Name: Itophorèse en temps réel avec du tétraméthylammonium pour quantifier la fraction de volume et la tortuosité de lespace extracellulaire du cerveau (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Découvrez l'iontophorèse en temps réel avec du tétraméthylammonium pour quantifier la fraction de volume et la tortuosité de l'espace extracellulaire cérébral. Cette méthode permet d'étudier les changements aigus réversibles de l'ECS.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Le travail a été soutenu par NIH NINDS subvention R01 NS047557.

<ol><li>Sykova, E., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+in+brain+extracellular+space%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Diffusion in brain extracellular space.</a> Physiol Rev. 88 (4), 1277-1340 (2008).</li>
<li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/230904011_Diffusion_and_related_transport_mechanisms_in_brain_tissue">Diffusion and related transport mechanisms in brain tissue.</a> Rep Prog Phys. 64 (7), 815-884 (2001).</li>
<li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-selective+microelectrodes+and+diffusion+measurements+as+tools+to+explore+the+brain+cell+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment.</a> J Neurosci Methods. 48 (3), 199-213 (1993).</li>
<li>Nicholson, C., Phillips, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+diffusion+modified+by+tortuosity+and+volume+fraction+in+the+extracellular+microenvironment+of+the+rat+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum.</a> J Physiol. 321, 225-257 (1981).</li>
<li>Nicholson, C., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+space+structure+revealed+by+diffusion+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extracellular space structure revealed by diffusion analysis.</a> Trends Neurosci. 21 (5), 207-215 (1998).</li>
<li>Xie, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+drives+metabolite+clearance+from+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sleep drives metabolite clearance from the adult brain.</a> Science. 342 (6156), 373-377 (2013).</li>
<li>Hrabetova, S., Nicholson, C. Biophysical properties of brain extracellular space explored with ion-selective microelectrodes, integrative optical imaging and related techniques. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Biophysical+properties+of+brain+extracellular+space+explored+with+ion-selective+microelectrodes%2C+integrative+optical+imaging+and+related+techniques">Electrochemical Methods for Neuroscience Neuroscience</a>. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC press. 167-204 (2007).</li>
<li>Rice, M. E., Okada, Y. C., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+and+heterogeneous+diffusion+in+the+turtle+cerebellum%3A+implications+for+volume+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Anisotropic and heterogeneous diffusion in the turtle cerebellum: implications for volume transmission.</a> J Neurophysiol. 70 (5), 2035-2044 (1993).</li>
<li>Vargova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+parameters+of+the+extracellular+space+in+human+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Diffusion parameters of the extracellular space in human gliomas.</a> Glia. 42 (1), 77-88 (2003).</li>
<li>Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-barreled+and+concentric+microelectrodes+for+measurement+of+extracellular+ion+signals+in+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Double-barreled and concentric microelectrodes for measurement of extracellular ion signals in brain tissue.</a> J Vis Exp. (103), (2015).</li>
<li>Xiao, F., Hrabetova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarged+extracellular+space+of+aquaporin-4-deficient+mice+does+not+enhance+diffusion+of+Alexa+Fluor+488+or+dextran+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enlarged extracellular space of aquaporin-4-deficient mice does not enhance diffusion of Alexa Fluor 488 or dextran polymers.</a> Neuroscience. 161 (1), 39-45 (2009).</li>
<li>Sherpa, A. D., Pvan de Nes,, Xiao, F., Weedon, J., Hrabetova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliotoxin-induced+swelling+of+astrocytes+hinders+diffusion+in+brain+extracellular+space+via+formation+of+dead-space+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Gliotoxin-induced swelling of astrocytes hinders diffusion in brain extracellular space via formation of dead-space microdomains.</a> Glia. 62 (7), 1053-1065 (2014).</li>
<li>Kume-Kick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independence+of+extracellular+tortuosity+and+volume+fraction+during+osmotic+challenge+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Independence of extracellular tortuosity and volume fraction during osmotic challenge in rat neocortex.</a> J Physiol. 542 (Pt 2), 515-527 (2002).</li>
<li>Saghyan, A., Lewis, D. P., Hrabe, J., Hrabetova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+diffusion+in+laminar+brain+structures+exemplified+by+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Extracellular diffusion in laminar brain structures exemplified by hippocampus.</a> J Neurosci Methods. 205 (1), 110-118 (2012).</li>
<li>Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+and+use+of+high-speed%2C+concentric+H%2B-+and+Ca2%2B-selective+microelectrodes+suitable+for+in+vitro+extracellular+recording%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophys%22%5BJournal%5D)">Fabrication and use of high-speed, concentric H+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording.</a> J Neurophys. 96 (2), 919-924 (2006).</li>
<li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+from+an+injected+volume+of+a+substance+in+brain+tissue+with+arbitrary+volume+fraction+and+tortuosity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Diffusion from an injected volume of a substance in brain tissue with arbitrary volume fraction and tortuosity.</a> Brain Res. 333 (2), 325-329 (1985).</li>
<li>Nicholson, C., Tao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hindered+diffusion+of+high+molecular+weight+compounds+in+brain+extracellular+microenvironment+measured+with+integrative+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Hindered diffusion of high molecular weight compounds in brain extracellular microenvironment measured with integrative optical imaging.</a> Biophys J. 65 (6), 2277-2290 (1993).</li>
<li>Thorne, R. G., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+diffusion+analysis+with+quantum+dots+and+dextrans+predicts+the+width+of+brain+extracellular+space%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo diffusion analysis with quantum dots and dextrans predicts the width of brain extracellular space.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (14), 5567-5572 (2006).</li>
<li>Wolak, D. J., Thorne, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+macromolecules+in+the+brain%3A+implications+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Diffusion of macromolecules in the brain: implications for drug delivery.</a> Mol Pharm. 10 (5), 1492-1504 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont pas d&#39;intérêts financiers concurrents.

<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55755/55755fig10.jpg" /> Figure 10: Données non idéales démontrant des problèmes techniques communs. (A) Les diagrammes de problèmes techniques communs avec iontophorèse microélectrodes: Comparaison de la libération normale de la TMA d&#39;un ionophorèse fonctionnement microélectrodes avec trois sources démontrant des problèmes techniques. [Agrandissement élevé, a1] Le courant dans une source iontophorétique idéale est por...

<html> L&#39;espace extracellulaire (ECS) est le réseau de canaux interconnectés extérieurs à toutes les cellules du cerveau et contient à la fois le fluide interstitiel et la matrice extracellulaire ( Figure 1a et Figure 1b ). La distribution de nombreuses substances requises pour la fonction des cellules cérébrales, y compris les nutriments, les hormones et les neurotransmetteurs, se produit par diffusion à travers le système ECS. Les changements dans les paramètres physiques de cet espace, y compris le volume, la géométrie et la matrice extracellulaire, peuvent influer drastiquement sur la diffusion à travers l&#39;ECS et les concentrations d&#39;ions locales qui se baignent dans les cellules du cerveau, ce qui a un impact profond sur la fonction des cellules cérébrales 1 , 2 . L&#39;iontophorèse en temps réel (RTI) est utilisée pour déterminer deux caractéristiques structurelles d&#39;une région du cerveau: fraction volumique et tortuosité 3 , 4 ,&quot;Xref&quot;&gt; 5. La fraction de volume ( α ) est la proportion de volume tissulaire occupée par ECS ( V ECS ) par rapport au volume tissulaire total ( tissu V ) dans un volume élémentaire représentatif; <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq1.jpg" /> La tortuosité ( λ ) est l&#39;obstacle relatif qu&#39;une substance rencontre lors de la diffusion dans une région du cerveau par rapport à un milieu sans obstruction; <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq2.jpg" /> Où D * (cm 2 s -1 ) est le coefficient de diffusion efficace de la substance dans le cerveau et D (cm 2 s -1 ) est le coefficient de diffusion libre de la substance dans un milieu libre, tel qu&#39;un gel d&#39;agarose dilué. Aujourd&#39;hui, la substance de sondes la plus utilisée pour le RLa méthode TI est le petit cation tétraméthylammonium (TMA). Le TMA a un poids moléculaire de 74 g / mol, se dissocie complètement en solution et a une charge positive. Les études de RTI avec cette ion ont démontré que α <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq3.jpg" /> 0,2 et λ <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq3.jpg" /> 1.6 1 , 2 . Cela signifie que l&#39;ECS représente environ 20% du volume total du cerveau et que la diffusion d&#39;une petite molécule inerte est environ 2,5 fois plus lente dans l&#39;ECS que dans un milieu sans obstruction 3 . Cependant, α et λ varient selon l&#39;âge, la région et l&#39;état du cerveau et dans les pathologies 1 . Les modifications de ces paramètres ont été liées au développement du cerveau, au vieillissement, au sommeil, à l&#39;épilepsie et à de nombreux autres processus et maladies fondamentales du cerveau 1, 6 . Alors que d&#39;autres techniques mesurent α et λ , RTI peut mesurer à la fois dans les régions localisées du tissu vivant en temps réel. Pour cette raison, RTI est devenu un outil indispensable pour étudier les changements dans α et λ lors de défis aigus et réversibles. La théorie de RTI a été initialement validée par Nicholson et Phillips, et la technique a été largement utilisée depuis cette époque 4 , 7 . Les expériences utilisant RTI commencent par la libération d&#39;une impulsion de TMA à partir d&#39;une microélectrode source par iontophorèse dans un gel dilué d&#39;agarose. Une fois éjectés, les ions diffusent librement loin de la source ponctuelle, en choisissant d&#39;un nombre potentiellement infini de chemins aléatoires ( figure 1d ). La concentration changeante de l&#39;ion est mesurée au fil du temps à l&#39;aide d&#39;une microélectrode sélective d&#39;ions (ISM) positionnée à peu près100 μm loin ( Figure 1c ). Les changements dans la concentration de TMA sont représentés graphiquement et ajustés à une courbe qui permet le calcul de D et du nombre de transport de la microélectrode d&#39;iontophorèse (paramètres discutés dans le protocole). Avec ces valeurs, la procédure est répétée dans une région du cerveau d&#39;intérêt pour obtenir D * et pour calculer α et λ . Le contrôle de la microélectrode d&#39;iontophorèse, la collecte de données, la représentation graphique et l&#39;ajustement de la courbe de concentration de TMA et le calcul des paramètres expérimentaux sont généralement réalisés par les programmes Wanda et Walter, spécialement conçus à cet effet (le logiciel et leurs manuels sont Librement disponible auprès des auteurs sur demande). La section Protocole de cette revue décrit les procédures de base nécessaires à la conception et à l&#39;exécution de RTI dans les tranches de cerveau de rongeurs. La technique a également été utilisée en non-tigemodèles ent, notamment des tranches de cerveau humain et in vivo des préparations de cerveau 1, 4, 6, 8, 9. La section Résultats représentatifs fournit des résultats idéaux et non idéaux pour mettre en évidence les nuances de l&#39;interprétation des données. Enfin, la section de discussion couvre brièvement les techniques de dépannage, les limitations de RTI, les techniques alternatives utilisées pour étudier l&#39;ECS et les applications futures de RTI. <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55755/55755fig1.jpg" /> Figure 1: Diagrammes de diffusion à travers ECS. (A) Schéma d&#39;ECS: Démontre la taille et l&#39; emplacement de l&#39;ECS dans une section typique du cerveau. Yellow marque le ECS entre les processus des cellules du cerveau gris. Le volume de l&#39;ECS est d&#39;environ 20% du volume tissulaire total ( c.-à-d., Fraction de volume = 0.2) dans des conditions physiologiques. ( B ) Diagramme agrandi de l&#39;ECS: met en évidence des paramètres physiques contribuant à la tortuosité, y compris la géométrie des cellules du cerveau (gris) et la matrice extracellulaire (diagrammes sous forme de maille de glycosaminoglycanes multicolores et de protéoglycans). ( C ) diagramme 3D de diffusion à partir d&#39;une source ponctuelle: démontre le mouvement net des molécules inertes d&#39;une source iontophorétique à un ISM. À l&#39;exclusion des barrières de diffusion et de l&#39;absorption cellulaire, les molécules diffusent vers l&#39;extérieur dans toutes les directions, produisant un front de concentration sphérique. L&#39;ISM quantifie la concentration locale des molécules inertes libérées par la source iontophorétique. ( D ) Simulation par ordinateur de la diffusion dans ECS du cerveau: [Extrême gauche] Configuration pour la simulation de Monte Carlo; Les sphères vertes représentent les processus des cellules du cerveau et la croix rouge représente une source ponctuelle. Cette configuration modélise le tissu cérébral diagramme de la figure 1a . [Images du milieu] 3 et6 molécules effectuant des mouvements aléatoires lorsqu&#39;elles se diffusent à travers l&#39;espace extracellulaire du cerveau, montrées en 2 dimensions. [Extrême droite] Des randonnées aléatoires de nombreuses molécules sorties de la source ponctuelle. Le mouvement net de toutes les molécules de la source ponctuelle est vers l&#39;extérieur comme représenté sur la figure 1c . Les randonnées aléatoires cumulatives décrivent les espaces entre les cellules ( c.-à -d. ECS, voir la référence 5 pour plus d&#39;explications). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55755/55755fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

<table><tbody><tr><td>Convertisseur A/N et N/A</td><td>National Instruments Corporation</td><td>NI USB-6221 DAQ</td><td>Le NI USB-6221 est toujours vendu en tant que périphérique « hérité » par NI. Ils recommandent d’utiliser les DAQ NI USB-6341 de la série X pour les nouvelles installations, mais nous n’avons pas testé les unités les plus récentes. Nous décrivons l’utilisation du NI USB-6221 avec MATLAB et Windows 7 (32 bits). Alternatives : le convertisseur A/N PCI-MIO-16E-4 beaucoup plus ancien (utilisé sous Windows XP ou ancien système d’exploitation uniquement) avec panneau de connexion BNC BNC-2090 et câble SH68-68-EP. Comme indiqué dans le manuel Wanda, un programme MATLAB expérimental permettant d’utiliser les fichiers binaires Axon est disponible.</td></tr><tr><td>agarose</td><td>Lonza</td><td>NuSieve GTG Agarose #50081</td><td>pour préparer un gel d’agarose dilué pour les mesures RTI</td></tr><tr><td>amplificateur pour ISM</td><td>Dagan</td><td>Modèle IX2-700 Amplificateur de</td><td>tension ionique et de référence à double préamplificateur avec N=0.1 (pour le canon de référence) et N=0.001 (pour le baril d’ions)</td></tr><tr><td>Miscroscope de composé biologique (avec objectif 4x et 10x)</td><td></td><td></td><td>pour ébrécher les pointes des microélectrodes et inspecter les microélectrodes ; divers fournisseurs, e.g. AmScope</td></tr><tr><td>borosilicate thêta tube en verre capillaire</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Warner Instruments modèle TG200-4 ; commande #64-0811</td><td>tube en verre à double canon pour microélectrodes sélectives d’ions et microélectrodes iontophorétiques ; D.E. 2,0 mm, D.I. 1,4 mm, septum 0,2 mm, longueur 10 cm</td></tr><tr><td>brosse</td><td>Winsor & Newton</td><td>University Series 233, taille 0</td><td>brosse ronde à manche shoft, disponible sur Amazon</td></tr><tr><td>bec bunsen</td> Caméra <td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pour la visualisation de micropipettes</td><td>Olympus</td><td>OLY-150</td><td>nécessite un moniteur, le filtre IR sur l’illuminateur de sous-platine est</td></tr> un <tr><td>enregistreur</td><td></td><td></td> <td>graphique en optionenregistrer en continu les tensions sur une microélectrode sélective d’ions pendant l’étalonnage dans des étalons de tétraméthylammonium et pendant l’expérience RTI ; par ex. Kipp & Zonen type BD112 dual-cannel graphique enregistré, disponible remis à neuf</td></tr><tr><td>chlorotriméthylsilane, puriss., > 99 %</td> catalogue <td>Sigma-Aldrich</td><td># 92360</td><td>pour silanisation ; ATTENTION : inflammable, toxicité aiguë (orale, cutanée, inhalation), corrosion cutanée, lésions oculaires, réagit violemment avec l’eau, voir les informations de sécurité Sigma-Aldrich pour une description complète</td></tr><tr><td>Logiciel commercial</td><td>The MathWorks</td><td>MATLAB, Boîte à outils d’acquisition de données</td><td>pour l’acquisition et l’analyse de données à l’aide des programmes Wanda et Walter. Notez qu’une licence académique est disponible.</td></tr><tr><td>lunettes de protection oculaire</td><td>Le</td> microscope composé à platine fixe Fisher <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>peut utiliser d’autres microscopes composés avec pince à platine fixe</td></tr><tr><td></td><td>Outils de science fine #</td><td>11251-10</td><td>pour ébrécher le capillaire en verre ; Dumond #5, de préférence utilisé et n’est plus nécessaire pour le travail fin</td></tr><tr><td>Hotte</td><td></td><td></td><td>pour la silanisation et le remplissage de l’extrémité du baril sélectif d’ions avec un échangeur d’ions liquides ; divers supliers, par exemple Captair avec filtre approprié vendu par Erlab</td></tr><tr><td>lame de microscope en verre</td><td>Fisher</td>#<td>12-550A</td><td>à puce pointes de microélectrode</td></tr><tr><td>chauffant/agitateur</td><td>Fisher</td><td>Corning PC-420D</td><td>pour préparer des solutions d’agrose diluée et agiter</td></tr><tr><td>l’unité iontophorétique</td><td>Dagan</td><td>ION-100 et PS-100</td><td>ION-100 est une unité d’ionophorèse monocanal de conformité +/- 130 V ; Le PS-100 est une alimentation externe ; alternatives : par exemple Axoprobe-1A fabriqué par Axon Instruments (maintenant Molecular Devices), hors production, vérifier la disponibilité des unités remises à neuf (eBay et autres sites)</td></tr><tr><td>échangeur d’ions liquides (LIX) pour</td><td>l’échangeur d’ions potassium World Precision Instruments IE190</td><td></td><td>Remarque : cela équivaut à l’échangeur de potassium Corning d’origine 477317 à base de tétraphénlyborate - ne pas confondre avec l’échangeur de potassium à support neutre provenant du laboratoire du Dr Simon, ETH, Zurich, qui ne détecte pas le tétraméthylammonium, et qui est vendu par Fluka. Vous pouvez également fabriquer vous-même un échangeur d’ions liquides pour le tétraméthylammonium : 3 % en poids de tétrakis de potassium = borate de (p-chlorophényle) dissous dans du 2,3-diméthylnitrobenzène. Achetez des produits chimiques chez Fluka (qui fait maintenant partie de Sigma). Voir Oehme et Simon (1976) Anal. Chim. Acta 86, 21-25 ; ATTENTION : Les propriétés toxicologiques de cet échangeur d’ions liquides n’ont pas été entièrement déterminées. L’ingestion ou le contact avec le corps humain peut être nocif. Faites preuve de prudence ! Les échangeurs d’ions liquides doivent être stockés dans un endroit frais, à l’abri de la lumière directe du soleil.</td></tr><tr><td>porte-microélectrode</td><td>WPI</td><td>M3301EH</td><td>pour maintenir le préfabriqué de microélectrode sélectif d’ions pour la silanisation et le remplissage de l’extrémité du baril sélectif d’ions avec un échangeur d’ions liquides ; WPI vend deux versions de ce support, M3301EH transparent et M3301EH noir. D’après notre expérience, le M3301EH clair semble être plus solide que le M3301EH noir.</td></tr><tr><td>micromanipulateur</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td>pour positionner la préfabrication de microélectrodes sélectives d’ions lors de la silanisation et du remplissage de l’extrémité du baril sélectif d’ions avec un échangeur d’ions liquides ; peut être remplacé par n’importe quel micromanipulateur à trois axes en bon état de fonctionnement</td></tr><tr><td>extracteur de micropipettes</td><td>Sutter Instruments</td><td>Modèle P-97</td><td>pour tirer des tubes en verre à double canon ; d’autres extracteurs peuvent être utilisés tant qu’ils peuvent accueillir un thermomètre à microsonde à tube de verre à double canon de grand diamètre</td></tr>, modèle <tr><td></td><td>Physiotemp</td>, <td>BAT-12R</td>, <td>la sonde fine de ce thermomètre est placée près du site d’enregistrement</td></tr><tr><td>, aiguille,</td><td>BD</td>, <td>seringues et aiguilles # 305122 (calibre 25)</td> <td>pour la silanisation ; Aiguilles BD PrecisionGlide 25 G x 5/8 po (0,5 mm x 16 mm)</td></tr><tr><td>objectif 5X sec</td><td>Olympus</td><td>MPlan N</td><td></td></tr><tr><td>objectif 10X immersion dans l’eau</td><td>Olympus</td><td>UMPlan FL N</td><td>10X objectif est immergé dans l’eau, l’ouverture numérique est de 0,3, la distance de travail est de 3,3 mm</td></tr><tr><td>Récipients en plastique (avec couvercles)</td><td>Fisher</td><td>#14-375-148</td><td>pour stocker des solutions étalons de tétraméthylammonium et des microélectrodes</td></tr><tr><td>plate-forme et platine de translation x-y pour microscope à platine fixe</td> La plate-forme <td>EXFO</td><td>Gibraltar Burleigh</td><td>maintient la chambre de coupe, les micromanipulateurs et les accessoires, la platine de translation x-y déplace le microscope sans compromettre la stabilité de l’enregistrement</td></tr><tr><td>Minicup</td><td></td><td></td> poreuse <td>pour les mesures RTI dans un gel d’agarose dilué ; adhésif réutilisable fait maison</td></tr><tr><td></td><td>Bostik</td><td>Blu-Tack</td><td>pour fixer les microélectrodes au récipient de maintien et à d’autres utilisations ; divers fournisseurs, disponibles auprès d’Amazon</td></tr><tr><td>micromanipulateur robotique avec positionnement précis x, y, z</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td>deux micromanipulateurs sont nécessaires pour tenir séparément la microélectrode sélective d’ions et la microélectrode iontophorétique. Il est également possible de coller des micropipettes dans un réseau espacé (voir texte).</td></tr><tr><td>Unité de conditionnement de signal avec filtre passe-bas</td><td>Axon Instruments</td><td>CyberAmp 320 ou 380</td><td>n’est plus disponible chez le fabricant mais peut être disponible chez E-Bay ; alternatives : par exemple Filtre/Amplificateur FLA-01 de Cygnus Technology. Il s’agit d’un instrument monocanal avec une coupure minimale à 10 Hz à l’aide d’un filtre de Bessel multipolaire, mais l’entreprise peut être disposée à le modifier pour une fréquence de coupure plus basse (2 Hz) si nécessaire.</td></tr><tr><td>fil d’argent</td><td>A-M Systems</td><td>#7830</td><td>diamètre 0,015", chambre de tranche nue (sans revêtement)</td></tr> <tr><td></td><td>Harvard Apparatus</td><td>Warner Modèle RC-27L</td><td>il s’agit d’une chambre de coupe par immersion ; ne pas utiliser</td></tr><tr>de<td>stéréomicroscope</td><td></td><td></td> à chambre de coupe d’interface <td>pour la silanisation et le remplissage de l’extrémité du baril sélectif d’ions avec un échangeur d’ions liquides ; monté horizontalement ;</td></tr><tr><td>divers fournisseurs seringue, 10 mL</td><td></td><td>Seringues et aiguilles BD #309604</td><td>pour le remplissage des microélectrodes et pour la silanisation ; BD Luer-Lok tip</td></tr><tr><td>seringue filtre 0.22 &micro ; m pore</td><td>Whatman</td><td>#6780-1302</td><td>pour filtrer les solutions de remblayage ; disponible à partir de l’aiguille de</td></tr><tr><td>seringue Fisher, calibre 28, 97 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>MicroFil MF28G-5</td><td>pour remplir les microélectrodes</td></tr><tr><td>Tube en téflon (=PTFE) Alimentation</td><td>des composants</td><td>Paroi lumineuse du tube en PTFE STT-28 (calibre 28)</td><td>pour la silanisation d’un canon sélectif d’ions ; s’adapte aux aiguilles BD PrecisionGlide de 25 G x 5/8 po. Remarque : Le téflon est essentiel, les tubes en PVC fondraient à la cire chaude.</td></tr><tr><td>système de contrôle de la température</td><td>Harvard</td><td>Apparatus Warner Models TC-344B et SH-27A</td><td>TC-344B est un régulateur de température automatique double, SH-27A est un réchauffeur en ligne ; le régulateur et le réchauffeur fonctionnent avec des chambres de coupe Warner chlorure de</td></tr><tr><td>tétraméthyammonium (TMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-3411</td><td>5 M solution ; ATTENTION : toxicité aiguë (orale, cutanée, inhalation), cancérogénicité, dangereux pour l’environnement aquatique, voir Sigma-Aldrich Informations de sécurité pour une description complète</td></tr><tr><td>microtome à lame vibrante</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td>pour couper les tranches de cerveau</td></tr><tr><td>xylènes</td><td>Fisher</td><td>X5-1</td><td>pour la silanisation ; ATTENTION : inflammable, toxicité aiguë (orale, cutanée, inhalation), corrosion cutanée, lésions oculaires, cancérogénicité, voir les informations de sécurité Fisher pour une description complète</td></tr></tbody></table>

itophorèse en temps réel avec du tétraméthylammonium pour quantifier la fraction de volume et la tortuosité de l&#39;espace extracellulaire du cerveau

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

Cette revue décrit les concepts et le protocole de base pour effectuer la méthode de l&#39;iontophorèse en temps réel (RTI), l&#39;étalon-or pour explorer et quantifier l&#39;espace extracellulaire (ECS) du cerveau vivant. L&#39;ECS entoure toutes les cellules du cerveau et contient à la fois du liquide interstitiel et de la matrice extracellulaire. Le transport de nombreuses substances requises pour l&#39;activité du cerveau, y compris les neurotransmetteurs, les hormones et les nutriments, se produit par diffusion à travers l&#39;ECS. Les changements dans le volume et la géométrie de cet espace se produisent au cours des processus cérébrales normaux, comme le sommeil, et les pathologies, comme l&#39;ischémie. Cependant, la structure et la régulation des ECS du cerveau, en particulier dans les états malades, restent largement inexplorées. La méthode RTI mesure deux paramètres physiques du cerveau vivant: fraction volumique et tortuosité. La fraction de volume est la proportion de volume tissulaire occupée par ECS. La tortuosité est une mesure de l&#39;obstacle relatif qu&#39;une substance rencontre lors de la diffusion à travers un cerveauPar rapport à un milieu sans obstruction. Dans RTI, une molécule inerte est pulsée à partir d&#39;une microélectrode source dans l&#39;ECS du cerveau. Au fur et à mesure que les molécules se diffusent loin de cette source, la concentration changeante de l&#39;ion est mesurée au fil du temps en utilisant une microélectrode sélective d&#39;ions positionnée à environ 100 μm. A partir de la courbe de diffusion résultante, on peut calculer la fraction de volume et la tortuosité. Cette technique a été utilisée dans des tranches de cerveau provenant d&#39;espèces multiples (y compris les humains) et in vivo pour étudier des modifications aiguës et chroniques à ECS. Contrairement à d&#39;autres méthodes, RTI peut être utilisé pour examiner à la fois des modifications réversibles et irréversibles de l&#39;ECS du cerveau en temps réel.

L&#39;utilité de la technique RTI est démontrée dans une expérience conçue pour mesurer les changements dans α et pendant un défi hypoosmolaire ( Figure 8 et Figure 9 ). Il a déjà été démontré que la réduction de l&#39;osmolarité de l&#39;ECS par lavage sur ACSF hypotonique produirait une diminution de α et une augmentation de λ 13 . <p class="jove_content" fo:keep-together....

Ce protocole décrit l&#39;iontophorèse en temps réel, une méthode qui mesure les paramètres physiques de l&#39;espace extracellulaire (ECS) des cerveaux vivants. La diffusion d&#39;une molécule inerte libérée dans l&#39;ECS est utilisée pour calculer la fraction de volume ECS et la tortuosité. Il est idéal pour étudier les modifications réversibles aiguës des ECS du cerveau.

Itophorèse en temps réel avec du tétraméthylammonium pour quantifier la fraction de volume et la tortuosité de l&#39;espace extracellulaire du cerveau

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

L’objectif global de cette procédure est de quantifier la fraction volumique et la tortuosité de l’espace extracellulaire dans le tissu cérébral. Cette méthode répond à des questions clés concernant la relation entre l’espace extracellulaire et la physiologie et la maladie. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet la caractérisation en temps réel de deux paramètres importants de l’espace extracellulaire.En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car la microélectrode iontophorétique a tendance à changer de propriétés pendant les expériences et nécessite souvent un dépannage pendant les expériences. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car la manipulation précise d’une microélectrode sélective d’ions, une électrode iontophorétique sur plusieurs étapes, est nécessaire pour obtenir un enregistrement réussi. Pour commencer cette procédure, faites passer l’ACSF contenant du tétraméthylammonium, ou TMA, à travers la chambre d’immersion à raison de deux millilitres par minute.Réglez le régulateur de température à la température souhaitée et faites buliser l’ACSF avec 95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone pendant la durée de l’expérience. Ensuite, montez l’électrode de terre sur un support et immergez son extrémité dans l’ACSF qui traverse la chambre d’immersion. Ensuite, remplissez la coupelle poreuse avec 0,3 % d’agarose contenant du TMA préparé précédemment et placez-la dans la chambre d’immersion.Maintenant, fixez une microélectrode d’ionophorèse au porte-pipette d’un micromanipulateur. Connectez le fil de la microélectrode d’ionophorèse à l’étage de tête de l’unité d’ionophorèse. Ensuite, fixez un ISM calibré au deuxième micromanipulateur et connectez l’ISM à ses étages supérieurs.Ensuite, allumez l’ordinateur contenant les programmes Wanda et Walter. Dans l’interface graphique de Wanda, cliquez sur Calibrer. Ensuite, dans la zone Étalonnage, renseignez les tensions mesurées lors de l’étalonnage ISM et cliquez sur Données d’ajustement.Ensuite, cliquez sur Accepter dans la zone Calibrer pour transférer automatiquement la pente et les interférences générées vers l’interface graphique principale. Sur le côté gauche de l’interface graphique, assurez-vous que tous les paramètres expérimentaux sont définis dans les entrées correspondantes. Ensuite, placez une sonde de température dans la tasse de gélose.Enregistrez la température mesurée dans l’entrée Température de la boîte Électrode de mesure de l’interface graphique. Ensuite, abaissez les microélectrodes à au moins 1 000 micromètres de profondeur dans l’agarose et centrez-les dans la tasse. Visualisez-les au microscope à l’aide d’un objectif 10X.Sur l’amplificateur à deux canaux, déplacez manuellement le connecteur de la voie ISM vers la sortie de soustraction de tension pour régler la soustraction entre les voies de référence et ISM. Centrez les pointes les unes sur les autres dans les trois axes directionnels. Ensuite, mettez à zéro les positions relatives des deux microélectrodes sur les boîtiers de commande du micromanipulateur et assurez-vous que les microélectrodes sont centrées avec précision et exactitude.Ensuite, éloignez l’ISM de 120 micromètres de la microélectrode d’ionophorèse dans un axe. Ensuite, démarrez un enregistrement en cliquant sur Acquérir dans l’interface graphique et laissez le programme s’exécuter pour un enregistrement complet. Dans cette procédure, ouvrez le programme Walter sur l’ordinateur.Dans le menu Aucun enregistrement depuis, cliquez sur le bouton Wanda Voltoro pour lire les enregistrements générés par Wanda. Dans la fenêtre contextuelle suivante, sélectionnez un ou plusieurs enregistrements à lire et cliquez sur Ouvrir. Dans le menu Excel One Write, cliquez sur la feuille 1.3 et suivez les invites jusqu’à ce que les enregistrements soient automatiquement représentés graphiquement.Pour commencer la procédure d’ajustement, dans le menu Deux options, cliquez sur le bouton de sélection d’enregistrement. Ensuite, dans la fenêtre contextuelle de la figure deux, utilisez la souris pour déplacer le réticule sur le premier enregistrement à traiter et appuyez sur l’un des boutons de la souris pour choisir l’enregistrement. Après cela, cliquez sur ajuster la courbe dans le menu et utilisez au moins 20 itérations d’ajustement pour obtenir un ajustement précis des données.Ensuite, sélectionnez tout pour ajuster tous les points de données, puis sélectionnez Continuer. Le programme s’adaptera à la courbe affichée. Ensuite, sélectionnez l’option permettant d’écrire le résultat dans le tableur approprié en cliquant sur Excel dans le menu des sept résultats.Nommez le fichier Excel. Notez et enregistrez les données générées qui seront utilisées pour déterminer la fonctionnalité de la microélectrode d’ionophorèse. Si la microélectrode d’ionophorèse est jugée appropriée pour l’expérience, notez le nombre moyen de transport de tous les essais dans le champ TransportNum end de l’interface graphique Wanda.Dans cette procédure, placez une tranche de cerveau de 400 micromètres d’épaisseur dans la chambre d’enregistrement en veillant à ce qu’elle soit complètement immergée dans l’ACSF en écoulement. Ensuite, déplacez la microélectrode d’ionophorèse et l’ISM au-dessus du champ d’intérêt sur la tranche de cerveau. Immergez les deux électrodes dans l’ACSF fluide, mais au-dessus de la tranche.Ensuite, décalez la tension pour les canaux de référence et de détection ionique à zéro millivolts. Attendez que la tension dans les deux canaux se stabilise. Sur l’enregistreur, marquez la tension mesurée sur le canal de détection ionique de l’ISM.Ensuite, placez les microélectrodes ISM et ionophorèse à 200 micromètres de profondeur dans la tranche et à 120 micromètres les unes des autres. Calculez la différence de tension entre les signaux TMA mesurés dans l’ACSF en flux et dans le cerveau et entrez cette valeur dans le champ Baseline Volt Millivolt dans la boîte Measuring Electrode de l’interface graphique Wanda. Sur le côté gauche de l’interface graphique, assurez-vous que tous les paramètres expérimentaux sont correctement saisis.Démarrez l’enregistrement en cliquant sur Acquérir et autorisez-le à prendre un enregistrement complet. Après avoir retiré les deux microélectrodes de la tranche, utilisez l’enregistreur graphique pour déterminer tout changement entre la tension mesurée maintenant et sa mesure d’avant. Pour analyser les enregistrements du cerveau, répétez les procédures d’analyse des données d’agarose à l’aide du programme Walter.Écrivez les données dans le tableur en cliquant sur Excel dans le menu Walter. Ensuite, notez la fraction volumique du SEC cérébral, la tortuosité du SEC cérébral et la clairance non spécifique. Pour vérifier le numéro de transport, prenez de nouveaux enregistrements dans agarose et répétez les procédures dans le programme Walter pour obtenir le numéro de transport.Inspectez la feuille de calcul et vérifiez si le numéro de transport a changé de plus de 10 % par rapport au numéro de transport obtenu avant les mesures cérébrales. Si c’est le cas, les données obtenues avec la microélectrode iontophorétique ne sont pas fiables. Le nombre de transport mesuré dans cette étape doit correspondre étroitement à celui obtenu avant les mesures cérébrales, sinon la fraction volumique ne peut pas être considérée comme précise.Utilisez les données d’étalonnage ISM nouvellement obtenues comme entrée dans la boîte d’étalonnage Wanda et vérifiez que la valeur de pente diffère de moins de 10 % par rapport à l’étalonnage précédent. Voici les données représentatives d’un seul essai obtenu en gélose démontrant la courbe de concentration de la TMA. Et il s’agit d’une courbe ajustée obtenue à partir du traitement des données dans Walter.Le chevauchement des données dans la courbe ajustée démontre que l’ajustement de la courbe effectué par Walter modélise avec précision la diffusion dans cet essai. Voici le tableau des mesures de gélose avant expérimentation dans le cerveau. Voici un résumé des mesures prises dans une tranche de cerveau de souris dans les conditions de contrôle et expérimentales.L’alpha a diminué lors d’un test de provocation hypoosmolaire tandis que la tortuosité a augmenté comme prévu. Alpha a dépassé les valeurs de contrôle dans les conditions de récupération. Et voici le tableau des mesures d’agra après expérimentation dans le cerveau.Les nombres moyens de transport avant et après l’expérience étaient à moins de 10 % l’un de l’autre, ce qui indique que les valeurs enregistrées dans le cerveau étaient fiables. Une fois maîtrisée, cette procédure peut être réalisée en 14 heures sur deux jours. Le premier jour, les ISM sont fabriqués et calibrés.Le deuxième jour, les ISM sont recalibrés et une ionophorèse en temps réel est effectuée. Lors de cette procédure, il est important d’être précis dans l’espacement de vos électrodes. Deuxièmement, il est important de n’accepter une expérience que si le nombre de transport de la microélectrode iontophorétique reste stable tout au long de l’expérience.Suite à cette procédure, qui caractérise la diffusion de petits cations dans l’espace extracellulaire, vous pouvez passer à d’autres techniques comme la méthode d’imagerie optique intégrative qui vous permet de répondre à la question de savoir comment les grosses micromolécules se déplacent dans l’espace extracellulaire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer la méthode d’ionophorèse en temps réel pour quantifier le volume de l’espace extracellulaire du cerveau et la tortuosité dans le cerveau vivant en santé et en maladie. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

real-time-iontophoresis-with-tetramethylammonium-to-quantify-volume

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

La vidéo démontre la dynamique de concentration en ions potassium évoquée lors de la stimulation électrique de tranches de cerveau d’hippocampe coronal de souris. Une électrode de stimulation bipolaire est insérée dans la couche radiale de la région CA3 de l’hippocampe, et une électrode sélective potassium-ion est placée dans la couche radiatum CA1. La stimulation électrique provoque un potentiel d’action, entraînant la libération d’ions potassium. Enfin, l’absence de réponse ionique potassium...

Mesure de la dynamique de concentration en ions potassium évoqués dans des coupes d’hippocampe coronal

Cette vidéo montre comment caractériser l’espace extracellulaire dans une tranche de cerveau en utilisant des microélectrodes sélectives d’ions et d’ionophorèse pour mesurer et comparer les signaux électriques. Ce processus permet de déterminer la fraction volumique de l'espace et le degré de torsion.

Caractérisation de l’espace extracellulaire dans une tranche de cerveau à l’aide de microélectrodes sélectives d’ions et d’ionophorèse

Source : Moye, S. L., et.al.  Visualisation de la morphologie des astrocytes à l’aide de l’ionophorèse jaune de Lucifer. J. Vis. exp. (2019).  Cette vidéo montre l’utilisation de l’ionophorèse fluorescente pour étudier la morphologie des astrocytes dans des tranches de cerveau fixes. Il détaille le perçage du soma astrocytaire avec une électrode pour délivrer un colorant anionique et hydrophile dans le cytoplasme sous un courant à basse tension, permettant au colorant de diffuser et de marquer...

Visualisation de la morphologie des astrocytes à l’aide de l’ionophorèse d’un colorant fluorescent dans une tranche de cerveau de souris fixe

Dans cet article, nous introduisons rapide micro-iontophorèse de neurotransmetteurs comme une technique pour étudier l'intégration des signaux post-synaptiques avec une grande précision spatiale et temporelle.

Rapide Micro-iontophorèse de glutamate et le GABA: un outil utile d&#39;étudier l&#39;intégration synaptique

Nous démontrons la fabrication, l’étalonnage et les propriétés de deux types de microélectrodes sélectives d’ions (à double canon et concentrique) pour la mesure des concentrations d’ions dans le tissu cérébral. Ceux-ci sont ensuite utilisés dans la préparation de la coupe de l’hippocampe de souris pour montrer que l’activité excitatrice modifie les concentrations extracellulaires de potassium et de sodium.

Microélectrodes à double canon et concentrique pour la mesure de signaux extracellulaires Ion dans le tissu cérébral

Nous présentons des méthodes de construction d’électrodes pour enregistrer simultanément l’activité neuronale extracellulaire et libérer plusieurs substances neuroactives au voisinage des sites d’enregistrement chez les souris éveillées. Cette technique permet l’analyse détaillée des entrées synaptiques locales présumées vers le neurone d’intérêt.

Extracellulaires enregistrement de l&#39;activité neuronale Combiné avec Microiontophoretic Application des substances neuroactifs chez la souris Awake

Nous décrivons ici une méthode pour en vivo microdialyse analyser le communiqué de l’aspartate et du glutamate dans l’hippocampe ventral de rats épileptiques et non-épilepsie, en combinaison avec des enregistrements EEG. Les concentrations extracellulaires de l’aspartate et le glutamate peuvent être corrélées avec les différentes phases de la maladie.

Microdialyse d’acides aminés excitateurs durant les enregistrements EEG en se déplaçant librement des Rats

Cet article décrit une méthode simple pour préparer des petits cerveaux animaux pour l’imagerie micro-CT, dont les lésions peuvent être quantifiées et électrodes situés avec une grande précision dans le cadre de tout le cerveau.

Une méthode à base de Micro-CT pour caractériser les lésions et la localisation des électrodes dans le cerveau Animal petit

Les astrocytes sont des cellules morphologiquement complexes, illustrées par leurs multiples processus et territoires touffus. Pour analyser leur morphologie élaborée, nous présentons un protocole fiable pour exécuter l'iontophoresis jaune intracellulaire de Lucifer dans le tissu légèrement fixé.

Visualiser la morphologie de l'astrocyte à l'aide de lucifer Yellow Iontophoresis

Ce protocole décrit les procédures chirurgicales et techniques qui permettent l’imagerie en temps réel in vivo par fluorescence multiphotonique du cerveau des rongeurs pendant les traitements par ultrasons focalisés et par microbulles afin d’augmenter la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique.

Microscopie multiphotonique intravitale en temps réel pour visualiser les traitements par ultrasons focalisés et par microbulles afin d’augmenter la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique

Nous décrivons un protocole d’évaluation des courbes dose-réponse pour la stimulation extracrânienne en termes de mesures du champ électrique cérébral et d’un biomarqueur-flux sanguin cérébral pertinent. Étant donné que ce protocole implique la mise en place invasive d’électrodes dans le cerveau, une anesthésie générale est nécessaire, la respiration spontanée étant préférée aux respirations contrôlées.

Mise en place d’électrodes de stimulation extracrânienne et mesure du débit sanguin cérébral et des champs électriques intracrâniens chez des souris anesthésiées

Découvrez l'iontophorèse en temps réel avec du tétraméthylammonium pour quantifier la fraction de volume et la tortuosité de l'espace extracellulaire cérébral. Cette méthode permet d'étudier les changements aigus réversibles de l'ECS.

Itophorèse en temps réel avec du tétraméthylammonium pour quantifier la fraction de volume et la tortuosité de lespace extracellulaire du cerveau (Vidéo) | JoVE Journal

Itophorèse en temps réel avec du tétraméthylammonium pour quantifier la fraction de volume et la tortuosité de l'espace extracellulaire du cerveau

Explorer plus de vidéos