Purification des protéines de surface cellulaire biotinylées de Rhipicephalus microplus Cellules intestinales épithéliales

Purification de protéines de surface cellulaire biotinylées à partir de cellules intestinales épithéliales de Rhipicephalus microplus. Dans le cadre de cette étude, une méthodologie modifiée basée sur le gradient de Percoll a été utilisée pour isoler des cellules épithéliales individuelles du tissu intestinal de Rhipicephalus microplus. Les protéines liées à la surface ont été biotinylées et purifiées par des billes magnétiques de streptavidine pour être utilisées dans des applications en aval.

Dissection de l’épithélium intestinal de Rhipicephalus microplus semi-engorgé. Vous aurez besoin des matériaux suivants. Collez une bande de ruban adhésif au fond d’une boîte de Pétri.

Ajoutez une goutte de Super Glue au ruban. Placez la tique côté ventral vers le bas sur la Super Glue, en la laissant sécher. Immergez complètement la tique dans 100 ml de PBS.

À l’aide d’un scalpel de taille 11, coupez du haut des yeux vers le bas des festons des deux côtés de la tique. À l’aide d’une pince stérile, retirez complètement le scutum et l’alloscutum pour exposer les organes internes. Retirez les organes fins et blancs filiformes et les autres membranes.

Retirez l’intestin à l’aide d’une pince. Conservez l’intestin dans du HBSS et du PIC glacés. Dissociation des cellules épithéliales.

Vous aurez besoin des matériaux suivants. Versez l’intestin disséqué sur une passoire à cellules de 70 microns à l’intérieur d’un tube Falcon de 50 ml. Comme un vide peut se former à l’intérieur du tube Falcon, soulevez le filtre pour permettre la circulation de l’air.

Rincer le tissu intestinal avec 50 ml de HBSS glacé avec PIC. Remettre les intestins en suspension dans 30 ml de HBSS glacé avec PIC. Si nécessaire, utilisez un grattoir stérile pour aider à la remise en suspension intestinale.

Centrifuger à 500 g. Retirer le surnageant et répéter le processus de lavage trois fois. Remettre les cellules intestinales en suspension dans 10 ml de DMEM, 2 % de FCS, 5 millimolaires d’EDTA, un millimolaire de TCEP et de PIC.

Mélangez délicatement. Incuber pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius sous rotation lente à l’aide d’un rouleau. Filtrez la suspension à travers une crépine de 250 microns.

Vortex le flux. Et filtrez à travers une crépine de 70 microns, recueillant le flux restant. Centrifuger la suspension.

Isolement de cellules épithéliales uniques à l’aide d’un gradient de Percoll. Vous aurez besoin des matériaux suivants. En filtrant à travers du papier pré-filtre AP15, préparez 40 % et 20 % de Percoll dans de l’eau Milli-Q.

Chargez une seringue stérile avec la solution Percoll. Appliquez-le sur le filtre et déchargez lentement le Percoll. Refroidissez à quatre degrés Celsius pendant une heure avant de superposer le dégradé.

Configurez la pompe péristaltique comme indiqué. À l’aide d’une pompe péristaltique réglée à la vitesse la plus basse, superposez trois mL de 40 % de Percoll dans un tube d’ultracentrifugation de 16 mL. Laissez-le reposer sur de la glace pendant 15 minutes.

La vitesse de la pompe doit conduire à un débit inférieur à un mL par minute. En inclinant le tube à un angle de 45 degrés, utilisez la pompe péristaltique pour superposer le Percoll 20 % sur la couche 40 %. Assurez-vous que le tube de sortie repose contre le tube de centrifugation pour éviter que les gouttelettes ne se mélangent aux couches inférieures.

La vitesse de la pompe doit conduire à un débit inférieur à un mL par minute. Laissez les couches se déposer sur la glace pendant 15 minutes. Utilisation de la pompe péristaltique à un débit inférieur à un mL par minute pour superposer trois mL de solution DMEM contenant les cellules épithéliales isolées sur le gradient de Percoll de 20 à 40 %.

Assurez-vous que le tube de sortie repose contre le tube de centrifugation pour éviter que les gouttelettes ne se mélangent aux couches inférieures, perturbant ainsi le gradient. Centrifuger à 600 g pendant 10 minutes. Collectez les interphases entre le DMEM, le gradient de Percoll de 20 % et les gradients de Percoll de 20 % et de Percoll de 20 % pour isoler les cellules épithéliales uniques.

Biotinylation des protéines de surface cellulaire et isolement des protéines de surface biotinylées. Vous aurez besoin des matériaux suivants. Biotinylate 100 microlitres de cellules épithéliales unicellulaires à l’aide du kit de conjugaison de biotine de type A selon les instructions du fabricant.

Ajoutez 100 microlitres de PBS, 1 % de Triton X-100, 10 % de glycérol, 100 micromolaires de glutathion oxydé et de PIC aux cellules biotinylées. Incuber sur glace pendant une heure en mélangeant doucement toutes les 10 minutes. Centrifugez l’extrait cellulaire à 20 000 g à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes et réservez.

Préparez 50 microlitres de billes magnétiques de streptavidine en les lavant avec 1 000 microlitres de TBS 1 %Tween-20. Mélangez doucement en effleurant avec votre doigt. Placez le tube dans un support magnétique, en recueillant les billes contre le côté du tube.

Retirez et jetez le surnageant. Combinez 300 microlitres de protéines de surface cellulaire biotinylées avec des billes magnétiques lavées. Incuber pendant deux heures à température ambiante avec agitation.

Récupérez les perles avec le support magnétique, retirez-les et jetez-les du surnageant. Ajoutez 300 microlitres de TBS 1 %Tween-20 dans le tube, en mélangeant doucement pour remettre les billes en suspension. Collectez des perles, retirez-les et jetez-vous du surnageant.

Répétez cette étape de lavage deux fois. Ajoutez 100 microlitres de glycine 1 molaire pH deux aux billes magnétiques. Et incuber à température ambiante pendant cinq minutes.

Prélever les billes et retirer le surnageant contenant des protéines de surface biotinylées éluées. La première figure est une représentation du protocole utilisé pour isoler les cellules épithéliales et leurs protéines de surface d’une tique entière. En utilisant ce protocole, environ 1,2 par 10 à sept cellules par ml avec une viabilité de 75 à 80 % et 20 à 24 microgrammes de protéines de surface biotinylées purifiées peuvent être purifiés à partir d’une dissection initiale de 50 tiques.

L’imagerie représentative en microscopie à fluorescence des cellules épithéliales des tiques préparées à l’aide de ce protocole est illustrée aux figures 2A et 2B. Les cellules se présentent sous la forme d’une morphologie de surface singulière, sphérique et lisse et d’une taille constante dans l’ensemble de l’échantillon. Les isolements médiocres sont visualisés comme contenant une dissociation incomplète des cellules épithéliales individuelles, avec des populations cellulaires variables identifiées par les différentes tailles et morphologies des cellules.

La contamination croisée par les protéines de l’hôte, figure 3A, peut être minimisée en rinçant adéquatement les intestins des tiques pour produire un gradient de Percoll blanc ou clair, figure 3B. La comparaison des protéines par SDS-PAGE, figure 4A, silver stain, figure 4B, dot blot, figure 5, et ELISA, figure six, indique que les méthodologies décrites ont réussi à purifier les protéines de surface biotinylées à partir de cellules épithéliales individuelles isolées des intestins de tiques Rhipicephalus microplus. En conclusion, les méthodes utilisées dans cette étude ont réussi à isoler des cellules épithéliales individuelles de l’intestin entier de Rhipicephalus microplus.

Des protéines de la surface des cellules épithéliales de Rhipicephalus microplus ont été obtenues pour une analyse et des études plus approfondies. Enfin, le protocole développé a démontré le rendement potentiel des cellules épithéliales individuelles de l’intestin de la tique et l’efficacité des protéines de surface biotinylées de la cellule. Le protocole développé peut être utilisé chez n’importe quelle espèce de tique d’importance économique dans le but d’étudier les interactions tique-hôte en étudiant la composition protéique membranaire de l’intestin.