette procédure est de visualiser le système vasculaire de l’axolotl. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la médecine régénérative sur les subtilités de la revascularisation des tissus régénérants chez l’axolotl. Le principal avantage de cette technique de visualisation vasculaire est que tous les vaisseaux sanguins de l’animal peuvent être facilement imagés sur un microscope fluorescent standard.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la régénération des membres de l’axolotl, elle peut également être appliquée à d’autres tissus, tels que la queue, le cœur, les yeux, les branchies ou d’autres organes. Avant d’ouvrir la poitrine de l’axolotl, confirmez d’abord le niveau approprié de sédation par pincement des orteils. Ensuite, à l’aide d’une pince chirurgicale, pincez la peau le long de l’axe central de la poitrine, juste en dessous de la ligne des épaules.

À l’aide d’un scalpel, faites une incision à l’endroit où la peau est tirée vers le haut et retirez une partie carrée de la peau sur la poitrine pour révéler deux plaques cartilagineuses. Ensuite, ouvrez une fenêtre sur la cavité thoracique et déchirez soigneusement le tissu conjonctif sans couper les principaux vaisseaux sanguins. À l’aide d’une pince, soulevez chaque plaque cartilagineuse individuellement, en excisant chaque plaque avec des ciseaux chirurgicaux.

Pincez soigneusement le péricarde exposé avec la pince. Tirez le tissu vers le haut et perforez-le avec les ciseaux chirurgicaux, juste assez profondément pour enlever le péricarde sans blesser le cœur. Ensuite, retirez doucement le péricarde pour exposer le cœur et l’aorte, afin de voir clairement le cœur à environ cinq millimètres de l’aorte, en se ramifiant du cœur.

Pour perfuser l’axolotl, placez un support de pince avec une aiguille papillon chargée à côté d’un cadre en mousse de polystyrène, de sorte que le bras de la pince soit facilement manipulé pour l’insertion de l’aiguille. Allumez une pompe péristaltique pour rincer 0,7x PBS à travers le tube de la pompe et dirigez la pointe de l’aiguille vers la face rostrale. Glissez la pince sous l’arc aortique et tirez légèrement vers le haut.

Ensuite, manœuvrez la combinaison de pinces à aiguille, de sorte que l’aiguille longe la longueur de l’aorte vers la tête de l’animal, et insérez l’aiguille à environ cinq millimètres dans l’aorte, en gardant la pince derrière l’aorte pour le soutenir. Une insertion réussie peut être confirmée par une hypertrophie visible des oreillettes cardiaques. Lacérez rapidement un oreillette et laissez le sang s’écouler.

Ensuite, perfuser l’axolotl avec environ 20 à 30 millilitres de PBS. Après une perfusion réussie, l’animal devrait passer du rose clair au blanc. Lorsque tout le PBS a été perfusé, interrompre la pompe péristaltique et déplacer l’extrémité libre du tube dans un tube de 15 millilitres de solution Dil.

Redémarrez la pompe en prenant soin de ne pas créer de bulles dans le tube et perfuser l’animal avec tout le stock de Dil en état de marche. Dans une perfusion réussie, l’axolotl passera à une couleur rose vif qui sera plus visible dans les branchies. Lorsque tout le Dil a été perfusé, arrêtez la pompe et placez l’extrémité libre du tube dans une solution de paraformaldéhyde à 4 %.

Ensuite, redémarrez la pompe et perfuser au moins 10 millilitres de fixateur. Lorsque tout le paraformaldéhyde a été administré, arrêtez la pompe et retirez l’aiguille. Transférez l’axolotl sur une parabole en plastique et placez la parabole sur une platine de microscope fluorescent.

Ensuite, avec les lumières éteintes, sélectionnez un filtre qui permet l’excitation du Dil, qui émet une lumière rouge orange. Après une perfusion réussie, la coloration Dil est visible comme un signal d’admission rouge dans tous les tissus de l’axolotl, y compris la queue, les membres, les branchies et les yeux. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure si elle est exécutée correctement.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de ne pas lacérer les principaux vaisseaux sanguins ou le cœur lors de l’ouverture de la cavité thoracique et d’insérer l’aiguille dans l’alignement de l’aorte pour éviter les perforations traversantes. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que les préparations squelettiques peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine biomédical pour explorer le système vasculaire de différentes espèces.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une perfusion cardiaque de l’axolotl avec le colorant carbocyanine, Dil. N’oubliez pas que travailler avec des aiguilles et du paraformaldéhyde peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port de l’équipement de protection individuelle approprié, doivent toujours être prises lors de l’exécution de la procédure.