Glycosylation métabolique de l’acide sialique à l’aide de N-acyl-modification Mannosamines

L’objectif global de cette technique est de générer des cellules ou des produits dérivés de cellules avec une expression modifiée de l’acide sialique. Par conséquent, les cellules sont traitées avec des mannosamines modifiées en N-acyle qui sont métabolisées en acides sialiques correspondants et ensuite exprimées à la surface de la cellule. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la glycobiologie, telles que l’influence sur les glycoconjugués sur les interactions récepteur-ligand.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle est facile à appliquer et purement cytotoxique. Pour démontrer la glyco-ingénierie métabolique, nous utiliserons la N-acétylmannosamine, qui est disponible dans le commerce. De plus, nous démontrerons la synthèse et l’utilisation de la N-propionyle et de la N-butanoylmannosamine.

Les effets biologiques de la glyco-ingénierie métabolique sur l’expression de l’acide polysialique sont présentés. Tout d’abord, dissolvez 431,2 milligrammes de chlorhydrate de mannosamine dans 10 millilitres de trois solutions de méthoxyde de sodium millimolaire dans une bouteille en verre de 15 millilitres contenant un agitateur. Refroidissez le mélange sur de la glace à zéro degré Celsius.

Tout en remuant, ajoutez lentement 210 micromètres de chlorure de propionyle goutte à goutte à la solution. Ensuite, incubez le mélange d’agitation à zéro degré Celsius pendant quatre heures. Ensuite, transférez la solution dans un tube en plastique de 50 millilitres et percez quatre à 8 trous dans le capuchon du tube avec une aiguille fine.

Congelez rapidement la solution à l’aide d’azote liquide. Ensuite, lyophilisez l’échantillon jusqu’à ce qu’il soit complètement sec. Après lyophilisation, dissoudre le produit séché dans de l’acétate d’éthyle, du méthanol et de l’eau.

À l’aide d’une pipette, chargez la solution sur une colonne de gel de silice préalablement préparée. Après avoir élué 500 millilitres de solvant, prélevez quatre fractions de millilitres. Transférez les fractions éluées dans un tube en plastique de 15 millilitres et percez trois à six trous dans le capuchon du tube avec une aiguille fine.

Après la congélation de la solution avec de l’azote liquide, lyophilisez l’échantillon jusqu’à ce qu’il soit complètement sec. Cultivez des cellules de neuroblastome de Kelly dans un milieu RPMI à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Avant l’application des mannosamines, détachez les cellules du neuroblastome de Kelly en les incubant pendant 10 minutes avec de la trypsine et de l’EDTA.

Après avoir neutralisé la trypsine avec un milieu RPMI, comptez les cellules à l’aide d’une chambre de Neubauer. Pour mesurer les monosaccharides d’acide sialique, placez les cellules dans 500 microlitres de milieu dans une plaque de culture tissulaire de 48 puits. Pour l’analyse des acides polysialiques, placez les cellules dans trois millilitres de milieu sur une boîte de culture cellulaire de six centimètres de diamètre.

Ajoutez les dérivés respectifs de la mannosamine, dissous dans le RPMI, aux cellules fraîchement placées, à une concentration finale de cinq millimolaires et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, en remplaçant le milieu contenant les mannosamines modifiées au N-acyle toutes les 24 heures. Après le traitement, décantez le milieu et lavez les cellules avec du PBS. Détachez les cellules en les incubant pendant 10 minutes avec de la trypsine et de l’EDTA.

Neutralisez la trypsine en ajoutant le même volume de milieu de culture cellulaire aux cellules détachées. Ensuite, transférez les cellules détachées dans des tubes en plastique de 15 millilitres. Centrifugez les échantillons pendant trois minutes à 500 fois G.Après avoir jeté le surnageant, lavez les cellules trois fois avec cinq millilitres de PBS.

Après la centrifugation, remettre en suspension les granules de cellules collectées dans 500 microlitres de tampon de lyse HPLC glacé. Éultrasonisez les échantillons à l’aide d’une aiguille de processeur à ultrasons trois fois pendant une période de 30 secondes à des amplitudes moyennes-élevées, en refroidissant les échantillons sur de la glace pendant au moins une minute entre les cycles. Après avoir centrifugé les échantillons de cellules lysées, séparez le surnageant des fractions membranaires dans des tubes en plastique de 1,5 millilitre.

Pour l’hydrolyse acide, ajoutez 150 microlitres d’une solution molaire de TFA aux fractions membranaires séparées. Incuber les échantillons pendant quatre heures à 80 degrés Celsius en secouant à 200 à 600 tr/min. Ensuite, transportez les échantillons dans des tubes filtrants de 0,5 millilitre avec des membranes d’exclusion de trois kilodaltons.

Centrifugez les échantillons pendant environ 30 minutes à 20 000 fois G et 21 degrés Celsius, jusqu’à ce que le volume de la phase supérieure soit inférieur à 20 microlitres. Ensuite, jetez les inserts et percez deux à quatre trous dans les bouchons des tubes contenant l’ultrafiltrat avec une aiguille fine. Après la congélation des échantillons avec de l’azote liquide, lyophilisez-les pendant la nuit.

Remettre en suspension les échantillons séchés dans 10 microlitres de solution TFA de 120 millimolaires et ajouter 50 microlitres de solution DMB. Transférez les échantillons dans des tubes sombres de 1,5 millilitre pour les protéger de la lumière ultraviolette. Incuber les échantillons et les étalons de membrane cellulaire pendant 1,5 heure à 56 degrés Celsius.

Après l’incubation, ajoutez quatre microlitres de solution d’hydroxyde de sodium de 400 millimolaires à chaque échantillon pour arrêter la réaction d’étiquetage. Pour l’analyse HPLC, réglez la température de la colonne à 40 degrés Celsius et configurez le détecteur de fluorescence à 373 nanomètres pour l’excitation et 448 nanomètres pour l’omission, respectivement. Injectez 10 microlitres de volume d’échantillon et séparez les sondes pendant 15 minutes à un débit de 0,5 millilitre par minute avec du méthanol, de l’acétonitrile et de l’eau comme éluant.

Pour l’analyse par spectrométrie de masse, injectez 20 microlitres de chaque échantillon HPLC collecté dans un système de détection sélective de masse LC. Dans le logiciel d’évaluation du système de détection sélective de masse LC, sélectionnez le pic d’intérêt dans le chromatogramme ionique total. Visualisez le spectre de masse du pic résolu et affichez le rapport masse/charge positif entre 300 et 700.

Ajoutez un millilitre de tampon de lyse par transfert Western aux pastilles préalablement préparées de cellules glyco-modifiées, et vortex. Incuber les échantillons pendant 30 minutes sur de la glace, en tourbillonnant toutes les cinq minutes. Ensuite, centrifugez les échantillons pendant 1,5 heure à 20 000 fois G et quatre degrés Celsius.

Ensuite, collectez le surnageant contenant les protéines des cellules lysées dans des tubes de 1,5 millilitre. Préparez les échantillons pour la page SDS en ajoutant 10 microlitres de tampon d’échantillon Laemmli à 90 microlitres de chaque fraction protéique. Faites bouillir les échantillons pendant cinq minutes.

Après avoir chargé les échantillons sur un gel d’acrylamide à 8 % de SDS, faites fonctionner le gel à 25 milliampères pendant deux heures à température ambiante. Lorsque vous avez terminé, retirez soigneusement le couvercle en verre du gel et découpez la partie supérieure du gel contenant les poches de chargement. Ensuite, placez le gel sur une membrane de micronitrocellulose de 0,2, préalablement trempée dans un tampon western blot.

Transférez les protéines dans la nitrocellulose selon les recommandations du système. Après avoir retiré la membrane de nitrocellulose du système de transfert, colorez le transfert avec du rouge Ponceau pour visualiser les protéines et ainsi contrôler la qualité du transfert. Ensuite, transférez la membrane de nitrocellulose dans une chambre en plastique et ajoutez 10 millilitres de solution de blocage.

Après avoir incubé la membrane de nitrocellulose, décantez la solution bloquante et ajoutez l’anticorps monoclonal anti-acide polysialique 735 dans le PBS. Après l’incubation, lavez la membrane au moins trois fois pendant cinq minutes avec du PBS. Maintenant, ajoutez à la membrane de nitrocellulose un anticorps secondaire polyclonal anti-IgG de souris couplé à la peroxydase de raifort.

Après avoir incubé et lavé la membrane, transférez-la sur une plaque d’un imageur approprié. Ensuite, détectez le signal selon les instructions du fabricant. L’acide neuraminique N-glycolyl marqué au DMB élue entre sept et neuf minutes.

Et, l’acide neuraminique N-acétyle marqué par le DMB élue entre 10 et 12 minutes. Plusieurs pics plus petits observés dans le chromatogramme représentent des DMB et des intermédiaires de réaction n’ayant pas réagi. Les chromatogrammes HPLC des lysats cellulaires montrent plusieurs pics indéfinis, qui représentent des impuretés internes et des sous-produits DMB issus de la réaction avec d’autres acides alpha-céto présents dans les lysats cellulaires.

Le traitement avec la N-acétyl Mannosamine conduit souvent à l’épuisement de l’acide N-glycolylneuraminique à la surface des cellules. Dans les chromatogrammes de cellules lysées traitées avec de l’acide neuraminique N-propionyl ou de l’acide neuraminique N-butanoyl, des pics sont observés qui indiquent l’apparition des acides sialiques non naturels correspondants. La réaction du DMB avec les espèces d’acide sialique entraîne une augmentation de la masse moléculaire de 116,2 daltons, par rapport aux espèces d’acide sialique qui ne sont pas marquées avec ce colorant.

Outre les espèces ioniques potentialisées, les adduits sodiques sont également observés. DMB-Neu5Gc élue peu de temps après l’espèce DMB n’ayant pas réagi ou ayant partiellement réagi, ce qui explique l’apparition de pics indéfinis dans le spectre de masse de DMB-Neu5Gc. Le traitement des cellules du neuroblastome de Kelly avec de la N-propionylmannosamine ou de la N-butanoylmannosamine entraîne une réduction de l’expression de l’acide polysiatique à la surface cellulaire.

Le traitement avec de la N-acétylmannosamine, en revanche, entraîne une augmentation de l’expression de l’acide polysiatique. En appliquant cette technique, des cellules avec une sialylation totale peuvent être générées en quelques jours. De telles cellules glyco-modifiées peuvent être utilisées dans d’autres expériences.

Par exemple, pour étudier les interactions récepteur-ligand ou, comme montré ici, pour inhiber l’expression de l’acide polysiatique. La procédure d’ingénierie métabolique présentée ici est optimisée pour les expériences sur l’acide sialique. Cependant, la même procédure peut également être utilisée dans les expériences sur les animaux.

Nous espérons que le protocole que nous avons présenté et la production de cette vidéo aideront les auteurs à introduire la glyco-ingénierie métabolique dans les laboratoires pour analyser la fonction et le rôle biologique de l’acide sialique et des récepteurs de l’acide sialique dans les systèmes biologiques. Les chimistes organiques pourraient synthétiser des mannosamines modifiées au N-acyle avec des structures plus complexes et les utiliser comme suggéré dans notre protocole. Conformément à notre protocole, tous les échantillons doivent être analysés immédiatement après le marquage fluorescent.

Par conséquent, il ne devrait y avoir aucun délai entre les analyseurs HPLC et ACMS.