Préparation de vésicules membranaires plasmatiques à partir de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse pour une thérapie potentielle de remplacement du cytoplasme

L’objectif global de cette procédure est d’administrer une nouvelle thérapie de remplacement du cytoplasme au muscle gastrocnémien de souris à l’aide de vésicules de membrane plasmique, ou PMV dérivées de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse de souris ou BMSC. Cette méthode peut aider à répondre aux questions avec la supplémentation des cellules avec du cytoplasme jeune provenant d’autres BMSC via la fusion PMV peut améliorer ou même inverser les phénotypes associatifs de l’âge. Le principal avantage de cette technique est que l’encapsulation PMV du cytosol BMSC peut être induite instantanément par une extrusion mécanique.

Lorsque vous faites la démonstration de cette méthode, elle est essentielle car vous extrudez et construisez des étapes difficiles à apprendre en testant pour les posséder réellement. Pour générer les PMV, il faut d’abord cultiver des BMSC de souris dans un milieu de culture DMEM complet dans un puits d’une plaque à six puits dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Lorsque les cellules ont atteint 90 % de confluence, rincez le puits avec 0,5 millilitre de PBS sans calcium et détachez les cellules avec 0,5 millilitre de 0,25 % de trypsine-EDTA.

Après trois minutes à 37 degrés Celsius, tapotez la plaque avec la paume de la main plusieurs fois pour faciliter la dissociation cellulaire et arrêtez la digestion avec un millilitre de milieu de culture. Transférez les cellules dans un tube conique de cinq millilitres pour la centrifugation et remettez en suspension la pastille dans quatre millilitres de milieu de culture frais. Ensuite, divisez les cellules entre deux puits d’une nouvelle plaque à six puits et remettez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures.

Le lendemain, récoltez les cellules d’un puits par digestion à la trypsine comme nous venons de le démontrer. Mise en suspension de la pastille dans 0,5 millilitres de milieu de culture frais après collecte par centrifugation. Chargez les cellules dans une seringue à insuline d’un millilitre et fixez la seringue à une unité de filtration.

Appuyez rapidement sur le piston pour faire passer les cellules à travers le filtre et jetez le milieu extrudé. Ensuite, chargez et distribuez 0,5 millilitre de milieu de culture supplémentaire à travers le filtre comme nous venons de le démontrer, en recueillant le milieu de la deuxième extrusion. Grainez 150 microlitres du milieu collecté dans un plat à fond en verre de 35 millilitres et laissez les vésicules se déposer pendant environ 10 minutes.

Confirmer ensuite la présence de PMV sous un microscope à contraste de phase inversé équipé d’une caméra CCD à l’aide d’un objectif 20x. Pour suivre l’enceinte mitochondriale et le potentiel membranaire dans les PMV, colorez une culture BMSC confluente à 90 % avec un colorant mitochondrial approprié ou une sonde de potentiel de membrane mitochondriale respectivement dans un milieu de culture frais pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, rincez les cellules trois fois avec 0,5 millilitre de PBS par lavage et récoltez les cellules par digestion à la trypsine pour la génération de PMV, comme cela vient d’être démontré pour leur visualisation par microscopie confocale.

Pour retracer la localisation cytoplasmique des protéines PMV, diluez d’abord deux microgrammes d’ADN plasmidique superenroulé pour une cassette d’expression EGFP et six microlitres de réactif de transfection cationique dans des tubes individuels de 0,5 millilitre contenant 50 microlitres de DMEM sans sérum. Vortex les tubes, suivi d’une brève centrifugation. Ajoutez ensuite le réactif de transfection goutte à goutte dans le tube contenant la solution d’ADN dilué.

Vortex vigoureusement le mélange de transfection d’ADN pendant une minute, suivi d’un bref essorage dans une incubation de 10 minutes à température ambiante. Ensuite, nourrissez une culture BMSC confluente à 30 % dans une plaque à six puits avec deux millilitres de milieu de culture frais et ajoutez le mélange d’ADN goutte à goutte aux cellules. 48 heures après leur transfection, récoltez les BMSC par digestion à la trypsine et préparez les PMV comme nous venons de le démontrer.

Les PMV peuvent ensuite être analysés par microscopie confocale à l’aide d’un objectif à 100 fois l’huile. Avant d’injecter les PMV, étiquetez une culture BMSC avec un colorant fluorescent de suivi cellulaire de coloration membranaire dans un millilitre de milieu de culture frais à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes et récoltez les cellules par digestion à la trypsine. Remettre en suspension les cellules marquées dans 0,5 millilitre de milieu de culture frais complété par un microgramme de polyéthylène amine et préparer les VPM comme démontré.

Ensuite, concentrez les PMV par centrifugation et remettez en suspension le granulé dans 100 microlitres de milieu de culture frais avec un léger tourbillonnage. Ensuite, chargez les cellules dans une seringue à insuline d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 30 et désinfectez l’extérieur du muscle gastrocnémien d’une souris BALB/c anesthésiée avec de l’éthanol à 75 %. Ensuite, injectez lentement tout le volume des PMV dans le muscle et laissez l’animal récupérer sous une lampe chauffante.

Après 12 heures, saupoudrez 75 % d’éthanol sur le muscle, ouvrez la peau avec des ciseaux et récoltez tout le muscle gastrocnémien aux deux extrémités. Rincez le muscle avec du PBS et placez-le sous un microscope à fluorescence. À l’aide de l’objectif 20 fois, retirez les morceaux de tissu musculaire non fluorescents avec une lame de rasoir tranchante et hachez les morceaux fluorescents rouges restants en cubes d’environ neuf millimètres cubes.

Intégrez chaque cube dans un milieu à température de coupe optimale. Ensuite, plongez les cubes dans de l’azote liquide pendant cinq minutes. Et conservez les échantillons de tissus à moins 20 degrés Celsius jusqu’à leur analyse.

Les PMV générés à partir de BMSC, comme cela a été démontré, présentent principalement une taille de l’ordre de trois micromètres de diamètre, tel qu’examiné en microscopie à contraste de phase à l’aide de l’objectif 20 fois. La transfection de BMSC avec une cassette d’expression fluorescente pendant 48 heures illustre l’encapsulation cytoplasmique de la protéine EGFP par les PMV. De plus, le fait de se tenir debout avec un colorant mitochondrial fluorescent révèle qu’une grande fraction des PMV contiennent des mitochondries.

La majorité d’entre eux se colorent positivement pour un colorant potentiel de membrane mitochondriale, indiquant la fonctionnalité des mitochondries. Le traitement à la polyéthylène amine avant leur administration in vivo empêche l’agrégation du PMV lors de leur concentration centrifuge pour l’élimination des composants cellulaires. Le marquage par colorant membranaire des BMSC avant la génération de PMV facilite la génération de PMV traçables par fluorescence.

En effet, la visualisation de sections congelées du muscle gastrocnémien après l’administration intramusculaire de PMV marqués indique l’administration de PMV au cytoplasme des cellules musculaires probablement par endocytose. Lors de la procédure de génération du PMV, il est important de ne pas oublier de charger la seringue avec le nombre approprié de cellules pour enfoncer rapidement le piston lors du rinçage des cellules à travers le filtre. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la thérapie par cellules souches pour explorer le traitement des maladies liées à l’âge chez la souris.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer le PMV à partir de BMSC pour l’administration de cytoplasme dans le muscle gastrocnémien des souris.