Name: In Vitro Différenciation des cellules souches mésenchymateuses humaines en cellules fonctionnelles Cardiomyocyte (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Découvrez la différenciation cardiomyogénique des cellules souches mésenchymateuses humaines en cellules fonctionnelles. Cette méthode utilise des signaux environnementaux et la formation d'agrégats sans agents pharmacologiques.

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Les auteurs remercie les membres du personnel suivants et recherche du personnel pour leur contribution : Matthew Librach, Leila Maghen, Tanya A. Baretto, Shlomit Kenigsberg et Andrée Gauthier-Fisher. Ce travail a été soutenu par le Fonds de recherche The Ontario - Excellence de la recherche (ER-FRO, tour #7) et créer Program Inc.

Toutes les études impliquant des animaux ont été menées et rapportées conformément aux directives ARRIVE48. Toutes les études ont été réalisées avec l’approbation du comité d’éthique de la recherche de l’établissement (numéro de CER 454-2011, Institut de recherche Sunnybrook ; REB 29889, Université de Toronto, Toronto, Canada). Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Comité de protection des animaux du Réseau universitaire de santé (Toronto, Canada), et tous les animaux ont reçu des soins sans cruauté conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8e édition (National Institutes of Health 2011).
1. Culture tissulaire
<ol>
	<li>Culture FTM HUCPVCs, HUCPVCs à terme (préalablement établis, n ≥ 3 lignées indépendantes pour chacune)42 et BMSC disponibles dans le commerce en milieu essentiel alpha-minimum (MEM) complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et un cocktail pénicilline/streptomycine (P/S) à 1 %. Des cardiomyocytes primaires de rat en culture et des co-cultures de CSM-cardiomyocytes dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco : mélange de nutriments F-12 (DMEM-F12) contenant 10 % de FBS et 1 % de P/S. 
	REMARQUE : Stérilisez le milieu à l’aide d’un filtre de 0,2 μm. Conserver les solutions de milieu préparées à 4 °C pendant 3 semaines maximum.</li>
	<li>Maintenir les cultures cellulaires dans des incubateurs humidifiés (95 % d’humidité relative, 37 °C et 5 % de CO2) et le passage à 70-80 % de confluence, déterminée par microscopie à contraste de phase. Utiliser des volumes de milieu appropriés pour la taille de la boîte de culture tissulaire utilisée (p. ex., 10 mL dans une boîte de 10 cm et 2 mL par puits dans une boîte de culture tissulaire à 6 puits). Utilisez ces conditions de culture pendant toute la durée du protocole.</li>
	<li>Dissocier les monocouches de CSM pour l’établissement d’une co-culture de CSM ou de cardiomyocytes à l’aide d’une solution d’enzyme de dissociation (2 ml/puits dans une plaque à 6 puits) et incuber à 37 °C pendant 4 min.</li>
	<li>Transférez les cellules dissociées dans un tube de 15 mL et centrifugez à 400 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Aspirer le surnageant sans perturber la pastille cellulaire et remettre les cellules en suspension dans 1 mL d’un milieu de culture approprié pour le comptage à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Amorcez les cellules comme décrit dans les sections de protocole suivantes.</li>
</ol>
2. Préparation de co-cultures primaires de cardiomyocytes-CSM de rat
<ol>
	<li>Obtenir du tissu cardiaque pour l’isolement des cardiomyocytes primaires.
	<ol>
		<li>Euthanasier les petits rats (5-6 jours postnatals) en utilisant l’asphyxie au CO2. Réglez les chambres de CO2 sur un remplacement de gaz de 20 % (débit = 0,2 x volume de la chambre par minute). Confirmez l’exitus par l’absence du réflexe de pincement.</li>
		<li>Retirez les oreillettes avec les principaux vaisseaux sanguins qui les relient à l’aide d’instruments stérilisés (c.-à-d. pinces et ciseaux incurvés)41. Transférez les cœurs dans des tubes de 50 mL contenant du PBS stérile avec 1 % P/S (PBS-P/S) sur de la glace.</li>
		<li>Coupez les ventricules en deux et laissez le sang s’écouler dans un plat de 10 cm avec 10 ml de PBS-P/S sur de la glace. Coupez les parois ventriculaires en petits morceaux (diamètre = 2-3 mm) à l’aide de ciseaux courbés.</li>
		<li>Transférez les morceaux de cœur de 10 à 12 animaux dans un tube de 50 ml à l’aide d’une pipette sérologique et laissez-les se déposer.</li>
		<li>Retirez autant de PBS-P/S que possible sans retirer de morceaux de cœur. Ajouter 10 ml de PBS-P/S neuf.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Digérer le tissu cardiaque pour isoler les cardiomyocytes.
	<ol>
		<li>Laissez les morceaux de cœur se déposer. Remplacer le PBS-P/S par 10 mL de trypsine à 0,15 % dans du PBS et agiter à 37 °C pendant 10 min.</li>
		<li>Jetez le surnageant. Répétez la digestion décrite à l’étape 2.2.1 trois fois de plus, mais décantez les surnageants dans des tubes de prélèvement de 50 ml contenant 10 ml de FBS à 100 %.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Centrifuger les cellules (400 x g, 5 min) et aspirer le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans le DMEM-F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de P/S et semer sur une plaque à 6 puits (1 x 105 cellules/cm2, 2 mL de milieu par puits).</li>
	<li>Après 1 h, transférez le milieu contenant les cellules non fixées dans un tube de 50 ml et jetez les cellules fixées. Comptez les cellules en suspension et replaquez-les en plaques neuves à 6 puits (1 x 10 5 cellules/cm2, 2 mL de DMEM-F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de P/S par puits).</li>
	<li>Inhiber la prolifération cellulaire avec la bromodéoxyuridine (BrdU). 
	Attention : BrdU est un tératogène fort et suspecté d’être mutagènes. Veuillez vous assurer qu’une formation appropriée est fournie et reportez-vous à la fiche de données de sécurité avant utilisation.
	<ol>
		<li>Une fois les cellules fixées, remplacez le milieu dans la plaque à 6 puits par du DMEM-F12 contenant 10 % de FBS, 1 % de P/S (2 mL de milieu par puits) et 5 μM de BrdU. Incuber pendant 16 h (37 °C, 5 % CO2).</li>
		<li>Retirer le milieu contenant du BrdU et le remplacer par du DMEM-F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de P/S (2 mL de milieu par puits).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Préparez des CSM pré-teintées.
	<ol>
		<li>Une fois que les cultures de CSM sont à 70-80 % de confluence dans des boîtes de 10 cm, retirer le milieu de culture et ajouter 3 ml de solution de dissociation cellulaire. Incuber le plat à 37 °C et 5 % CO2 pendant 5 min.</li>
		<li>Transférez les cellules dissociées dans un tube de 15 mL et centrifugez à 400 x g pendant 5 min.</li>
		<li>Aspirer le surnageant sans perturber la pastille cellulaire et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de DMEM-F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de P/S pour le comptage à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.</li>
		<li>Diluer les cellules à une concentration de 1 x 106 MSC/mL de DMEM-F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de P/S.</li>
		<li>Incuber les CSM avec un colorant fluorescent viable et non transférable (5 μM, 30 min, 37 °C, 5 % CO2) dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL pendant 1 h.</li>
		<li>Centrifuger les tubes à 400 x g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans du DMEM-F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de P/S pour une concentration cellulaire de 1 x 106 MSC/mL. Répétez cette opération 3 fois au total.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transférez les CSM sur les cardiomyocytes (étape 2.5.2) à une concentration de 10 x 104 cellules par puits de la plaque à 6 puits.</li>
</ol>
3. Préparation des co-cultures d’agrégats
<ol>
	<li>Préparer une suspension unicellulaire de CSM (2 x 104 cellules/mL de milieu, passage # ≤ 6) dans de l’alpha-MEM complétée par 10 % de FBS et 1 % de P/S (voir étape 2.6). 
	REMARQUE : Se référer à la section 1 du protocole pour le passage des cellules. Vous pouvez également pré-teindre les CSM conformément à l’étape 2.6.</li>
	<li>Amorcer la formation d’agrégats en plaçant des gouttes de 25 μL de suspension cellulaire (500 cellules) sur la surface interne des couvercles des boîtes de culture tissulaire de 10 cm (jusqu’à 50 gouttes par couvercle). Placez les couvercles sur leurs homologues inférieurs contenant du PBS-P/S. Incuber à 37 °C et 5 % de CO2, 
	REMARQUE : Placez 5 à 7 ml de PBS-P/S dans la boîte de culture sous les gouttes suspendues pour éviter l’évaporation des gouttes.</li>
	<li>Observez la formation d’agrégats dans les gouttes après 3 jours à l’aide d’un stéréomicroscope. Si plus de 40 gouttes sur 50 contiennent des agrégats formés, prélever les gouttes des couvercles à l’aide d’une micropipette de 1 mL et transférer les agrégats directement sur les monocouches primaires de cardiomyocytes de rat (préparées aux étapes 2.1 à 2.7 ; 10 gouttes/puits). Évitez le pipetage vigoureux pour préserver l’intégrité de l’agrégat.</li>
	<li>Conservez les co-cultures d’agrégats dans les incubateurs jusqu’à 2 semaines, en changeant le volume complet du milieu (2 ml de DMEM-F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de P/S par puits) toutes les 72 h.
	<ol>
		<li>Observez quotidiennement les agrégats qui se fixent sur les couches des cellules nourricières à l’aide de la microscopie à fond clair. Enregistrez les agrégats de contraction lorsqu’ils sont observés.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Préparer des agrégats pour l’analyse.
	<ol>
		<li>Retirer le milieu et ajouter 2 mL de PBS par puits d’une boîte de culture tissulaire à 6 puits. Retirez le PBS et ajoutez 2 ml de solution de dissociation par puits. Incuber pendant 3 min à 37 °C et 5 % de CO2.</li>
		<li>Centrifuger à 400 x g pendant 5 min pour obtenir une pastille de cellule. Remettre en suspension dans le fluide, comme spécifié pour les applications décrites dans les étapes suivantes (voir étapes 4.1, 5.1 et 6.1) et passer à travers une crépine de 70 μm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Cytométrie en flux (FC) et tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)
<ol>
	<li>Incuber des suspensions cellulaires (1 x 105 cellules dans 200 μL de PBS contenant 3 % de FBS) avec des anticorps primaires conjugués aux fluorophores (FITC ou APC) (c.-à-d. CD49f, Cx43, TRA-1-85, HLA-A, HLA-G et SIRPA pour FC ou TRA-1-85 pour FACS ; 1:40) à 4 °C pendant 30 min, à l’abri de la lumière.</li>
	<li>Centrifuger (400 x g, 5 min) et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de PBS avec 3 % de FBS pour les FC ou de PBS avec 0,5 % de FBS pour FACS. 
	REMARQUE : La FC des CSM a été optimisée par Hong et al.41.</li>
	<li>Maintenez les cellules à 4 °C dans l’obscurité jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être analysées par FC (au moins 1 x 104 événements) ou FACS. Triez les cellules comme décrit41. Replaquez les cellules triées à haut niveau positif TRA-1-85 dans des plaques à 6 puits (1 x 104 cellules/puits, 2 mL de DMEM-F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de P/S) dans un délai de 1 h 
	REMARQUE : Pour la stratégie de contrôle de l’antigène de surface cellulaire humaine TRA-1-85, voir la figure supplémentaire.</li>
</ol>
5. Immunocytochimie (ICC) et microscopie
<ol>
	<li>Déposer de nouveau les suspensions cellulaires obtenues à partir des cocultures (étape 3.5.2) ou du FACS (section 4) sur des lames de chambre (1 x 104 cellules/puits, 2 mL de DMEM-F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de P/S par puits). Laissez les cellules se fixer pendant la nuit dans un incubateur de culture tissulaire (voir rubrique 1 pour les conditions).</li>
	<li>Fixez les cellules à l’aide de 3 ml de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans du PBS pendant 15 minutes à température ambiante. Laver 3 fois avec 3 mL de PBS contenant 1 % d’albumine sérique bovine (BSA ; PBS-BSA) pendant 5 min par lavage 
	Attention : Portez un équipement de protection individuelle approprié lors de la manipulation du PFA.</li>
	<li>Perméabiliser les cellules dans 3 mL de PBS-BSA avec 0,1 % de Triton X-100. Incuber à température ambiante pendant 10 min pour les antigènes intracellulaires (c.-à-d. l’actinine alpha-sarcomérique [aSarc] et Cx43], ou 25 min pour les antigènes intranucléaires (c.-à-d. Mef2c et antigène nucléaire humain [HuNu]). Laver 3 fois avec 3 mL de PBS-BSA pendant 5 min par lavage.</li>
	<li>Bloquez les échantillons contre les réactions d’anticorps non spécifiques avec 3 ml de PBS contenant 5 % de sérum de chèvre normal (NGS) et 1 % de BSA pendant 15 min à température ambiante. Laver 3 fois avec 3 mL de PBS-BSA pendant 5 min par lavage.</li>
	<li>Incuber les cellules dans les anticorps primaires (c.-à-d. Mef2c, aSarc, Cx43 et HuNu) dilués à 1:200 dans 3 mL de PBS-BSA à 4 °C pendant la nuit.</li>
	<li>Laver 3 fois avec 3 mL de PBS-BSA pendant 5 minutes par lavage et incuber avec des anticorps secondaires pendant 30 minutes à température ambiante. Laver 3 fois avec 3 mL de PBS-BSA pendant 5 min par lavage.</li>
	<li>Conservez les échantillons colorés dans 3 ml de support de montage.</li>
	<li>Acquérez des images à l’aide d’un microscope à fluorescence. Utilisez un objectif 10X (NA = 0,3) et un objectif 20X (NA = 0,45) pour l’imagerie à faible grossissement. Utilisez des cubes de filtre de fluorescence et des longueurs d’onde pour la GFP (ex = 470/22 nm, em = 525/50 nm) et la RFP (ex = 531/40 nm, em = 593/40 nm) pour les anticorps secondaires utilisés (voir le tableau des matériaux et de l’équipement).</li>
	<li>Quantifiez les images à l’aide d’un logiciel d’imagerie (voir le tableau des matériaux et de l’équipement pour les logiciels recommandés). Normalisez les lectures d’intensité de fluorescence en fonction des acquisitions de contrôle secondaires.</li>
</ol>
6. Isolement de l’ARN et RT-PCR quantitative
<ol>
	<li>Préparez des échantillons d'ARN à partir de cultures de CSM indifférenciées ou de CSM triées à partir de co-cultures en utilisant l'isolement de l'ARN sur colonne, conformément aux instructions du fabricant. Préparez 1 x 104 à 1 x 106 cellules dans 0,7 mL de tampon de lyse cellulaire (fourni avec la trousse d’isolement de l’ARN) par échantillon.</li>
	<li>Préparez de l’ADNc à partir d’un maximum de 2 μg d’ARN par réaction RT de 100 μL.</li>
	<li>Effectuez une qPCR en utilisant 10 ng d’ADNc par réaction (40 cycles, température de recuit/extension de 60 °C).
	<ol>
		<li>Utilisez des amorces pour MY6H et cTnT humaines à une concentration de 500 nM et de 1 à 100 ng d’ADNc par réaction (voir le tableau des matériaux et de l’équipement). Utilisez GAPDH, ACTB et HPRT comme normalisateurs internes. Utiliser des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme et disponibles dans le commerce comme contrôle positif. 
		REMARQUE : Exprimer le changement de pli d’expression par rapport aux échantillons d’ADNc indifférenciés dérivés de CSM.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Dr. Clifford L. Librach est cotitulaire du brevet : méthodes d’isolement et d’utilisation de cellules provenant de tissus de cordon ombilical premier trimestre, accordé au Canada et en Australie.

La différenciation cardiaque de cellules souches a été en développement depuis plus de 2 décennies, avec plusieurs différentes stratégies utilisées pour générer des cellules cardiomyocytes provenant de sources MSC. Beaucoup de ces stratégies, cependant, sont inefficaces, et les conditions d’utilisation ne sont souvent pas représentatifs du milieu transplanté des cellules rencontre in vivo.
Contrairement aux méthodes existantes, le protocole présenté ici utilise une combinaison de couc...

Insuffisance cardiaque congestive (ICC) persiste comme des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. CHF survient souvent suite à la perte massive des cardiomyocytes et le développement du tissu de cicatrice acellulaire pathologique suite à un infarctus du myocarde (im)1. Alors que le cœur est un organe partiellement autorenouvellement, le résident souches et progénitrices cell pool chargé d’exécuter la régénération tissulaire significativement diminue dans l’abondance et la fonction chez les patients âgés, devenant souvent insuffisante pour une récupération optimale après une blessure. Il y a donc beaucoup d’intérêt dans le développement des traitements expérimentaux qui impliquent la transplantation de cellules de donneur sain dans le myocarde endommagé. Il est impératif que les cellules du donneur non seulement restaurer la structure du tissu, mais aussi réaliser la récupération fonctionnelle du myocarde touché.
Le cœur natif emploie coeur tissu-résident et endogènes provenant de la moelle osseuse des cellules souches pour blessure après réparation2,3,4. Régénératrice des cellules hôtes et donateurs dérivés-alike-doit avoir la capacité d’obtenir le phénotype approprié et la fonction dans le micro-environnement du myocarde retouche, ainsi que la capacité de façon efficace et sécuritaire remplacer les cellules perdues. Méthodes de différenciation in vitro ont servi largement à atteindre de haut rendement, sur les cellules souches cardiomyocyte production5,6. Le profil d’expression des marqueurs de la lignée cardiaque sert à définir le processus de différenciation des cellules souches vers la lignée cardiaque7. Marqueurs de différenciation précoce, tels que NKX2.5, facteur de renforceur de myocyte 2C (Mef2c) et GATA48,9, peuvent être une indication de l’ouverture du processus cardiomyogénique. Marqueurs de cardiomyocyte mature couramment utilisées pour évaluer l’efficacité de différenciation sont signal protéine régulatrice α (SIRPA)10, troponine T (cTnT)11, la chaîne lourde de la myosine cardiaque (MYH6)8,12,13et connexine 43 (Cx43)14,15,16. Les méthodes utilisant des cellules souches embryonnaires (CSE) et les cellules souches pluripotentes (CSP) ont été soigneusement optimisés et discutés concernant les détails des facteurs inductifs, de l’oxygène et de nutriments dégradés et le moment exact de l’action5,6,7,17,18. Néanmoins, ESC et CFP-axée sur les technologies présentent toujours plusieurs préoccupations éthiques et de sécurité, ainsi que des caractéristiques électrophysiologiques et immunologiques sous-optimale19,20. Hôtes transplantés ces cellules souvent expérience immunorejection et nécessitent une immunosuppression permanente. C’est principalement en raison d’une non-concordance de majeur d’histocompatibilité (MHC) des molécules complexes dans l’hôte et les bailleurs de fonds et à la résultante lymphocytes réponse21. Tout en individuel MHC classe I correspondant est une solution possible, une pratique clinique plus accessible nécessiterait une source de cellules qui est universellement immunoprivileged à surmonter la crainte de rejet.
Comme une source de cellule de rechange pour l’usage dans des applications cliniques, MSCs et en particulier, BMSC, ont été étudiées pour une utilisation dans la régénération des tissus depuis leur description initiale en 1995,22. MSCs sont censés être résidents cellules régénératrices qui peuvent être trouvés dans presque n’importe quel tissu vascularisé23. Sur l’isolation de la source souhaitée, MSCs peuvent facilement être étendus dans la culture, ont paracrine vaste capacité et possèdent souvent immunoprivileged ou immunomodulateurs propriétés24,25. Leur innocuité et l’efficacité ont déjà été démontrés dans plusieurs études précliniques, en particulier pour la régénération cardiaque3,26.
Plusieurs stratégies de différenciation des MSC utilisent des agents pharmacologiques, tels que la 5-azacytidine22 et27de DMSO et croissance ou morphogéniques facteurs, tels que BMP5,7,28,29 ou l’angiotensine-II30, avec une efficacité variable. Ces stratégies, cependant, ne sont pas fondées sur les obstacles qu’une cellule régénératrice de naïve est susceptible de rencontrer après domiciliation ou remis à l’endroit de la blessure in vivo. Des stratégies plus physiologiquement pertinents, bien que plus difficiles à définir et manipuler, reposent sur la prémisse que la différenciation MSC peut être induite par le biais de signaux provenant du microenvironnement tissu lui-même. Des études antérieures ont montré que l’exposition à la cellule cardiaque lysats31 ou le myocarde ventriculaire32,33, ou directement auprès des cardiomyocytes primaire in vitro15,34, peut augmenter l’expression des marqueurs cardiaques dans MSCs. D’autres ont démontré cardiomyogénèse spontanée après le traitement de lésions cardiaques avec MSCs35,36,37,38, bien qu’en partie, la fusion du BMSC et cardiomyocytes39,40 généré le myocarde naissant. À notre connaissance, des cardiomyocytes fonctionnels, contractants spontanément de MSCs humaines (CSM) de n’importe quelle source de tissus n’ont pas encore été signalées.
Le consensus actuel est que MSCs tous les proviennent de cellules périvasculaires23. MSCs Young avec des propriétés de pericyte peuvent être isolés de la région périvasculaire du cordon ombilical humain tissu41,42,43. En comparaison avec BMSC, HUCPVCs possèdent la différenciation accrue potentielle et plusieurs autres avantages régénératrices, les deux in vitro41,44 et in vivo45,46,47. En particulier, la source étant l’interface materno-foetale, HUCPVCs ont significativement plus faible immunogénicité comparée aux sources adultes de MSCs. Nos recherches portent sur la caractérisation et applications précliniques de FTM HUCPVCs, la plus jeune source de MSCs, objet d’une enquête, dont nous avons déjà montré a augmenté de multilineage proliférative et plu les capacités de différenciation, y compris dans la lignée de cardiomyogénique41.
Nous présentons ici un protocole qui combine formation globale et couches de cellule cardiaque primaire chargeur inductifs forces pour atteindre la différenciation cardiomyogénique complète d’agrégats MSCs. fournir un environnement 3D, qui modélise mieux des conditions in vivo par rapport aux cultures adhérentes 2D. Utilisant des couches cardiaque chargeur fournit un environnement qui soit représentative du site transplantation ultime pour les MSCs. Nous démontrons que les plus jeunes sources de MSCs isolées de cordons ombilicaux de pré ou post natals ont une plus grande capacité à former des agrégats et rejoindre le phénotype cardiaque comparativement à BMSC adultes, tout en conservant leur privilège immunitaire. Outre l’élévation abrupte de gènes marqueurs cardiaques lignage et l’expression induite d’intracellulaire (c.-à-d. cTnT et MYH6) et les protéines de surface cellulaire (c.-à-d., SIRPA et Cx43) spécifique pour les cardiomyocytes, nous montrons que le potentiel de différenciation des FTM HUCPVCs peut être exploité grâce à cette méthode et qu’ils peuvent donner lieu au contractant spontanément cellules cardiomyocytes.

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsine/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Pour la dissociation cellulaire</td></tr><tr><td>Alpha-MEM</td><td>Gibco</td><td>12571071</td><td>Pour les milieux de culture HUCPVC et BMSC.</td></tr><tr><td>Anticorps CD49f humain / souris conjugué</td> PE <td>Biolegend</td><td>313612</td><td>Marqueur d’intégrine pour l’anticorps</td></tr><tr><td>humain Cx43/GJA1 conjugué FC APC</td><td>R& D Systems</td><td>FAB7737A</td><td>marqueur Connexin 43 pour l’anticorps</td></tr><tr><td>HLA-A2 conjugué à FC FITC</td><td>Genway Biotech Inc.</td><td>GWB-66FBD2</td><td>Marqueur d’immunogénicité pour</td></tr><tr><td>l’anticorps anti-HLA-G [MEM-G/9] conjugué à FC FITC</td><td>Abcam</td><td>ab7904</td><td>Marqueur d’immunogénicité pour</td></tr><tr><td>l’anticorps anti-humain SIRPA/CD172a de souris conjuguée à FC FITC</td><td>AbD Serotec/Bio-Rad</td><td>MCA2518F</td><td>Marqueur cardiaque pour</td></tr><tr><td>l’anticorps humain TRA-1-85/CD147 conjugué à FC APC</td><td>R& D Systems</td><td>FAB3195A</td><td>Marqueur cellulaire humain pour l’anticorps</td></tr><tr><td>humain TRA-1-85/CD147 conjugué</td> FC et FACS FITC R<td>& D Systems</td><td>FAB3195F</td><td>Marqueur cellulaire humain pour FC et FACS</td></tr><tr><td>Anticorps anti-connexine 43/GJA1</td><td>Abcam</td><td>ab11370</td><td>Cx43. Pour l’anticorps</td></tr><tr><td>secondaire à absorption croisée ICC IgG (H+L) anti-lapin, Alexa Fluor 555</td><td>Life Technologies</td><td>A-21428</td><td>Pour l’anticorps</td></tr><tr><td>anti-sarcomérique alpha-actinine [EA-53]</td><td>ICC Abcam</td><td>ab9465</td><td>aSARC. Pour l’anticorps</td></tr><tr><td>secondaire à absorption croisée ICC Ruma IgM à chaîne lourde IgM, Alexa Fluor 555</td><td>Life Technologies</td><td>A-21426</td><td>Pour l’anticorps ICC</td></tr><tr><td>Mef2C (D80C1) XP pour lapin</td><td>New England BioLabs Ltd.</td><td>5030S</td><td>Pour ICC</td></tr><tr><td>Donkey Anticorps IgG (H+L) anti-lapin, Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A-21206</td><td>Pour</td></tr> ICC <tr><td>Anti-noyaux (HuNu) (clone 235-1) Anticorps</td><td>EMD Millipore MAB1281</td><td></td><td>Pour ICC</td></tr><tr><td>MZ9.5 Stéréomicroscope</td><td>Leica</td><td></td><td>Pour l’imagerie des agrégats.</td></tr><tr><td>Microtubes centrifuges de 1,5 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>Pour la coloration des CSM avec un colorant fluorescent.</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Logiciel de traitement d’images open source.</td></tr><tr><td>Aria II&nbsp ;</td><td></td><td>Établissement du BD</td><td>UHN SickKids FC. Pour le tri des cellules.</td></tr><tr><td>Moelle osseuse, cellules stromales méséchymateuses</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td>, <td>BMSC,</td></tr><tr><td>albumine sérique bovine</td>, <td>Sigma-Aldrich,</td><td>A7030-100G</td><td>BSA. Pour préparer des solutions pour ICC</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB3424</td><td>Attention : BrdU est un tératogène fort et suspecté d’être mutagène. Veuillez vous assurer d’une formation appropriée et vous référer à la FDS avant utilisation.</td></tr><tr><td>Canto II</td><td>BD</td><td></td><td>UHN Établissement SickKids FC. Pour la cytométrie en flux.</td></tr><tr><td>ADNc EcoDry Premix</td><td>Clontech/Takara</td><td>639570</td><td>Pour la préparation de l’ADNc pour qPCR</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Dye</td><td>Life Technologies</td><td>C7025</td><td>Imagerie fluorescente du cytoplasme cellulaire</td></tr><tr><td>Compteur de cellules automatisé Countess</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>C10227</td><td>Pour le comptage cellulaire</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6421</td><td>Pour milieu de culture primaire de cardiomyocytes chez le rat.</td></tr><tr><td>Gibco salin tamponné au phosphate de Dulbecco</td><td></td><td>10010023</td><td>D-PBS, sans Ca2+, Mg2+</td></tr><tr><td>EVOS</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Microscope fluorescent interne</td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD</td><td></td><td>interne. Pour la cytométrie en flux.</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (Hyclone)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH3039603</td><td>FBS. Composant du milieu de culture cellulaire.</td></tr><tr><td>Sondes QPCR IDT Prime Time</td><td>Integrated Data Technologies</td><td>FAM fluorophore</td><td>http://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers</td></tr><tr><td>Lab Vision PermaFluor Milieu de montage aqueux</td><td>ThermoScientific</td><td>TA-030-FM</td><td>Pour le stockage des cellules à soumettre ICC</td></tr><tr><td>LSR II&nbsp ;</td><td></td><td>Établissement du BD</td><td>UHN SickKids FC. Pour la cytométrie en flux.</td></tr><tr><td>Établissement du MoFlo Astrios</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>UHN SickKids FC. Pour le tri des cellules.</td></tr><tr><td>Technologie de signalisation cellulaire</td> <td>de sérum de chèvre normale</td><td>5425S</td><td>NGS. Utilisé dans la solution de blocage pour ICC</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass, 8 puits</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>155409</td><td>Pour préparer des échantillons pour ICC</td></tr><tr><td>OmniPur Triton X-100 Surfactant</td><td>EMD Millipore</td><td>9410-OP</td><td>En tant que composant de la solution de perméabilisation lors de la préparation des cellules pour ICC</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde, solution à 16 %, EM Grade</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710</td><td>Pour la fixation des cellules pour ICC.</td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Composant du milieu de culture cellulaire.</td></tr><tr><td>Amorces</td><td>Sigma</td><td>Custom Standard DNA Oligos, dessalées, 0,2 &mu ; mol</td><td>CTnT_F : GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A ; CTnT_R : GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A ; MYH6 F : GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T ; MYH6 R : GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G</td></tr><tr><td>Quorum Spinning Disk Confocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SickKids Imaging Facility</td></tr><tr><td>ReproCardio Cardiomyocytes dérivés de cellules hiPS</td><td>ReproCell</td><td>RCD001N</td><td>Contrôle positif pour qPCR</td></tr><tr><td>RNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>Pour isoler l’ARN pour qPCR</td></tr><tr><td>Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>204074</td><td>Pour qPCR avec master mix</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>A1049101</td><td>Pour MSC, milieu de coculture de monocytes.</td></tr><tr><td>TaqMan qPCR amorce</td><td>tests Thermo Fisher Scientific</td><td>4444556</td><td>Pour qPCR</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td>Coloration des cellules pour la viabilité et le comptage</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Gibco 272500108</td><td></td><td>Pour la dissociation cellulaire</td></tr><tr><td>Volocité</td><td>Perkin-Elmer</td><td>Volocité 6.3</td><td>Logiciel d’imagerie</td></tr><tr><td>0.2 &mu ; Filtre à pores</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>566-0020</td><td>Pour la stérilisation des milieux de culture tissulaire</td></tr><tr><td>HERAcell 150i CO2 Incubateur</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51026410</td><td>Pour l’incubation</td></tr><tr><td>de cellules Solution saline tamponnée au phosphate Dulbecco</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>PBS. 1X, Sans chlorure de calcium et chlorure de magnésium</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Almedic</td><td>7727- A10-704</td><td>Pour la remise du cœur de rat. Peut utiliser n’importe quelle pince similaire.</td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Fine Science Tools</td><td>14059-11</td><td>Pour hacher le cœur du rat. Ciseaux incurvés recommandés.</td></tr><tr><td>Tube de 50 mL</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Pour le prélèvement de cardiomyocytes et les procédures générales de culture tissulaire</td></tr><tr><td>Tube de 15 mL</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Pour les procédures générales de culture tissulaire</td></tr><tr><td>Plaques à 6 puits</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>CA73520-906</td><td>Pour la culture tissulaire</td></tr><tr><td>Boîtes de culture tissulaire de 10 cm</td><td>Corning</td><td>25382-428</td><td>Pour la formation d’agrégats</td></tr><tr><td>Microscope Axiovert 40C</td><td>Zeiss</td><td>Pour l’imagerie en fond clair tout au long de la culture tissulaire et du reste du protocole</td>70 &mu ;<td></td></tr><tr><td> Filtre à cellules m</td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td>Pour assurer une suspension unicellulaire avant la cytométrie en flux ou le tri</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Millipore</td><td>9410-1L</td><td>Utilisé dans une solution de perméabilisation pour ICC</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H1399</td><td>Colorant utilisé lors de la visualisation de la localisation du Cx43</td></tr></tbody></table>

in vitro différenciation des cellules souches mésenchymateuses humaines en cellules fonctionnelles cardiomyocyte

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Infarctus du myocarde et la cascade ischémique ultérieure entraîner la perte étendue de cardiomyocytes, conduisant à l’insuffisance cardiaque congestive, la principale cause de mortalité dans le monde. Cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont une option prometteuse pour les thérapies à base de cellules remplacer les techniques actuelles, envahissantes. MSCs peuvent se différencier en lignées mésenchymateuses, y compris les types de cellules cardiaques, mais complète différenciation en cellules fonctionnelles n’a pas encore été atteint. Les méthodes précédentes de différenciation reposaient sur des agents pharmacologiques ou de facteurs de croissance. Cependant, les stratégies pertinentes plus physiologiquement peuvent également activer MSCs subir des transformations cardiomyogénique. Nous présentons ici une méthode de différenciation utilisant des agrégats MSC sur couches de cardiomyocyte mangeoire pour produire des cellules maître cardiomyocyte.
Cordon ombilical humain périvasculaires cellules (HUCPVCs) ont démontré avoir une différenciation plus grande potentielle que couramment étudié les types de MSC, comme la moelle osseuse MSCs (BMSC). Comme une source ontologiquement plus jeune, nous avons étudié le potentiel de cardiomyogénique de HUCPVCs de (FTM) au premier trimestre par rapport à des sources plus anciennes. FTM HUCPVCs constituent une source originale, riche de MSCs qui conservent leurs in utero immunoprivileged propriétés lorsque cultivées in vitro. Utilisant ce protocole de différenciation, la FTM et le terme HUCPVCs atteint cardiomyogénique une augmentation significative de différenciation par rapport à BMSC, comme en témoigne l’augmentation de l’expression des marqueurs de cardiomyocytes (c.-à-d., myocytes enhancer facteur 2C, troponine T, la myosine cardiaque de chaîne lourde, signal protéine régulatrice α et connexin 43). Ils ont soutenu également significativement plus faible immunogénicité, tel que démontré par leur plus faible expression de HLA-A et l’expression de HLA-G plus élevée. Application de différentiation axée sur l’agrégat, FTM HUCPVCs a montré formation globale accrue potentiels et généré contractantes des amas de cellules dans la semaine suivant la co-culture sur couches alimentation cardiaque, devenant le premier type MSC de le faire.
Nos résultats démontrent que cette stratégie de différenciation permet d’exploiter efficacement le potentiel de cardiomyogénique du jeunes MSCs, tels que les FTM HUCPVCs et suggère que cette différenciation in vitro préliminaire pourrait être une stratégie possible pour augmenter leur efficacité régénératrice in vivo.

Les HUCPVC présentent un potentiel de formation d'agrégats et des niveaux d'expression de CD49f plus élevés par rapport aux BMSC :
Pour induire la différenciation des CSMh (à savoir les CVPCH FTM, les CVPCH à terme et les CSMd), des suspensions monocellulaires de CSM non différenciés ou des gouttes suspendues contenant des CSM (Tableau 1) ont été transférées sur des monocouches de cardi...

Ici, nous présentons une méthode pour exploiter efficacement le potentiel de différenciation cardiaques des jeunes sources de cellules souches mésenchymateuses humaines afin de générer des cellules fonctionnelles, contractants, cardiomyocyte-comme in vitro.

In Vitro Différenciation des cellules souches mésenchymateuses humaines en cellules fonctionnelles Cardiomyocyte

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

L'objectif général de cette procédure expérimentale est d'induire et d'observer l'induction cardiomyogénique de cellules souches mésenchymateuses. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des cellules souches mésenchymateuses, telles que : quels remèdes peuvent être induits par des signaux environnementaux afin de générer des cardiomyocytes fonctionnels ? Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'elle utilise la formation d'agrégats et des couches cardiaques fœtales, plutôt que des agents pharmacologiques ou du matériel génétique.Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie des maladies cardiovasculaires, car elle met en évidence le potentiel cardiomyogénique des cellules souches mésenchymateuses. Miss Farwah Iqbal, étudiante au doctorat de notre laboratoire, Max Librach et Nadav Gasner, tous deux stagiaires de notre laboratoire, m'assisteront pour la démonstration de cette procédure. Après avoir isolé les parties de raton nouveau-né conformément au protocole décrit, couper les ventricules en deux et les transférer dans une boîte de 10 centimètres contenant 10 millilitres de PBS, puis les placer sur de la glace pilée afin de laisser le sang s'écouler.Ensuite, à l’aide de ciseaux courbes, découper les parois ventriculaires en petits morceaux d’un diamètre de deux à trois millimètres. À l’aide d’une pipette serologique, transférer les morceaux de cœur provenant de 10 à 12 animaux dans un tube de 50 millilitres et les laisser décanter. Éliminer autant que possible le PBS P/S, sans retirer les morceaux de cœur.Ensuite, ajoutez 10 millimètres de PBS P/S frais. Pour isoler les cardiomyocytes, une fois que les morceaux de cœur se sont déposés, utilisez de la trypsine à 0,15 % dans du PBS pour remplacer le PBS P/S et incubez le tissu à 37 degrés Celsius avec agitation pendant 10 minutes. Éliminez le surnageant.Ensuite, répétez la digestion par la trypsine trois fois supplémentaires, en versant toutefois les surnageants dans des tubes de collecte de 50 millilitres contenant 10 millilitres de SBF à 100 %. Puis, centrifugez les tubes contenant les cellules et aspirez le surnageant. Resuspendez ensuite les cellules dans du DMEM-F12 contenant 10 % de SBF et 1 % de P/S, et semez-les dans une plaque de six puits.Une fois que les cellules se sont fixées, remplacez le milieu par deux millilitres de milieu frais. Pour préparer les CSM prémarquées, retirez le milieu des cultures de CSM ayant atteint une confluence de 70 % à 80 % dans des boîtes de 10 centimètres et ajoutez trois millilitres de solution de dissociation cellulaire. Incubez les boîtes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq minutes.Transférez les cellules dissociées dans un tube de 15 millilitres et centrifugez à 400 x G pendant cinq minutes. Aspirez le surnageant sans perturber le culot cellulaire et remettez les cellules en suspension. Ensuite, utilisez un compteur de cellules automatisé pour dénombrer les cellules.Diluez les cellules à une concentration de 1 × 10⁶ MSC par millilitre, dans du DMEM-F12 contenant 10 % de FCS et 1 % de P/S. Ensuite, ajoutez aux cellules dans des tubes de centrifugation de 1,5 millilitre un colorant fluorescent viable et non transférable, puis incubez les MSC pendant une demi-heure. Après centrifugation des tubes à 400 × g pendant cinq minutes, aspirez le surnageant et remettez en suspension le culot à une concentration de 1 × 10⁶ MSC par millilitre.Ensuite, transférez les CSM sur les cardiomyocytes à une concentration de 10 x 10⁴ cellules par puits d'une plaque à six puits. Pour préparer des co-cultures sous forme d'agrégats, préparez une suspension monocellulaire de CSM dans du MEM alpha, complété avec 10 % de FCS et 1 % de P/S. Initiez la formation d'agrégats en déposant des gouttes de 25 µL de suspension cellulaire sur la face interne des couvercles de boîtes de culture tissulaire de 10 cm.Placer les couvercles sur leurs compartiments inférieurs contenant du PBS P/S. Incuber les boîtes à 37 degrés Celsius et sous 5 % de dioxyde de carbone. Au microscope stéréo, observer la formation d'agrégats dans les gouttes après trois jours.Si plus de 80 % des gouttes contenaient des agrégats formés, utilisez une micropipette d'un millilitre pour recueillir les gouttes à partir des couvercles et transférez directement les agrégats sur des monocouches de cardiomyocytes primaires de rat. Incubez les co-cultures d'agrégats pendant deux semaines au maximum. Renouvelez le volume total du milieu toutes les 72 heures.Chaque jour, utiliser la microscopie en champ clair pour observer les agrégats qui s'attachent aux couches cellulaires fœtales. Noter les agrégats contractiles lorsqu'ils sont observés. Les agrégats actifs se contractent de manière synchronisée, ce qui suggère une conductivité entre eux à travers la couche fœtale, qui ne présente aucune activité physique.Aspirez le milieu et ajoutez deux millilitres de PBS par puits de la plaque à six puits. Ensuite, retirez le PBS et ajoutez deux millilitres de solution de dissociation par puits. Incubez les plaques à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant trois minutes.Comme illustré ici, les CSMM de trois types différents ont présenté une abondance et un aspect similaires dans les co-cultures directes. Deux à trois jours après le transfert des gouttes suspendues sur les cellules cardiaques dans des co-cultures sous forme d'agrégats, les CSMM fœtaux et les CSMM placentaires à terme sont apparus dans des agrégats plus volumineux par rapport à ceux issus des CSMM de moelle osseuse. Dans cette expérience, l'analyse par cytométrie en flux de l'expression de CD49F dans les CSMM non différenciés a montré que 96 % des CSMM fœtaux, 89 % des CSMM placentaires et 53 % des CSMM de moelle osseuse étaient positifs pour le marqueur de surface cellulaire CD49F.La cytométrie en flux sur les cellules TRA 85 a montré une surexpression du marqueur associé aux cardiomyocytes, SIRPA, dans les PBC huck FTM et les PBC huck à terme, mais pas dans les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (BMSCs) issues de co-cultures directes. Comme observé ici, la surexpression de cx43 était significativement plus élevée dans les PBC huck FTM par rapport aux PBC huck à terme ou aux BMSCs dans les co-cultures directes. Une analyse par microscopie fluorescente a révélé que les PBC huck FTM et les PBC huck à terme en cours de différenciation surexprimaient tous deux cx43.Avec des PBC huck, la proportion était plus élevée chez les FTM. Toutefois, la microscopie à fluorescence a révélé la présence de points positifs pour la connexine 43 dans la membrane cellulaire des PBC huck FTM, tandis qu'ils étaient principalement cytoplasmiques dans les cellules à terme. Enfin, comme illustré ici, une microscopie à fluorescence en fort grossissement a été réalisée sur des cellules humaines triées, après co-culture, et l'abondance élevée de la connexine 43 dans la membrane plasmique a été confirmée.Une fois maîtrisées, les étapes clés de cette procédure peuvent être réalisées en une heure chacune, à condition d'être effectuées correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel de respecter les précautions aseptiques. Les tissus animaux primaires utilisés peuvent introduire une contamination, s'ils ne sont pas manipulés correctement.Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes, comme la culture prolongée d'agrégats contractiles, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que la longévité de ces structures. Une fois développée, cette technique permet aux chercheurs spécialisés dans le domaine des CSM d'explorer le potentiel de différenciation de sources plus jeunes de cellules souches mésenchymateuses, telles que les tissus extra-embryonnaires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer des agrégats de CSM et les combiner avec des couches tissulaires fœtales primaires directes, d'une manière qui assure une induction adéquate vers la différenciation cardiomyogénique.N'oubliez pas que le travail avec le BRDU peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles qu'une manipulation appropriée des déchets cytotoxiques, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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JoVE Journal

Developmental Biology

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Cette vidéo montre comment effectuer la différenciation in vitro de cellules souches embryonnaires de souris aux corps embryoïdes utilisant la méthode de la goutte pendante.

Différenciation in vitro de souris embryonnaires souches (MES) Cellules utilisant la méthode de goutte suspendue

Nous avons établi un protocole pour l'induction de cardioblasts direct pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines maintenues dans des conditions définies avec de petites molécules, qui permet la dérivation d'une offre importante de progéniteurs cardiaques humaines et fonctionnel pour les cardiomyocytes cardiovasculaires réparation.

Dérivation efficace des ressources humaines précurseurs cardiaques et les cardiomyocytes à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

Les cellules souches pluripotentes, cellules embryonnaires ou soit souches pluripotentes induites (iPS), constituent une précieuse source de cellules différenciées humaines, y compris les cardiomyocytes. Ici, nous allons nous concentrer sur l'induction de cellules iPS cardiaque, en montrant comment les utiliser pour obtenir des cardiomyocytes humains fonctionnels à travers un protocole corps à base embryoïde.

Génération de cardiomyocytes humains: Un protocole de différenciation des induits des cellules souches pluripotentes humaines chargeur sans

L'article décrit la méthodologie détaillée pour différencier efficacement les cellules souches pluripotentes humaines dans les cardiomyocytes en modulant de manière sélective la voie Wnt, suivie d'une analyse par cytométrie en flux des marqueurs de référence pour évaluer l'homogénéité et l'identité de la population.

Haut différenciation de l&#39;efficacité de pluripotentes humaines des cellules souches à des cardiomyocytes et caractérisation par cytométrie en flux

Dans ce protocole, la dérivation de cellules progénitrices cardiaques à partir de cellules souches embryonnaires de souris et d’humains sera illustrée. L’une des principales stratégies de ce protocole consiste à enrichir les cellules progénitrices cardiaques par cytométrie en flux à l’aide de rapporteurs fluorescents intégrés dans les lignées de cellules souches embryonnaires.

Dérivation des cellules cardiaques progénitrices de cellules souches embryonnaires

Ici, nous décrivons un protocole robuste pour la dérivation des cardiomyocytes humains qui combine la différenciation cardiaque modulée par de petites molécules et la purification des cardiomyocytes médiée par la privation de glucose, permettant la production de cardiomyocytes purifiés à des fins de modélisation des maladies cardiovasculaires et de criblage de médicaments.

Dérivation des cardiomyocytes hautement purifiée de anthropiques cellules souches pluripotentes en utilisant de petits différenciation de Molecule-modulé et ultérieur glucose famine

Ce manuscrit décrit la création de tissus cardiaques modifiés définis à l’aide de l’expression de marqueurs de surface et du tri cellulaire. Les tissus définis peuvent ensuite être utilisés dans un bioréacteur multi-tissus pour étudier les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque afin de fournir un système modèle fonctionnel, mais contrôlé, du cœur humain.

Construction des Défini humaines Engineered cardiaques Tissues pour étudier les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque

La génération de cardiomyocytes à partir de cellules souches pluripotentes in vitro permet d’accéder à de grandes quantités de tissu cardiaque in vitro pour la science fondamentale et les applications cliniques.  Ce protocole utilise le facteur d’essai Grem2 pour augmenter le nombre de cardiomyocytes obtenus et pour générer des cardiomyocytes avec un phénotype auriculaire.

Différenciation des atrial cardiomyocytes à partir de cellules souches pluripotentes Utilisation de la BMP Antagonist Grem2

La caractérisation électrophysiologique des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (CMH-CM) est cruciale pour la modélisation de la maladie cardiaque et pour la détermination des réponses aux médicaments. Ce protocole fournit les informations nécessaires pour dissocier et plaquer les CMH-CM sur les réseaux multi-électrodes, mesurer leur potentiel de terrain et une méthode pour analyser les intervalles QT et RR.

Analyse électrophysiologique des cardiomyocytes à base de cellules souches pluripotentes humaines (HPSC-CM) utilisant des matrices multi-électrodes (MEA)

Ici nous décrivons et validons une méthode pour générer uniformément les cardiomyocytes pluripotents pluripotents de cellules souches induits par l'homme robustes et caractériser leur fonction. Ces techniques peuvent aider à développer un aperçu mécaniste des voies de signalisation, fournir une plate-forme pour le dépistage à grande échelle des médicaments, et modéliser de façon fiable les maladies cardiaques.

Génération de cardiomyocytes dérivés de HiPSC ventriculaires et de préparations cellulaires de haute qualité pour la caractérisation de la manipulation du calcium

Ici, nous présentons un protocole pour générer et développer de manière robuste des cardiomyocytes humains à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique du patient.

Génération et expansion de cardiomyocytes humains à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique du patient

Découvrez la différenciation cardiomyogénique des cellules souches mésenchymateuses humaines en cellules fonctionnelles. Cette méthode utilise des signaux environnementaux et la formation d'agrégats sans agents pharmacologiques.

In Vitro Différenciation des cellules souches mésenchymateuses humaines en cellules fonctionnelles Cardiomyocyte

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