Détection des Ligands oestrogéniques dans les produits de soins personnels à l’aide d’une levure oestrogène écran optimisé pour le laboratoire d’enseignement de premier cycle

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser un test de dépistage des œstrogènes chez la levure afin de quantifier les agonistes du récepteur humain des œstrogènes extraits de produits de soins personnels. Cette méthode peut aider à répondre à des questions importantes dans le domaine de la toxicologie, du trouble endocrinien et de l'écophysiologie, car elle permet de détecter et de quantifier les œstrogènes environnementaux présents dans l'eau, les aliments et les produits de soins personnels. Les principaux avantages de cette technique in vitro sont son faible coût, son utilisation répandue et sa capacité à fournir une excellente plateforme pour l'enseignement des compétences techniques en laboratoire.

La détection des œstrogènes environnementaux est essentielle car ils peuvent modifier la signalisation hormonale, en particulier durant le développement fœtal et les périodes de transition physiologique comme la puberté. Les parties les plus difficiles de cette méthode sont les calculs et l'analyse des données, que nous avons simplifiés en développant une application facile à utiliser. En outre, un pipetage précis est essentiel.

Ce protocole commence par la préparation des réactifs. Préparez les milieux de glucose et de galactose, les témoins véhicules contenant 50 % d'éthanol, ainsi que les étalons d'estradiol qui seront utilisés le premier jour du dosage, ainsi que le tampon LacZ, le dithiothrésitol et le carbonate de sodium pour le deuxième jour. Stérilisez les milieux de glucose et de galactose par filtration à travers un filtre de 0,2 micromètre.

Jusqu'à 23 produits d'hygiène personnelle différents, ou PPH, et des témoins d'extraction peuvent être testés en triplicat sur une seule plaque de 96 puits. Les PPH incluent le savon, la crème capillaire, le shampooing, la crème solaire, le maquillage, la crème à raser et la lotion. Aux fins du tournage, les échantillons seront préparés à partir de seulement huit PPH.

Combiner un gramme de chaque échantillon avec 10 millilitres d'éthanol anhydre dans un tube conique de 15 millilitres. En outre, préparer un témoin négatif d'extraction constitué de 11 millilitres d'éthanol anhydre dans un tube conique de 15 millilitres. Homogénéiser le contenu de chaque tube conique pendant 30 minutes par une combinaison d'agitation manuelle et de vortexage.

Faire centrifuger les tubes coniques à la vitesse maximale autorisée dans une centrifugeuse à godets pendant 10 minutes. Verser le surnageant de chaque tube à travers un filtre cellulaire de 40 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, transférer le contenu de chaque tube de 50 millilitres dans un flacon en verre pour scintillation.

Laisser l'éthanol s'évaporer complètement en laissant les flacons ouverts dans une hotte ventilée pendant une semaine. Protéger les échantillons en cours de séchage de la lumière afin d'éviter la dégradation des composés sensibles à la lumière. Une fois les échantillons secs, reconstituer chaque échantillon dans un millilitre d'éthanol à 50 %, puis vortexer pour homogénéiser.

Deux nuits ou environ 42 heures avant la préparation des plaques de test de l'œstrogène chez la levure (YES), utilisez une technique stérile pour sous-cultiver la levure en ajoutant 0,1 millilitre de chaque culture active de levure à 10 millilitres de milieu au glucose filtré et stérilisé dans un ballon Erlenmeyer stérile. Incubez à 30 degrés Celsius et poursuivez l'incubation des cultures initiales en tant que stocks. Deux jours plus tard, au jour un du test YES, utilisez une technique stérile pour diluer les cultures de levure en suspension et le milieu au galactose filtré et stérilisé dans un bécher stérile.

Confirmez la densité optique en pipetant 120 microlitres de chaque échantillon de levure en triple exemplique, ainsi que des témoins négatifs de milieu galactose en triple, dans une plaque en polystyrène transparente. Utilisez un spectrophotomètre de plaque pour vérifier que la culture de levure diluée présente une densité optique nette de 0,065 ± 0,005 à une longueur d'onde de 610 nanomètres. Déterminez la DO610 nette de la levure en soustrayant la DO610 des témoins négatifs de milieu galactose.

À l’aide d’une pipette répétitive munie d’une pointe stérile de seringue, ajouter la suspension de levure diluée dans les puits d’une microplaque stérile en polypropylène à 96 puits selon ce schéma de plaque. Pendant le pipetage, maintenir la levure en suspension dans le récipient source en agitant continuellement le bécher ou en mélangeant avec la pipette. Enfin, ajouter 120 microlitres de milieu de galactose stérilisé par filtration dans les puits H10 à H12, indiqués en vert sur le schéma de plaque, afin de servir de témoins du milieu, permettant ainsi de tenir compte des absorbances dues au milieu seul.

Préparez des plaques séparées pour chaque combinaison de souche de levure et de substrat calorimétrique à tester. Ensuite, construisez une courbe standard dans chaque plaque par dilution sériée selon la disposition de la plaque. Utilisez une pipette monocanal munie de pointes stériles pour ajouter cinq microlitres d'étalon d'estradiol dans les puits A2, A2 et A3. Utilisez une pipette multicanal pour mélanger le contenu des puits par aspiration et dispensation, puis transférez 205 microlitres des puits A1 à A3 vers les puits B1 à B3. Répétez le transfert de 205 microlitres jusqu'à la rangée G. Une fois la dilution sériée terminée, éliminez 205 microlitres des puits G1 à G3. À la fin de cette étape, tous les puits d'étalonnage doivent contenir 120 microlitres.

Ajoutez cinq microlitres d'éthanol à 50 % dans chaque puits témoin contenant la suspension de levures, les puits H1, H2 et H3, indiqués en bleu sur ce schéma de plaque. L'étape suivante consiste à ajouter des prélèvements ou des témoins négatifs d'extraction en triplicat de cinq microlitres dans les puits contenant la suspension de levures, indiqués en violet sur le schéma de plaque. Notez quels échantillons ou témoins d'extraction sont placés dans quels puits.

Pour garder une trace des puits contenant des échantillons et de ceux qui sont vides, commencez avec une boîte neuve de pointes et utilisez des pointes provenant des mêmes emplacements dans la boîte que les emplacements correspondants des puits dans la plaque. Mélangez le contenu des puits d'échantillon, de contrôle d'extraction et de contrôle de véhicule par pipetage. Ajustez les volumes de ces puits à 120 microlitres en retirant 205 microlitres de chacun.

Sceller chaque plaque avec un film adhésif stérile et poreux, étiqueter et incuber à 30 degrés Celsius pendant 17 heures. Après l'incubation de 17 heures, retirer les plaques de l'incubateur. Si les plaques ne peuvent pas être traitées immédiatement, les envelopper dans un film plastique et réfrigérer les plaques enveloppées à quatre degrés Celsius pendant six jours.

Lorsque vous êtes prêts à traiter les plaques, déballez-les. Utilisez une pipette multicanal pour mélanger le contenu de chaque rangée de puits, puis transférez 50 microlitres de suspension de levure de chaque puit vers le puit correspondant d'une plaque microlitre 96 puits en polystyrène transparent. Étiquetez la nouvelle plaque.

Pour éviter la contamination croisée entre les puits, utilisez des embouts de pipette neufs pour chaque puit, mais les embouts n'ont pas besoin d'être stériles. Dans une hotte, ajoutez 20 microlitres de DTT à une molaire à 20 millilitres de tampon LacZ décongelé et à température ambiante, afin d'obtenir une concentration finale de un millimolaire de DTT. Mélangez soigneusement le tampon LacZ.

À l’aide d’une pipette répétitive, ajoutez 200 microlitres de tampon LacZ contenant du DTT et soit du ONPG soit du CPRG dans tous les puits de la plaque en polystyrène, puis mesurez et enregistrez immédiatement la densité optique à 610 nanomètres de tous les puits à l’aide d’un lecteur de plaques. Répétez selon les besoins pour les plaques supplémentaires. Couvrez les plaques avec un couvercle et incubez-les à 30 degrés Celsius pendant les durées indiquées.

Lorsque l'incubation est terminée, retirez les plaques de l'incubateur. Utilisez une pipette répétitive pour ajouter 100 microlitres de carbonate de sodium dans chaque puits afin de bloquer la réaction de la bêta-galactosidase. Mesurez et enregistrez la densité optique à 405 nanomètres pour ONPG ou à 574 nanomètres pour CPRG de tous les puits à l’aide d’un spectrophotomètre pour plaques.

Un calcul des valeurs de LacZ peut être effectué à l’aide d’une application automatisée nécessitant l’installation de Java. Pour commencer, ouvrez l’application automatisée LacZ décrite en annexe un. Collez les mesures de densité optique à 405 nanomètres pour ONPG ou à 574 nanomètres pour CPRG de tous les puits, en utilisant une disposition de plaque identique à celle illustrée à la figure un.

Saisissez la durée d'incubation et les heures nécessaires au test pour produire une couleur, puis cliquez sur Suivant. Collez les mesures d'absorbance à 610 nanomètres pour tous les puits. Cliquez sur Soumettre pour afficher les résultats de LacZ.

Les résultats de LacZ peuvent être copiés à l'aide des commandes clavier et collés dans une feuille de calcul ou d'autres fichiers selon les besoins. Commencez cette analyse en ouvrant l'application en ligne d'analyse des données du test YES. Téléchargez un fichier de données au format CSV, tel que décrit dans le premier onglet.

Digitalisez la courbe standard de l'estradiol dans le deuxième onglet et estimez les paramètres de régression. Consultez les résultats du modèle de régression dans le troisième onglet, puis déterminez les valeurs interpolées sur l'axe des abscisses correspondant aux valeurs de LacZ des échantillons dans le quatrième onglet. Cliquez sur le cinquième onglet pour afficher les valeurs d'équivalent œstrogénique (EEQ) des échantillons.

Enfin, normalisez les valeurs EEQ par rapport à la masse initiale de l'échantillon, comme décrit dans le protocole textuel. Des exemples de courbes standards après une incubation de 17 heures de levures avec l'estradiol 17 bêta sont présentés ici. Pour les raisons exposées dans l'article, le CPRG est souvent un meilleur choix de substrat que l'ONPG.

Conformément aux observations précédentes, les tests réalisés avec des levures exprimant le récepteur ER bêta étaient plus sensibles de plus d'un ordre de grandeur que ceux utilisant des levures exprimant le récepteur ER alpha. Par conséquent, l'activité œstrogénique était plus fréquemment détectée avec les levures exprimant ER bêta. Un objectif supplémentaire de l'étude était d'évaluer des durées d'incubation compatibles avec l'emploi du temps d'un cours de laboratoire destiné aux étudiants du premier cycle universitaire.

Lorsqu'une période de réfrigération de six jours après l'incubation de 17 heures a été introduite, les courbes standards provenant des plaques réfrigérées étaient comparables à celles des plaques non réfrigérées. Les erreurs-types des paramètres estimés à l'aide de modèles de régression logistique à quatre paramètres étaient toutes plus faibles pour les plaques réfrigérées que pour les plaques non réfrigérées. Ainsi, la réfrigération des plaques pendant six jours réduit les erreurs et améliore la précision des estimations de l'EEQ.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à trois ou quatre séances de trois à quatre heures. Lors de la réalisation de la procédure, il est important de se rappeler d'appliquer une technique stérile pour toutes les étapes effectuées avant la période d'incubation de 17 heures, de pipeter avec soin et précision, et de suivre la disposition des puits présentée dans la figure un. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que des tests biologiques in vivo sur des animaux, peuvent être réalisées afin d'étudier d'autres mécanismes d'action des œstrogènes ainsi que leurs effets sur l'organisme entier.

Après son développement, le test de dépistage des œstrogènes chez la levure est devenu une méthode reconnue et peu coûteuse pour mesurer les ligands œstrogéniques dans des échantillons environnementaux tels que les aliments, les tissus végétaux et les produits de soins personnels. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser des extractions simples de produits de soins personnels, cultiver des levures, préparer des courbes de dilution étalons, effectuer le test YES dans une plaque de 96 puits et mener à bien les calculs associés. N’oubliez pas que manipuler l’estradiol peut présenter des risques extrêmement élevés, et que des précautions telles que le port de gants et d'autres équipements de protection individuelle, ainsi qu'une élimination appropriée des déchets, doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure.