Effets d’allogéniques Plasma riche en plaquettes (PRP) sur le processus de guérison des Tendons d’Achille sectionné des Rats : une Description méthodologique

L'objectif général de cette procédure est d'observer les effets d'une injection unique de plasma riche en plaquettes, ou PRP, sur la résistance et le processus de cicatrisation de tendons d'Achille de rats sectionés chirurgicalement à différents moments. Cette méthode peut aider à répondre rapidement à des questions dans le domaine musculosquelettique concernant les lésions tendineuses. Le principal avantage de cette technique est que les procédures chirurgicales, biomécaniques et celles liées à l'administration du PRP sont bien standardisées.

Les implications de ces techniques s'étendent à l'utilisation du PRP chez l'humain, car ce type de lésion et le processus de cicatrisation tendineuse sont similaires entre le rat et l'humain. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la préparation du PRP en cas de blessures musculosquelettiques, cette technique d'injection peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les maladies cardiaques ou cutanées. La démonstration visuelle de la méthode est très importante, car les étapes chirurgicales et biomécaniques exigent une reproductibilité constante afin d'obtenir des résultats optimaux.

Commencez par peser le rat et lui mettre une puce d'oreille. Après avoir confirmé le niveau approprié de sédation par une pression sur l'orteil, appliquez des gouttes d'eau sur les cornées de l'animal et rasez le poil de la patte postérieure gauche. Désinfectez la peau exposée avec une solution d'iso-Betadine diluée au 1/10, puis placez l'animal sur un tapis chauffant à 20 degrés Celsius sous un microscope stéréoscopique, en position latérale, avec la patte postérieure gauche en position supérieure.

Saisir la patte de la patte postérieure gauche avec une pince et pratiquer une incision cutanée latérale de 20 à 25 millimètres autour du tendon d’Achille. À l’aide de ciseaux fins, disséquer le fascia pour exposer le complexe du tendon d’Achille et retirer le tendon plantaire. Couper le tendon d’Achille transversalement, à cinq millimètres proximalement de son insertion calcanéenne, et retirer un segment de cinq millimètres de longueur.

Ensuite, utilisez un fil résorbable et poursuivez avec des points de suture pour fermer l’aponévrose et la peau, puis placez le rat sous une source de chaleur avec surveillance jusqu’à un réveil complet. Pendant que les animaux receveurs se remettent, prélève 20 millilitres de sang total à partir du cœur d’un rat donneur par animal expérimental dans des tubes individuels contenant du citrate de sodium tamponné à 3,2 %. Pour obtenir le plasma riche en plaquettes, centrifugez le sang et utilisez une pipette plastique de transfert pour récolter soigneusement la phase supérieure contenant le PRP dans un second tube en plastique.

Déterminez le volume de PRP recueilli et mesurez le taux de plaquettes à l’aide d’un analyseur hématologique. Effectuez une nouvelle centrifugation du PRP puis transférez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube en plastique. Le volume restant dans le tube de PRP doit représenter environ les 2/3 du volume nécessaire pour atteindre une concentration de 2,5 fois 10 à la puissance 6 plaquettes par microlitre.

Ensuite, remettez délicatement en suspension le culot plaquettaire à l’aide d’une pipette. Mesurez la concentration plaquettaire de ce plasma riche en plaquettes concentré, puis ajoutez le volume approprié de plasma pauvre en plaquettes autologue afin d’atteindre la concentration cible, si nécessaire. Activez les plaquettes avec 50 microlitres de chlorure de calcium par millilitre de PRP pendant environ une heure à température ambiante.

Ensuite, charger les plaquettes dans une seringue d'un millilitre munie d'une aiguille de calibre 21 et injecter 50 microlitres de plaquettes directement au site de suture de chaque animal. Au moment expérimental approprié, raser le membre hind gauche de l'animal expérimental anesthésié et placer le rat sous un microscope stéréo comme vient d'être démontré. En tenant la patte avec les doigts, pratiquer une incision de 10 millimètres au site chirurgical afin d'exposer le triceps sural.

Pour retirer le tendon d'Achille, sectionner transversalement l'os calcanéen à cinq à dix millimètres en dessous de son point d'insertion et disséquer un fragment du triceps sural suffisamment grand pour s'insérer dans la pince cryogénique. À l'aide de pinces, placer immédiatement l'échantillon dans la pince supérieure de la pince cryogénique et fermer l'instrument. Placer la pince cryogénique verticalement dans une machine universelle de traction et fixer l'os calcanéen entre les pinces inférieures.

Pour calculer la surface transversale, placez les caméras perpendiculairement les unes par rapport aux autres. Ajoutez de l'azote liquide dans les deux bacs de la mâchoire supérieure afin de congeler le muscle jusqu'à ce qu'il devienne d'un ordre de grandeur plus rigide que le tendon, de sorte qu'il ne se déforme pas pendant l'essai de traction. Lorsque la zone de congélation atteint la limite de la pince métallique, réglez la vitesse de déplacement de la machine à une vitesse constante d'un millimètre par seconde jusqu'à la rupture, puis commencez l'essai de traction, en utilisant un ordinateur pour enregistrer la résistance à la traction maximale en newtons.

Pour tenir compte des différences dans les aires de section transversale des tendons en cours de cicatrisation, normalisez la résistance à la traction maximale à une unité de surface représentant la contrainte mécanique subie par le tissu. Ensuite, lorsque le tendon rompt, congélez rapidement les échantillons de tendon rompus dans de l'azote liquide et conservez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu'à l'extraction d'ARN et l'analyse par RT-PCR. Dans cette expérience représentative, une force plus élevée a été nécessaire pour induire la rupture du tendon dans le groupe traité par PRP par rapport au groupe témoin traité par solution saline à chaque point temporel testé, suggérant un processus de cicatrisation plus robuste ou de meilleures propriétés mécaniques chez les animaux traités au PRP.

Bien que le groupe PRP ait présenté une dispersion intra-groupe plus élevée que le groupe au sérum physiologique, la surface transversale des tendons s'est révélée plus importante dans le groupe injecté de PRP aux jours 15 et 30 après l'induction de la lésion. De plus, la coloration de Masson trichrome a révélé une présence accrue de collagène fibrillaire, composant clé de la morphologie et de la résistance tendineuse, chez les animaux traités au PRP aux jours 5 et 15, avec une intensité de coloration similaire observée dans les deux groupes au jour 30 après injection. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'induire des lésions standardisées chez le rat, ainsi que de prélever le tendon afin d'évaluer son processus de cicatrisation après une injection de PRP.