Effets d’allogéniques Plasma riche en plaquettes (PRP) sur le processus de guérison des Tendons d’Achille sectionné des Rats : une Description méthodologique

L’objectif global de cette procédure est d’observer les effets d’une seule injection de plasma riche en plaquettes, ou PRP, sur la résistance et le processus de guérison des tendons d’Achille de rat sectionnés chirurgicalement à différents moments. Cette méthode peut aider à répondre à des questions rapides sur le domaine musculo-squelettique concernant les lésions tendineuses. Le principal avantage de cette technique est que les procédures chirurgicales, biomécaniques et de progression du PRP sont bien standardisées.

Les implications de ces techniques s’étendent à l’utilisation du PRP chez l’homme, car ces types de lésions et le processus de guérison des tendons sont similaires entre les rats et les humains. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la préparation du PRP pour les blessures musculo-squelettiques, cette technique d’injection peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que les maladies cardiaques ou cutanées. La démonstration visuelle de la méthode est très importante, car les étapes chirurgicales et biomécaniques nécessitent une reproductibilité constante afin d’obtenir des résultats optimaux.

Commencez par peser et marquer l’oreille du rat. Après avoir confirmé le niveau approprié de sédation par pincement des orteils, appliquez des gouttes d’eau sur les cornées de l’animal et retirez les poils du membre postérieur gauche. Désinfectez la peau exposée avec une dilution de un à 10 de la solution d’iso-bétadine et placez l’animal sur un coussin chauffant à 20 degrés Celsius sous un microscope à dissection en position de décubitus latéral, avec le membre postérieur gauche en position supérieure.

Saisissez la patte arrière gauche avec une pince et faites une incision cutanée latérale de 20 à 25 millimètres autour du tendon d’Achille. À l’aide de ciseaux fins, disséquez le fascia pour exposer le complexe du tendon d’Achille et retirez le tendon plantaire. Coupez le tendon d’Achille transversalement, à cinq millimètres de son insertion calcanéenne, et retirez une partie de cinq millimètres de long.

Ensuite, utilisez du fil résorbable et continuez avec des sutures pour fermer le fascia et la peau, et placez le rat sous une source de chaleur avec surveillance jusqu’à ce qu’il se rétablisse complètement. Pendant que les animaux receveurs se rétablissent, prélever 20 millilitres de sang total d’un cœur de rat donneur par animal de laboratoire dans des tubes individuels contenant 3,2 % de citrate de sodium tamponné. Pour obtenir le plasma riche en plaquettes, centrifugez le sang et utilisez une pipette de transfert en plastique pour prélever soigneusement la phase supérieure contenant le PRP dans un deuxième tube en plastique.

Déterminez le volume de PRP collecté et mesurez le nombre de plaquettes sur un analyseur d’hématologie. Centrifugez à nouveau le PRP et transférez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube en plastique. Le volume restant dans le tube PRP doit être d’environ 2/3 du volume nécessaire pour atteindre 2,5 fois 10 à la sixième plaquettes par microlitre.

Ensuite, remettez doucement la pastille plaquettaire en suspension avec un pipetage. Mesurez le nombre de plaquettes de ce plasma concentré riche en plaquettes, en ajoutant le volume approprié de plasma autologue pauvre en plaquettes pour atteindre la concentration cible si nécessaire. Activez les plaquettes avec 50 microlitres de chlorure de calcium par millilitre de PRP pendant environ une heure à température ambiante.

Ensuite, chargez les plaquettes dans une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 21 et injectez 50 microlitres de plaquettes directement dans le site de suture de chaque animal. Au point final expérimental approprié, rasez le membre postérieur gauche de l’animal de laboratoire anesthésié et placez le rat sous un microscope de dissection comme nous venons de le démontrer. En tenant la patte avec les doigts, faites une incision de 10 millimètres dans le site chirurgical pour exposer le triceps suralis.

Pour retirer le tendon d’Achille, coupez l’os calcanéen transversalement, à cinq à 10 millimètres distal de son attache et disséquez un morceau du triceps suralis suffisamment grand pour s’insérer dans la cryo-mâchoire. À l’aide d’une pince, placez immédiatement l’échantillon dans la mâchoire supérieure de la cryomâchoire et fermez l’instrument. Placez la cryo-mâchoire verticalement dans une machine d’essai universelle et fixez l’os calcanéen entre les pinces inférieures.

Pour calculer l’aire de la section transversale, placez les caméras perpendiculairement les unes aux autres. Ajoutez de l’azote liquide dans les deux bassins de la mâchoire supérieure pour geler le muscle à un ordre de grandeur plus rigide que le tendon, afin qu’il ne se déforme pas pendant l’essai de traction. Lorsque la zone de congélation atteint le bord de la pince métallique, réglez le taux de déplacement de la machine à une vitesse constante d’un millimètre par seconde jusqu’à la rupture et commencez l’essai de traction, à l’aide d’un ordinateur pour enregistrer la résistance à la traction ultime en Newtons.

Pour tenir compte des différences dans les sections transversales des tendons en cours de cicatrisation, normalisez la résistance à la traction ultime à une unité de surface qui représente la contrainte mécanique subie par le tissu. Ensuite, lorsque le tendon se rompt, congelez les échantillons de tendon rompu dans de l’azote liquide et stockez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’extraction de l’ARN et l’analyse RTPCR. Dans cette expérience représentative, une force plus importante a été nécessaire pour induire la rupture du tendon dans le groupe injecté de PRP que dans le groupe témoin traité au sérum physiologique à chaque point temporel testé, suggérant un processus de guérison plus robuste ou de meilleures propriétés mécaniques chez les animaux traités au PRP.

Bien que le groupe PRP ait montré une dispersion intra-groupe plus élevée que le groupe salin, la section transversale des tendons a été déterminée comme étant plus grande dans le groupe injecté de PRP aux jours 15 et 30 après l’induction de la lésion. De plus, la coloration trichrome de Masson a révélé une présence plus élevée de collagène fibrillaire, un composant clé de la morphologie et de la force des tendons, chez les animaux traités au PRP aux jours 5 et 15, avec une intensité de coloration similaire observée dans les deux groupes au jour 30 après l’injection. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’induire des lésions standard chez le rat et d’échantillonner le tendon pour évaluer leur processus de guérison après une injection de PRP.