Un système intégré pour déclencher à distance Transduction de signaux intracellulaires par Photoactivation Kinase induite par l’Upconversion Nanoparticle

L'objectif de cette expérience est de démontrer la faisabilité de photoactiver une enzyme à l'aide d'une irradiation proche infrarouge. Une protéine kinase A piégée est immobilisée à la surface de nanoparticules de conversion ascendante micro-injectées dans des cellules, et la réponse induite par la kinase dans des cellules vivantes est observée après irradiation proche infrarouge. L'activation photochimique traditionnelle nécessite une lumière UV phototoxique et entraîne inévitablement des réactions chimiques indésirables ainsi que des réponses similaires ; toutefois, dans notre option plus douce, comme l'irradiation proche infrarouge, aucune réaction n'est déclenchée en raison de son faible niveau d'énergie.

La nanoparticule de conversion ascendante peut efficacement convertir des photons proches du domaine infrarouge, à faible énergie et biocompatibles, en photons ultraviolets à haute énergie, déclenchant ainsi une réaction chimique à proximité de la surface de la particule, sans nécessiter d'irradiation UV directe. Les kinases jouent un rôle clé dans l'oncogenèse ; cette technique peut nous aider à examiner davantage d'informations sur la transduction du signal, avec un bruit parasite bien moindre provenant de la phototoxicité UV et de ses réactions secondaires. En général, les personnes novices dans ce domaine éprouvent des difficultés à modifier les instruments et le montage optique pour des applications de conversion ascendante.

Pour commencer, installez un objectif 4x à côté du porte-cuvette du fluorospectromètre, de sorte que le laser puisse être focalisé au centre de la cuvette. Placez une diode laser réglable de 980 nanomètres à 90 degrés par rapport à l'objectif. Installez un miroir de réflexion totale et l'intersection du trajet lumineux entre l'objectif et le laser.

N'oubliez pas de placer une plaque métallique anodisée pour bloquer la fenêtre d'excitation du spectromètre afin de protéger les pièces internes. Ensuite, placez une cuvette contenant une solution de nanoparticules de conversion ascendante revêtues de silice dans le porte-cuvette. Un faisceau de conversion ascendante intense peut être visualisé lorsque le laser s'allume.

Passer la spectroscopie en mode luminescence, avec la tension PMT la plus faible pendant les alignements. Ajuster les miroirs et les supports du laser afin que le faisceau traverse le centre de la cuvette pour que le PMT capte le signal le plus intense. Après avoir installé un miroir dichroïque et un filtre d'excitation, installer une diode laser de 980 nanomètres dans le trajet lumineux du niveau inférieur.

Ajoutez un collimateur entre le laser et le miroir pour aider à diffuser et agrandir la zone d'irradiation dans le plan focal. Ensuite, utilisez une solution de nanoparticules de conversion ascendante pour visualiser le faisceau infrarouge. Ajustez la position de la platine du laser afin de centrer le faisceau lumineux infrarouge pour terminer l'alignement.

Réalisez la synthèse de la PKA piégée et démobilitsez la PKA piégée/UCNP, afin de générer la PKA piégée/UCNP comme décrit dans le protocole écrit. Pour mesurer l'activité des deux constructions avant la photolyse UV, mesurez la diminution de l'absorbance du NADH dans le mélange d'essai au cours du temps après l'ajout de deux microlitres de solution de PKA au mélange d'essai. Répétez la mesure pour la PKA/UCNP.

Ensuite, effectuez une photolyse UV à 200 milliwatts par centimètre carré sur la PKA piégée et le complexe PKA piégée/UCNP, dans un bain d’eau glacée, afin de s’assurer que la PKA peut être activée. L’activité de la PKA est déterminée par un dosage enzymatique couplé impliquant la pyruvate kinase et la lactate déhydrogénase. Une diminution de l’absorbance de la NADH est mesurée au cours du temps après l’ajout de la solution de PKA.

Incuber les cellules dans un milieu L15 contenant 10 % de sérum de veau fœtal pendant la période de microinjection afin d'assurer un contrôle stable du pH en dehors de l'incubateur. Configurer l'extracteur d'aiguille pour obtenir une pointe en forme de cône d'un diamètre d'environ 1,5 micron pour l'ouverture ultérieure de la pointe. Pour ouvrir la pointe, installer l'aiguille sur le microinjecteur, amener la pointe de l'aiguille au contact du bord d'une lame, puis donner une légère tape sur la platine du microscope.

Cette force de vibration est suffisante pour casser légèrement la pointe et agrandir l'ouverture. Examiner l'ouverture de l'aiguille afin de s'assurer qu'elle possède un diamètre externe compris entre 1,3 et 1,5 micromètre, ce qui peut être confirmé par des images au microscope utilisant un objectif de 40x. Ensuite, régler la pression d'injection entre 50 et 75 hectopascals avec un intervalle de pressurisation de 200 à 300 millisecondes, et régler la pression de compensation constante entre 15 et 30 hectopascals afin d'empêcher le reflux du milieu dans l'aiguille.

Chargez le complexe PKA piégée/UCNP avec le colorant TAMRA à l'extrémité arrière de l'aiguille. L'aiguille chargée est ensuite fixée sur un micromanipulateur hydraulique uniaxial, avec un angle compris entre 30 et 45 degrés. Vérifiez l'aiguille au microscope afin de vous assurer qu'aucune bulle n'est formée après le chargement de l'échantillon.

Après avoir plongé l'aiguille dans le milieu, passez en mode fluorescence pour confirmer une libération soudaine de colorant lorsque la pression d'injection est appliquée, et une libération lente du colorant lorsque la pression de compensation est maintenue constante. Puis, passez en mode champ clair en contraste de phase afin de commencer la microinjection cellulaire. L'onde de choc membranaire peut être observée lors d'injections réussies.

Lavez les cellules deux fois et vérifiez la fluorescence TAMRA co-injectée pour repérer les cellules ayant été microinjectées avec succès. Les cellules ayant intégré les UCNP mais ne présentant pas de signal de colorant co-injecté indiquent que la membrane cellulaire a été rompue pendant l'injection et doivent être exclues des expériences ultérieures. Irradiez les cellules avec une diode laser de 980 nanomètres dans le trajet lumineux inférieur, focalisée par un objectif 10x, pendant 15 minutes.

Prévoir un intervalle d'obscurité de cinq minutes après chaque période d'irradiation de cinq minutes afin d'éviter tout échauffement. Si un temps d'activation plus court est nécessaire, comme quelques secondes ou même des sous-secondes, il suffit de passer à un objectif 40x pour obtenir une densité de photons plus élevée au point de focalisation. Après la photolyse et la récupération des cellules, fixer les cellules dans un millilitre de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant 20 minutes, avant de procéder à une coloration ultérieure avec l'Alexa 594.

Enfin, visualisez la désintégration des fibres de stress induite par le proche infrarouge (NIR). Après irradiation par le NIR, les cellules microinjectées avec PKA piégée/UCNP, indiquées par des flèches blanches, présentent une émission de conversion ascendante. La désintégration des fibres de stress provoquée par une photoactivation réussie du PKA par le NIR expose davantage d'actine F, ce qui entraîne par conséquent une coloration verte intense au voisinage des UCNP.

Un témoin négatif, dans lequel les cellules sont microinjectées mais restent à l’obscurité, ne montre aucune désintégration des fibres de stress. Le niveau d'exposition de l'actine F après photoactivation par lumière proche infrarouge peut être marqué par l'Alexa 594, suivi puis quantifié à l'aide d'ImageJ. Des courbes d'intensité de la coloration de l'actine F le long de la flèche rouge ont été tracées, fournissant des informations quantitatives sur la désintégration des fibres de stress, que l'on peut corréler à l'activité PKA induite par la lumière proche infrarouge. Une fois la microinjection maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une seule journée, y compris la préparation et le contrôle qualité du PKA piégé/UCNP.

Avec nos instructions concernant les modifications de l'instrument et les expériences, la réaction souhaitée peut être déclenchée par un rayonnement proche infrarouge, avec une résolution spatio-temporelle élevée, comme les méthodes classiques utilisant l'UV pour les titrages, mais sans phototoxicité, et elle n'est pas contagieuse. Après avoir visionné cette vidéo, nous espérons que vous comprenez bien comment délivrer un complexe nanoparticule-enzyme dans une cellule par microinjection et activer l'enzyme par photoactivation, en utilisant une lumière proche infrarouge compatible avec les systèmes biologiques. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs en biologie chimique, qui doivent utiliser la lumière pour déclencher des réactions enzymatiques spécifiques dans des cellules vivantes avec une résolution spatio-temporelle, lorsque les cellules ne tolèrent pas la phototoxicité induite par l'UV.

Après cette procédure, d'autres bioactivateurs peuvent être associés à des nanoparticules de conversion ascendante, afin de répondre à des questions supplémentaires nécessitant une photoactivation spatiotemporelle. Si le bioactivateur agit de manière extracellulaire, une microinjection n'est même pas nécessaire. La plateforme de photoactivation proche infrarouge peut également offrir une pénétration plus profonde dans les tissus et peut donc être utilisée chez de petits animaux pour déclencher des réactions souhaitées au moment et à l'endroit précisés.