In Vitro Différenciation des cellules souches mésenchymateuses humaines en cellules fonctionnelles Cardiomyocyte

L’objectif global de cette procédure expérimentale est d’induire et d’observer l’induction cardiomyogénique de cellules souches mésenchymateuses. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des cellules souches mésenchymateuses, telles que les remèdes qui peuvent être induits par des signaux environnementaux pour générer des cardiomyocytes fonctionnels. Le principal avantage de cette technique est qu’elle applique la formation d’agrégats et des couches fœtales cardiaques, au lieu d’agents pharmacologiques ou de matériel génétique.

Les implications de cette technique s’étendent au traitement des maladies cardiovasculaires car elle élabore sur le potentiel cardiomyogénique des cellules souches mésenchymateuses. Me feront la démonstration de cette procédure par Mlle Farwah Iqbal, doctorante de notre laboratoire, Max Librach et Nadav Gasner, tous deux stagiaires de notre laboratoire. Après avoir isolé les parties du rat-chiot selon le protocole de texte, coupez les ventriculi en deux et transférez-les dans une boîte de 10 centimètres avec 10 millilitres de PBS et de fines rayures sur de la glace, pour laisser le sang s’écouler.

Ensuite, à l’aide de ciseaux incurvés, coupez les parois ventriculaires en petits morceaux d’un diamètre de deux à trois millimètres. À l’aide d’une pipette sérologique, transférez les morceaux de cœur de 10 à 12 animaux dans un tube de 50 millilitres et laissez-les se déposer. Retirez autant de PBS P/S que possible, sans retirer de morceaux de cœur.

Ajoutez ensuite 10 millimètres de PBS P/S frais. Pour isoler les cardiomyocytes, une fois que les morceaux cardiaques se sont installés, utilisez 0,15 % de trypsine dans le PBS, pour remplacer le PBS P/S et incubez le tissu à 37 degrés Celsius avec agitation, pendant 10 minutes. Jetez le surnageant.

Ensuite, répétez la digestion de la trypsine trois fois de plus, sauf que les surnageants de la carafe sont placés dans des tubes de collecte de 50 millilitres contenant 10 millilitres de 100 % FBS. Ensuite, centrifugez les tubes des cellules et aspirez le surnageant. Utilisez ensuite du DMEM-F12 avec 10 % FBS et 1 % P/S pour remettre les cellules en suspension et les ensemencer sur une plaque à six puits.

Une fois que les cellules se sont fixées, remplacez le milieu par deux millilitres de milieu frais. Pour préparer des CSM pré-colorées, retirez le milieu des cultures de CSM qui ont atteint une confluence de 70 à 80 % dans des boîtes de 10 centimètres et ajoutez trois millilitres de solution de dissociation cellulaire. Incuber les plats à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq minutes.

Transférez les cellules dissociées dans un tube de 15 millilitres et centrifugez à 400 x G pendant cinq minutes. Aspirez le surnageant sans perturber la pastille cellulaire et remettez les cellules en suspension. Utilisez ensuite un compteur de cellules automatisé pour compter les cellules.

Diluer les cellules à une concentration de 1 x 10 à la sixième CSM par millilitre, dans du DMEM-F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de P/S. Ensuite, dans les cellules des tubes à centrifuger de 1,5 millilitre, ajoutez un colorant fluorescent viable et non transférable et incubez les CSM pendant une demi-heure. Après avoir centrifugé les tubes à 400 x G pendant cinq minutes, aspirez le surnageant et remettez le granulé en suspension à une concentration de 1 x 10 à la sixième CSM par millilitre.

Transférez ensuite les CSM sur les cardiomyocytes à une concentration de 10 x 10 vers les quatrièmes cellules par puits de la plaque à six puits. Pour réaliser des co-cultures d’agrégats, préparez une suspension cellulaire unique de CSM en alpha MEM, complétée par un FBS de 10 % et un P/S de 1 %.

Placez les couvercles sur leurs homologues inférieurs contenant du PBS P/S. Incuber les plats à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Au microscope stéréoscopique, observez la formation d’agrégats dans les gouttes après trois jours.

Si plus de 80 % des gouttes contenues formaient des agrégats, utilisez une micropipette d’un millilitre pour recueillir les gouttes des couvercles et transférez les agrégats directement sur les monocouches primaires de cardiomyocytes de rat. Incuber les co-cultures agrégées pendant deux semaines maximum. Changer le volume complet du fluide toutes les 72 heures.

Au quotidien, utilisez la microscopie à champ clair pour observer les agrégats qui se fixent aux couches cellulaires du fœtus. Enregistrez les agrégats de contraction lorsqu’ils sont observés. Les agrégats actifs se contractent de manière synchronisée, nous suggérons une conductance entre eux tout au long de la couche fœtale, qui n’a pas d’activité physique.

Aspirez le milieu et ajoutez deux millilitres de PBS par puits du plat à six puits. Retirez ensuite le PBS et ajoutez deux millilitres de solution de dissociation par puits. Incuber les plats à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant trois minutes.

Comme on le voit ici, les NCSM de trois types différents présentaient une abondance et une apparence similaires dans les cocultures directes. Deux à trois jours après le transfert des gouttes suspendues sur des cellules cardiaques dans des co-cultures agrégées, les FTM et les PBC à terme sont apparus dans des agrégats plus grands par rapport à ceux observés à partir de BMSC. Dans cette expérience, l’analyse cytométrique en flux de l’expression de CD49F dans les CSM indifférenciées a montré que 96 % des PBC Huck FTM, appelées 89 % des PBC Huck et 53 % des BMSC, étaient positifs pour CD49F à la surface cellulaire.

La cytométrie en flux sur TRA a permis de gagner 85 cellules, a montré la régulation positive du marqueur associé aux cardiomyocytes, SIRPA dans les PBC Huck FTM et les PBCs Huck term, mais pas dans les BMSC issues de co-cultures directes de cardiomyocytes. Comme on le voit ici, la régulation positive de cx43 était significativement plus élevée dans les PBC FTM huck par rapport aux PBC à terme huck ou BMSC dans les co-cultures directes. L’analyse de la microscopie fluorescente a révélé que la différenciation entre FTM et les PBC à terme huck régulait à la hausse cx43.

Avec des PBC à terme à une proportion plus élevée que les FTM. Cependant, la microscopie à fluorescence a révélé que des points positifs à cx43 ont été observés dans la membrane cellulaire des PBC FTM Huck et qu’ils étaient principalement cytoplasmiques dans les cellules à terme. Enfin, comme on le voit ici, une microscopie à fluorescence à fort grossissement a été réalisée sur des cellules humaines triées, après co-culture et la forte abondance de cx43 dans la membrane plasmique a été confirmée.

Une fois maîtrisées, les étapes clés de cette procédure peuvent être réalisées en une heure chacune, si elles sont correctement réalisées. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de maintenir des précautions aseptiques. Tissus animaux primaires impliqués qui peuvent introduire une contamination, s’ils ne sont pas manipulés correctement.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que la culture ultérieure d’agrégats contractés, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que la longévité de ces structures. Après son développement, cette technique permet aux chercheurs dans le domaine des CSM d’explorer le potentiel de différenciation de sources plus jeunes de cellules souches mésenchymateuses telles que les tissus extra-embryonnaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des agrégats de CSM et de les combiner avec des couches fœtales de tissus primaires directs, de manière à fournir une induction appropriée pour la différenciation cardiomyogénique.

N’oubliez pas que travailler avec BRDU peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que la manipulation appropriée des déchets cytotoxiques doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.