Techniques de laboratoire utilisées pour maintenir et différencier les biotypes de Vibrio cholerae Isolats cliniques et environnementaux

L’objectif global de cette technique est de fournir un ensemble de protocoles simples à mettre en œuvre et pouvant aider tout chercheur à caractériser un isolat clinique ou environnemental donné de Vibrio cholerae. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la bactériologie, telles que les caractéristiques génotypiques et phénotypiques spécifiques de tout isolat de Vibrio cholerae, en particulier celles qui ont une pertinence clinique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet à tout investigateur d’utiliser cette collection de tests pour caractériser et distinguer de manière fiable les isolats cliniques ou environnementaux de Vibrio cholerae.

Ensemble, ces tests fournissent une approche systématique à utiliser comme alternative ou en plus des expériences coûteuses à forte intensité de main-d’œuvre et de la caractérisation des isolats cliniques et environnementaux de Vibrio cholerae. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la caractérisation des biotypes de Vibrio cholerae, elle peut également être appliquée pour caractériser les capacités biochimiques et métaboliques d’autres bactéries entériques. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à gérer leur temps, car les temps d’incubation nécessaires pour garantir des résultats optimaux diffèrent d’un test biochimique à l’autre.

Des démonstrations visuelles des protocoles de repérage et de poignardage sont essentielles, car les éclaboussures peuvent souvent entraîner une contamination croisée et un espacement maximal est nécessaire pour empêcher la fusion entre les cultures. Commencer le protocole en granulant 1,8 mL de culture liquide pendant la nuit pendant deux minutes par centrifugation à un minimum de 8 600 xG dans un tube de microcentrifugation stérile de 2 mL. Après la centrifugation, retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 900 mcL de bouillon frais Luria-Bertani ou LB par pipetage.

Ensuite, ajoutez 900 mcL de glycérol stérile à 60 % de volume à volume à la culture et mélangez par vortex. Transférez le mélange dans un tube cryogénique stérile de 2 ml et conservez la culture mère à 80 degrés Celsius. Pour utiliser le bouillon, avec une boucle d’inoculation stérile, prélever une petite quantité de bouillon congelé et strier les bactéries pour obtenir des colonies uniques sur des plaques de gélose LB.

Remettez immédiatement le bouillon congelé à 80 degrés Celsius après utilisation pour éviter que les cultures ne dégèlent complètement. Incuber les assiettes, couvercle vers le bas, pendant 12 à 16 heures à 37 degrés Celsius. Obtenez l’assiette préalablement préparée.

Inoculer 4 mL de bouillon LB liquide dans un tube de culture stérile de 10 mL avec une seule colonie en touchant la surface de la colonie unique avec une boucle stérilisée et en transférant la colonie dans le bouillon liquide. Ensuite, incubez la culture avec aération dans un incubateur à agitateur à 225 tr/min pendant 12 à 16 heures à 37 degrés Celsius. Préparez la culture pendant la nuit dans un bouillon LB liquide.

Le lendemain, granulez la culture et lavez les cellules en remettant en suspension la pastille cellulaire dans 1,8 mL de solution saline tamponnée au phosphate ou PBS. Répétez la procédure de lavage trois fois. Après le troisième lavage, une remise en suspension finale dans 1,8 mL de 1x PBS.

Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette, repérez 1 mcL de culture lavée sur le milieu respectif. Lavez la pastille cellulaire obtenue à partir d’une culture nocturne. Inoculer des plaques de gélose de motilité en insérant un stab d’inoculation dans la culture liquide lavée et poignarder verticalement dans le milieu.

Assurez-vous que le couteau d’inoculation ne se plie pas pendant que vous poignardez la gélose. Entre chaque inoculation, stérilisez le poignardage à l’aide d’un bec Bunsen. Incuber les assiettes, couvercle vers le haut, pendant 14 à 24 heures à 37 degrés Celsius.

Après 14 heures, surveillez de près les plaques de motilité pour éviter la prolifération des cultures. Inoculer 4 ml de bouillon Methyl Red Voges-Proskauer ou MR-VP en pipetant 10 mcL de culture de nuit préalablement préparée dans 4 mL de bouillon MR-VP dans un tube de culture stérile et incuber avec aération dans un incubateur à agitateur à 225 tr/min pendant 12 à 16 heures à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 150 mcL de 5 % en poids par volume d’alpha-naphtol et 50 mcL de 40 % en poids par volume d’hydroxyde de potassium à 1 mL d’aliquotes de la culture de nuit MR-VP dans des tubes de culture stériles respectivement.

Ensuite, faites brièvement tourbillonner les tubes. Laissez les tubes reposer à température ambiante jusqu’à quatre heures jusqu’à ce qu’un changement de couleur se développe. Des souches de référence de biotypes et des variants représentatifs d’El Tor ont été inclus dans les tests de base PCR, les tests génétiques et les tests phénotypiques afin de distinguer les antécédents biotypiques des isolats cliniques et environnementaux de V. Cholerae.

Le classique O395 de type sauvage a démontré des séquences classiques ctxB et tcpA. À l’inverse, les souches N16961 et C6706 d’El Tor de type sauvage ont montré des séquences ctxB et tcpA d’El Tor. MQ1795 et BAA-2163 contiennent la sous-unité classique de biotype ctxB comparable à 0395.

Pourtant, les deux variantes d’El Tor contenaient le tcpA indicatif du contexte biotypique d’El Tor. Lorsqu’elle a été cultivée sur des plaques de gélose LB complétées par de la polymyxine B, la souche de biotype classique de type sauvage 0395 a montré une sensibilité à la polymyxine B tandis que la souche de biotype El Tor de type sauvage a montré une résistance. Les souches représentatives de la variante El Tor ont démontré une résistance similaire à l’antibiotique.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de distinguer les biotypes de Vibrio cholerae à l’aide du système d’identification à tests multiples décrit dans ce manuscrit. N’oubliez pas que travailler avec des agents pathogènes BSL-2 peut être extrêmement dangereux et que la manipulation et l’élimination appropriées de tous les matériaux et déchets doivent être appliquées conformément aux réglementations institutionnelles, locales, étatiques et fédérales. En plus des protocoles énumérés dans ce manuscrit, une caractérisation plus poussée des isolats de Vibrio cholerae peut être réalisée en étudiant d’autres propriétés phénotypiques telles que la formation de biofilms et l’autoagglutination.