Itophorèse en temps réel avec du tétraméthylammonium pour quantifier la fraction de volume et la tortuosité de l'espace extracellulaire du cerveau

L’objectif global de cette procédure est de quantifier la fraction volumique et la tortuosité de l’espace extracellulaire dans le tissu cérébral. Cette méthode répond à des questions clés concernant la relation entre l’espace extracellulaire et la physiologie et la maladie. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet la caractérisation en temps réel de deux paramètres importants de l’espace extracellulaire.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car la microélectrode iontophorétique a tendance à changer de propriétés pendant les expériences et nécessite souvent un dépannage pendant les expériences. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car la manipulation précise d’une microélectrode sélective d’ions, une électrode iontophorétique sur plusieurs étapes, est nécessaire pour obtenir un enregistrement réussi. Pour commencer cette procédure, faites passer l’ACSF contenant du tétraméthylammonium, ou TMA, à travers la chambre d’immersion à raison de deux millilitres par minute.

Réglez le régulateur de température à la température souhaitée et faites buliser l’ACSF avec 95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone pendant la durée de l’expérience. Ensuite, montez l’électrode de terre sur un support et immergez son extrémité dans l’ACSF qui traverse la chambre d’immersion. Ensuite, remplissez la coupelle poreuse avec 0,3 % d’agarose contenant du TMA préparé précédemment et placez-la dans la chambre d’immersion.

Maintenant, fixez une microélectrode d’ionophorèse au porte-pipette d’un micromanipulateur. Connectez le fil de la microélectrode d’ionophorèse à l’étage de tête de l’unité d’ionophorèse. Ensuite, fixez un ISM calibré au deuxième micromanipulateur et connectez l’ISM à ses étages supérieurs.

Ensuite, allumez l’ordinateur contenant les programmes Wanda et Walter. Dans l’interface graphique de Wanda, cliquez sur Calibrer. Ensuite, dans la zone Étalonnage, renseignez les tensions mesurées lors de l’étalonnage ISM et cliquez sur Données d’ajustement.

Ensuite, cliquez sur Accepter dans la zone Calibrer pour transférer automatiquement la pente et les interférences générées vers l’interface graphique principale. Sur le côté gauche de l’interface graphique, assurez-vous que tous les paramètres expérimentaux sont définis dans les entrées correspondantes. Ensuite, placez une sonde de température dans la tasse de gélose.

Enregistrez la température mesurée dans l’entrée Température de la boîte Électrode de mesure de l’interface graphique. Ensuite, abaissez les microélectrodes à au moins 1 000 micromètres de profondeur dans l’agarose et centrez-les dans la tasse. Visualisez-les au microscope à l’aide d’un objectif 10X.

Sur l’amplificateur à deux canaux, déplacez manuellement le connecteur de la voie ISM vers la sortie de soustraction de tension pour régler la soustraction entre les voies de référence et ISM. Centrez les pointes les unes sur les autres dans les trois axes directionnels. Ensuite, mettez à zéro les positions relatives des deux microélectrodes sur les boîtiers de commande du micromanipulateur et assurez-vous que les microélectrodes sont centrées avec précision et exactitude.

Ensuite, éloignez l’ISM de 120 micromètres de la microélectrode d’ionophorèse dans un axe. Ensuite, démarrez un enregistrement en cliquant sur Acquérir dans l’interface graphique et laissez le programme s’exécuter pour un enregistrement complet. Dans cette procédure, ouvrez le programme Walter sur l’ordinateur.

Dans le menu Aucun enregistrement depuis, cliquez sur le bouton Wanda Voltoro pour lire les enregistrements générés par Wanda. Dans la fenêtre contextuelle suivante, sélectionnez un ou plusieurs enregistrements à lire et cliquez sur Ouvrir. Dans le menu Excel One Write, cliquez sur la feuille 1.3 et suivez les invites jusqu’à ce que les enregistrements soient automatiquement représentés graphiquement.

Pour commencer la procédure d’ajustement, dans le menu Deux options, cliquez sur le bouton de sélection d’enregistrement. Ensuite, dans la fenêtre contextuelle de la figure deux, utilisez la souris pour déplacer le réticule sur le premier enregistrement à traiter et appuyez sur l’un des boutons de la souris pour choisir l’enregistrement. Après cela, cliquez sur ajuster la courbe dans le menu et utilisez au moins 20 itérations d’ajustement pour obtenir un ajustement précis des données.

Ensuite, sélectionnez tout pour ajuster tous les points de données, puis sélectionnez Continuer. Le programme s’adaptera à la courbe affichée. Ensuite, sélectionnez l’option permettant d’écrire le résultat dans le tableur approprié en cliquant sur Excel dans le menu des sept résultats.

Nommez le fichier Excel. Notez et enregistrez les données générées qui seront utilisées pour déterminer la fonctionnalité de la microélectrode d’ionophorèse. Si la microélectrode d’ionophorèse est jugée appropriée pour l’expérience, notez le nombre moyen de transport de tous les essais dans le champ TransportNum end de l’interface graphique Wanda.

Dans cette procédure, placez une tranche de cerveau de 400 micromètres d’épaisseur dans la chambre d’enregistrement en veillant à ce qu’elle soit complètement immergée dans l’ACSF en écoulement. Ensuite, déplacez la microélectrode d’ionophorèse et l’ISM au-dessus du champ d’intérêt sur la tranche de cerveau. Immergez les deux électrodes dans l’ACSF fluide, mais au-dessus de la tranche.

Ensuite, décalez la tension pour les canaux de référence et de détection ionique à zéro millivolts. Attendez que la tension dans les deux canaux se stabilise. Sur l’enregistreur, marquez la tension mesurée sur le canal de détection ionique de l’ISM.

Ensuite, placez les microélectrodes ISM et ionophorèse à 200 micromètres de profondeur dans la tranche et à 120 micromètres les unes des autres. Calculez la différence de tension entre les signaux TMA mesurés dans l’ACSF en flux et dans le cerveau et entrez cette valeur dans le champ Baseline Volt Millivolt dans la boîte Measuring Electrode de l’interface graphique Wanda. Sur le côté gauche de l’interface graphique, assurez-vous que tous les paramètres expérimentaux sont correctement saisis.

Démarrez l’enregistrement en cliquant sur Acquérir et autorisez-le à prendre un enregistrement complet. Après avoir retiré les deux microélectrodes de la tranche, utilisez l’enregistreur graphique pour déterminer tout changement entre la tension mesurée maintenant et sa mesure d’avant. Pour analyser les enregistrements du cerveau, répétez les procédures d’analyse des données d’agarose à l’aide du programme Walter.

Écrivez les données dans le tableur en cliquant sur Excel dans le menu Walter. Ensuite, notez la fraction volumique du SEC cérébral, la tortuosité du SEC cérébral et la clairance non spécifique. Pour vérifier le numéro de transport, prenez de nouveaux enregistrements dans agarose et répétez les procédures dans le programme Walter pour obtenir le numéro de transport.

Inspectez la feuille de calcul et vérifiez si le numéro de transport a changé de plus de 10 % par rapport au numéro de transport obtenu avant les mesures cérébrales. Si c’est le cas, les données obtenues avec la microélectrode iontophorétique ne sont pas fiables. Le nombre de transport mesuré dans cette étape doit correspondre étroitement à celui obtenu avant les mesures cérébrales, sinon la fraction volumique ne peut pas être considérée comme précise.

Utilisez les données d’étalonnage ISM nouvellement obtenues comme entrée dans la boîte d’étalonnage Wanda et vérifiez que la valeur de pente diffère de moins de 10 % par rapport à l’étalonnage précédent. Voici les données représentatives d’un seul essai obtenu en gélose démontrant la courbe de concentration de la TMA. Et il s’agit d’une courbe ajustée obtenue à partir du traitement des données dans Walter.

Le chevauchement des données dans la courbe ajustée démontre que l’ajustement de la courbe effectué par Walter modélise avec précision la diffusion dans cet essai. Voici le tableau des mesures de gélose avant expérimentation dans le cerveau. Voici un résumé des mesures prises dans une tranche de cerveau de souris dans les conditions de contrôle et expérimentales.

L’alpha a diminué lors d’un test de provocation hypoosmolaire tandis que la tortuosité a augmenté comme prévu. Alpha a dépassé les valeurs de contrôle dans les conditions de récupération. Et voici le tableau des mesures d’agra après expérimentation dans le cerveau.

Les nombres moyens de transport avant et après l’expérience étaient à moins de 10 % l’un de l’autre, ce qui indique que les valeurs enregistrées dans le cerveau étaient fiables. Une fois maîtrisée, cette procédure peut être réalisée en 14 heures sur deux jours. Le premier jour, les ISM sont fabriqués et calibrés.

Le deuxième jour, les ISM sont recalibrés et une ionophorèse en temps réel est effectuée. Lors de cette procédure, il est important d’être précis dans l’espacement de vos électrodes. Deuxièmement, il est important de n’accepter une expérience que si le nombre de transport de la microélectrode iontophorétique reste stable tout au long de l’expérience.

Suite à cette procédure, qui caractérise la diffusion de petits cations dans l’espace extracellulaire, vous pouvez passer à d’autres techniques comme la méthode d’imagerie optique intégrative qui vous permet de répondre à la question de savoir comment les grosses micromolécules se déplacent dans l’espace extracellulaire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer la méthode d’ionophorèse en temps réel pour quantifier le volume de l’espace extracellulaire du cerveau et la tortuosité dans le cerveau vivant en santé et en maladie. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.