Name: Un système intégré pour déclencher à distance Transduction de signaux intracellulaires par Photoactivation Kinase induite par l’Upconversion Nanoparticle (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Découvrez la photoactivation de la protéine kinase A en cellules vivantes par irradiation proche infrarouge via des nanoparticules à conversion ascendante. Cette méthode réduit la phototoxicité UV et permet d'étudier les voies de signalisation cellulaire.

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Nous remercions la Nano sciences et technologie Programme de l’Academia Sinica et le ministère des sciences et de technologie de Taiwan pour le financement (101-2113-M-001-001-MY2 ; 103-2113-M-001-028-MY2).

Remarque : le protocole décrit une modification d’instrumentation détaillée de photoactivation upconversion assistée, une méthode de synthèse pour générer avec cage PKA-UCNP, microscopie électronique à transmission (TEM) de la UCNP enrobées de silice et mis en cage d’échantillons de PKA-UCNP, installation de photolyse UV et NIR, préparation de cellules, microinjection PKA-UCNP, une étude de photoactivation et la coloration de fibres de stress des cellules REF52.
 1. fluorimètre Setup pour la mesure du spectre Upconversion <ol><li>installer un objectif 4 X à côté de la titulaire de la cuvette du spectromètre fluorescence afin que le laser est axé sur le milieu de la cuve.</li>
	<li>Placer une diode laser accordable de 980 nm 0,5 - 8 W 90° contre le porte-objectif. 
	ATTENTION : L’opérateur doit avoir des connaissances en sécurité laser et porter des lunettes de protection laser NIR.</li>
	<li>Installer un miroir de réflectance complet à l’intersection de trajet optique de la lentille de l’objectif et le laser. Placez une plaque de métal anodisée noire pour bloquer la fenêtre de l’excitation de la spectroscopie et de protéger les parties intérieures.</li>
	<li>Placer la cuve de solution UCNP enrobées de silice (0,2 – 0,6 mg/mL) dans le porte-cuvette afin qu’un faisceau lumineux upconversion peut être visualisé et peut être utilisé pour régler l’alignement lumineux meilleur pour installation miroir.</li>
	<li>Passer la spectroscopie de luminescence mode avec réglage de tension plus bas PMT (ajuster à un réglage plus élevé si le signal est trop faible). Ajuster le miroir pour l’orientation optimale, où le faisceau se trouve au milieu de la cuvette et le PMT capte le signal le plus fort.</li>
	<li>Mesurer le spectre de la conversion ascendante, après mise en conformité, avec le réglage de la puissance désirée. Utiliser un mesureur de puissance thermique de pile pour construire une courbe d’étalonnage de la puissance du laser contre la lecture de courante électrique sur l’alimentation du laser. Vérifier constamment la performance laser pour s’assurer que la performance se situe entre calibré.</li>
</ol> 2. Configuration de microscope Remarque : la configuration suivante fonctionne pour microscopes équipés de deux niveaux de trajet optique. Si l’utilisateur a l’intention d’installer un commutateur de source lumineuse d’excitation dans le port arrière pour faire le laser NIR et la lampe haloïde partager le même port, le collimateur dans le port arrière se bloque significativement le RNI parce qu’il est conçu pour réduire le chauffage de l’échantillon. L’utilisateur doit faire un choix difficile : garder le collimateur souffrent d’upconversion très faible efficacité, ou enlever le collimateur et sacrifier l’intensité d’excitation lumineuse pour l’épifluorescence.
 Remarque : un schéma en coupe montrant le schéma de trajet optique pour un spectrofluorimètre modifié, la microscopie pour upconversion luminescence et NIR photolyse mode et épifluorescence mode de photolyse UV et expérimental utilisé pour cette expérience sont illustrées à la Figure 2.
Guide <ol><li>Equip le microscope à fluorescence avec un halogénure en métal léger, dirigée vers l’arrière port. 
	Remarque : dans ce chemin de lumière de palier supérieur où il y a une tourelle de cube, un cube position doit être vide pour permettre NIR venant de la couche basse lumière chemin.</li>
	<li>Installer une diode de laser accordable pour 0,5 à 8,0 W 980 nm dans le port de droite, avec le collimateur orifice ouvert. 
	Remarque : Cela agrandit le laser lumière spot à environ 500 µm diamètre lorsqu’un objectif de 10 X est utilisé. Enlever ce collimateur se traduit par une tache lumineuse-micromètre et fait irradiation cellule NIR est impossible. Ce collimateur est transparent NIR.</li>
	<li>Installer un miroir dichroïque (850 nm court-pass) et un filtre d’excitation (long-col de 950 nm) dans la couche basse lumière chemin d’accès.</li>
	<li>Utiliser une solution UCNP pour visualiser le spot lumineux de NIR. Ajustez la position du laser pour centrer le faisceau lumineux de NIR dans le champ de vision à la fin de l’alignement.</li>
</ol> 3. Préparation et caractérisation de PKA-UCNP avec cage construire <ol><li>incuber PKA recombinante (9 µM) avec 0,5 mM 2-nitrobenzylbromide (BNB) dans la mise en cage tampon (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl et 10 mM MgCl 2 ; pH 8,5) pendant 1-2 h à 25 ° C. Quench la BNB excès avec 10 mM dthiothreitol (TNT) et puis dialyser contre 4-(2-hydroxyéthyl) tampon (10 mM, pH 7,5) pour enlever l’excès réactifs et sels de pipérazine-1-ethanesulfonic acide (HEPES). 
	Nota : Le pH de la solution mise en cage est abaissé de 8,5 à 7,5 pendant la dialyse dont le pH est HEPES 7.5 pour la réaction d’immobilisation ultérieure.</li>
	<li>Mix le lanthanide sels-Y(CH3CO2) 3 l’hydrate (99,9 %, 0,4527 g, 1,38 mmol), Yb (CH 3 CO 2) 3 hydrate (99,9 %, 0,2533 g, 0,60 mmol) et Tm (CH 3 CO 2) 3 hydrate (99,9 %, 0,0168 g, 0.02 mmol)-octadecene (30 mL) et en acide oléique (12 mL), chauffer le mélange à 115 ° C pendant 30 minutes et refroidir à 50 ° C. Ensuite, dissoudre le mélange réactionnel dans une solution méthanolique (20 mL) avec 0,2 g (5,0 mmol) de NaOH pellet et 0,2964 g (8 mmol) de fluorure d’ammonium par sonication pendant 15 min. Augmentez la température de réaction à 300 ° C pour obtenir le noyau UCNP (β-Chana 4 : 1,0 % Tm 3 + / 30 % Yb 3 +) nanoparticules.</li>
	<li>Dissoudre les nanoparticules de base (25 mg) avec CO-520 (0,5 mL) dans le cyclohexane (10 mL). Ajouter orthosilicate (TEOS, 0,04 mL) et l’ammoniac (wt 30 % v/v, 0,08 mL) et appliquer une agitation constante pendant 12 h à température ambiante pour obtenir le β-Chana enrobées de silice 4 : 1.0%Tm 3 + /30%Yb 3 + noyau nanoparticules.</li>
	<li>Incuber le PKA (6 nmol) ou mis en cage de PKA (6 nmol) avec UCNP (1 mg) 15 dans un tampon HEPES (10 mM, pH 7,5) à 4 ° C pendant 3 h immobiliser le PKA sur enrobées de silice UCNP via des interactions électrostatiques.</li>
	<li>Filtrer le mélange à l’aide de filtre PVDF (0,45 µm), centrifuger à 17 000 x g pendant 10 min à 4 ° C et redisperse le culot dans HEPES (50 µL, 10 mM, pH 7,5) contenant 0,1 % protéines stabilisantes pour obtenir le complexe purifié de la PKA-UCNP. Centrifuger à 17 000 x g pendant 10 min à 4 ° C et recueillir le surnageant pour un dosage de Bradford dans un tube de 1,5 mL.</li>
	<li>Analyser le PKA illimité dans le surnageant sauvé de l’étape 3.5 avec un dosage de Bradford pour dos-calculer le degré de substitution de PKA sur les particules UCNP, qui ont normalement un niveau de substitution de ~ 4,5 nmol de PKA par mg de particule. 
	Remarque : L’analyse de Bradford révèle une forte couleur bleue sur les pellets, qui suggère une immobilisation de teneur élevée en protéines de niveau et stable sans la désorption, tandis que la fraction surnageante du caged solution PKA-UCNP montre une couleur semblable à (tampon HEPES figure 4 c-4F).</li>
</ol> 4. Caractérisation Remarque : l’analyse de la kinase est utilisée pour quantifier l’activité spécifique de la pyruvate kinase. En bref, la phosphorylation du peptide, qui est couplé à la kinase de pyruvate et de lactate déshydrogénase, entraîne l’oxydation du NADH. La formation de ce dernier est surveillée en mesurant la diminution de l’absorption du NADH à 340 nm.
<ol><li>Déterminer l’activité de la PKA et PKA-UCNP dans un volume total de 60 µL du mélange d’essai contenant de l’acide 4-morpholinepropanesulfonic (MOPS, 100 mM, pH 7,5), KCl (100 mM), phosphoénolpyruvate (PEP, 1 mM), l’adénosine triphosphate (ATP, 1 mM), β - nicotinamide adénine dinucléotide, réduit la forme (NADH, 0,8 mM), le chlorure de magnésium (MgCl 2, 1 mM), kemptide (0,4 mM) et un mélange de déshydrogénase pyruvate kinase/lactate (30/40 unités de PK/LDH).</li>
	<li>Mesurer la diminution de l’absorbance de NADH au fil du temps après l’addition de solution de PKA (2 µL) au mélange de dosage. Calculer la pente de la ligne pour refléter directement l’activité de la kinase mesurée.</li>
	<li>Mesurent l’activité de la PKA-UCNP 15 et l’activité globale, qui devrait être s’alliant parfaitement avec le produit de la multiplication des indigène activité PKA-spécifique et le montant calculé de revêtu de PKA.</li>
</ol> 5. Photolyse Setup <ol><li>ameURE toute puissance de la lumière des sources à l’aide d’un capteur thermique de pile et calculer des densités de puissance (PD = puissance (W) / zone (cm 2)) 18 basé sur la zone de lumière spot.</li>
	<li>Effectuer des expériences de photolyse en vitro UV sur un système commercial avec un 365 nm LED (200 mW/cm 2) 15.</li>
	<li>Pour UV photoactivation sur la platine du microscope, illuminer la solution PKA-UCNP avec l’excitation lumière filtrée par un cube commercial 15. 
	Remarque : La densité de puissance est ~ 15 mW/cm 2, sans objectif concentrer.</li>
	<li>Pour in vitro photoactivation NIR sur la platine du microscope, illuminer la solution PKA-UCNP à l’aide d’un laser à 980 nm avec des paramètres de filtre/miroir upconversion personnalisé installés sur le parcours lumineux de palier inférieur, un miroir dichroïque (850 nm court-pass), et un filtre d’excitation (950 nm de long-pass). 
	Remarque : La densité de puissance de sortie est de 5 W/cm 2 avant 4 X objectif axé. La densité de puissance est estimée à ~ 68 W/cm 2 après 4 X objectif objectif mise au point.</li>
</ol> 6. Cellule de préparation des échantillons et Complexes de la Microinjection de PKA-UCNP <ol><li>préfiltrer les échantillons à travers un filtre de 0,45 µm après immobilisation PKA (étape 3.5).</li>
	<li>Incuber les cellules contenant le support de L-15 pendant la période de microinjection pour contrôle du pH stable à l’extérieur de l’incubateur 10 % sérum fœtal (SVF). 
	NOTE : pour confirmer l’achèvement de la microinjection, co injecter le PKA-UCNP native, PKA-UCNP en cage ou PEGylated UCNP (7,5 mg/mL) 15 avec 5 6-carboxytetramethylrhodamine (Lion) (10 µM) en cellules.</li>
	<li>Ajuster la concentration des particules PKA-UCNP telle que, après la microinjection, la concentration cytosolique est de 1 à 3 μM PKA - une plage de concentrations physiologiques de PKA dans une cellule, avec l’hypothèse que le volume d’injection est de 1/10 du volume cellulaire .</li>
	<li>Effectuer la microinjection dans les cellules (étape 6.2) à l’aide d’un dispositif de microinjector couplé avec un micromanipulateur hydraulique d’un axe ( Figure 3).</li>
	<li>Utiliser un manomètre numérique pour surveiller la pression appliquée par le microinjector est dans la plage de fonctionnement (~ 50-200 hPa) et sceller la valve distributeur dans une chambre de pressurisation personnalisée pour fournir une pression de compensation pour la microinjection. Tirez l’aiguille à l’aide d’un extracteur.</li>
	<li>Maintenir la pression d’injection entre 50 et 75 hPa, avec un temps d’injection de 200-300 ms et la pression de compensation à 15 hPa pour empêcher les reflux de milieu de culture en aiguille par capillarité.</li>
	<li>Examiner les ouvertures de la pointe des aiguilles pour s’assurer qu’ils ont un diamètre extérieur entre 1,3 et 1,5 µm, ce qui peut être confirmé en prenant des images à l’aide d’une lentille d’objectif 40 x.</li>
	<li>Laver les cellules avec 2 mL de milieu de L-15 contenant 10 % de FBS après la microinjection. Observer l’imagerie de fluorescence cellulaire de 5 (6) - carboxytetramethyl - rhodamine (TAMRA) pour confirmer l’achèvement de la microinjection.</li>
</ol> 7. Photoactivation de cage PKA-UCNP en utilisant les UV ou lumière NIR dans les cellules vivant <ol><li>pour UV photoactivation après la microinjection de PKA-UCNP, cultiver les cellules REF52 sur un plat de 3,5 µm, placez-les sur la platine du microscope et les irradier avec lumière UV filtré par le cube pendant 3 min sans objectif concentrer. 
	Remarque : REF52 cellules ont été maintenues en DMEM contenant 10 % FBS à 37 ° C dans une étuve à 2 CO 5 % et les cellules étaient repiquages lorsque la confluence atteint à 90 % tous les jours 2-3.</li>
	<li>Pour NIR photoactivation après microinjection de PKA-UCNP, éclairer les cellules sur un laser 980 nm de paramètres de filtre/miroir de palier inférieur, comme indiqué au point 5.4. 
	Remarque : La densité de puissance est 5 W/cm 2 avant 10 X objectif objectif mise au point et est estimée à 300 W/cm 2 après 10 x objectif objectif mise au point. Conversion ascendante est un processus qui exige une densité élevée de photon, surtout quand un plus grand déplacement d’anti-Stoke est nécessaire. Par conséquent, mise au point est nécessaire au cours de photoactivation.</li>
	<li>Quand il faut un plus gros spot lumineux (650 µm x 520 µm), irradier ces cellules avec NIR concentré par une lentille d’objectif 10 x avec un collimateur pendant 15 min. autoriser pour un intervalle de 5 min sombre après chaque irradiation 5 min pour éviter un échauffement. 
	Remarque : Lorsqu’une haute résolution spatiale (spot lumineux subcellulaire) est nécessaire d’utiliser l’objectif X 40 avec un sténopé, installé à l’extrémité de sortie de la lumière guide pour générer un spot lumineux subcellulaires-dimension (5 µm x 4 µm). Dans ce cas, 1 s de l’irradiation est suffisant pour la photoactivation NIR en raison du haut flux de photons.</li>
	<li>Photolyse après UV ou NIR, laissez les cellules récupérer dans un incubateur à CO 5 % 2 à 37 ° C pendant 1 h dans un milieu complet pour générer des réponses cellulaires. Par la suite, fixez-les dans 1 mL de 4 % paraformaldéhyde/tampon phosphate salin (PBS) pendant 20 min avant la coloration plus. 
	ATTENTION : Paraformaldéhyde est hautement toxique ; éviter tout contact avec la peau, les yeux ou les muqueuses. Éviter de respirer la poudre au cours de la mesure et de préparation.</li>
</ol> 8. Visualisation du Stress fibre désintégration causée par Photoactivation NIR <ol><li>après la fixation, utiliser Alexa 594-phalloïdine (ajouter 5 µL de la solution mère de 6,6 µM à 200 µL de PBS pour souiller ; incuber pendant 25 minutes à température ambiante) sur la tache et visualiser les fibres de stress. Visualiser les images de Alexa 594-phalloïdine (Ex 581 nm/Em 609 nm) à l’aide d’un ensemble de filtre à.</li>
	<li>Incuber les cellules pendant 5 min dans 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) à température ambiante. Après coloration, laver les échantillons avec du PBS et prendre séparément les images fluorescentes des fibres de stress et noyaux.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Auparavant, Hofmann et ses collaborateurs ont trouvé que des changements morphologiques spectaculaires ont été observés dans les cellules de REF52 après la microinjection des PKA libre19. Dans une autre étude, le groupe de Lawrence a démontré que le PKA en cage peut être activé en vivo, conduisant à des changements morphologiques et la désintégration des fibres de stress lorsqu’ils sont soumis aux UV photolyse20. Rapports précédents sur l’exploitation de lumière po...

Modifiés chimiquement les protéines qui peuvent être photoactivées (par exemple, les protéines PKA en cage) ont été développés dans un domaine émergent en biologie chimique à manipuler non invasive des processus biochimiques intercellulaire1,2 ,3. En utilisant la lumière comme un stimulus offre une résolution spatio-temporelle excellente lors de l’activation de ces protéines mis en cage. Toutefois, lumière UV peut causer intempestif des changements morphologiques, l’apoptose et dommages à l’ADN de cellules4,5. Par conséquent, des développements récents dans la conception des groupes photocaging se concentrent sur permettant photoclivage à excitation biphotonique ou de plus longues longueurs d’onde pour réduire la phototoxicité, ainsi qu’à accroître la pénétration profonde des tissus6,7. Mise en cage des groupes qui répondent aux plus longue longueur d’onde, ce qui nous permet de choisir adaptés libération longueurs d’onde (c.-à-d., canaux) à sélectivement activer bioeffectors lorsque deux ou plus groupes mise en cage sont présents7. Compte tenu de ces caractéristiques utiles, développer de nouveaux groupes de feux rouges photocaging est très important travail en amont des méthodes photochimiques pour des études biologiques allant de sonder les mécanismes des réactions à la maîtrise des activités cellulaires8. Néanmoins, un groupe de mise en cage de deux photons est normalement trop hydrophobe en raison de la structure de fondu aromatique et un groupe de mise en cage de lumière visible est normalement organométallique, avec des ligands aromatiques. Cette propriété hydrophobe/aromatique n’est pas adaptée quand le bioeffector est une protéine ou une enzyme, car elle dénature le site de l’activation de l’enzyme/protéines et provoque une perte de fonction, même si la conjugaison et la photolyse fonctionnent toujours sur le plan chimique2 ,,9.
UCNPs sont des transducteurs efficaces qui convertissent la lumière d’excitation NIR aux UV. Cette propriété unique et fascinante de UCNPs a offert des résolutions réalistes pour relever les défis associés à photoactivation et déclenchement la libération contrôlée de petites molécules, dont10de l’acide folique, cisplatine, dérivés11 ,12, copolymère vésicules13et particules creuses14ADN/siARN. Cependant, au meilleur de nos connaissances, la photoactivation UCNP assistée d’enzymes ou protéines n'a pas été testée jusqu'à présent. Parce qu’il n’y a aucun cas de réussite de l’utilisation de lumière rouge ou NIR à photoactifs une enzyme, nous a invités à procéder à l’activation déclenchée NIR d’une structure de protéine/enzyme composée de complexes enzyme "cage" chimiquement modifiée avec un enrobées de silice, lanthanide dopé UCNP15. Dans cette étude, la UCNP était conjugué avec une kinase de transduction de signal rapidement réagir sous forme de "cage" PKA. PKA contrôle la synthèse du glycogène et la régulation du cytosquelette qui répond à des stimuli externes par l’intermédiaire de règlement de phosphate (cAMP) de l’adénosine cyclique dans le cytosol16. Nous avons étudié la faisabilité de l’activation de l’enzyme dans les mœurs temporelles et spatiales dans une expérience cellulaire après irradiation NIR. Cette plate-forme de photoactivation assistée par UCNP est une nouvelle méthodologie pour photoactivate une enzyme à l’aide de NIR et évite la réponse de transduction de signal indésiré de cellules causés par conventionnel UV irradiation2,4.
Il est très difficile d’effectuer des transferts bioeffectors grand (p. ex., protéines) à travers la membrane cellulaire pour contrôler l’activité cellulaire. Bien qu’immobilisé particule protéique peut être plus facile d’effectuer des transferts par endocytose dans le cytosol, endocytose peut-être être endommagé ou dégradé via endosomale provocation policière et la dégradation lysosomiale conséquente2,4. Même si la protéine "cage" fonctionne toujours après la translocation de la membrane, les montants transférés ne suffisent pas pour déclencher la réaction cellulaire2,17. Contraste, microinjection est une approche directe et quantitative pour livrer des grands bioeffectors dans le cytoplasme de la cellule. En outre, bioeffector UCNP-immobilisé nécessite upconvertis lumière d’être activé. Par conséquent, l’instrumentation optique nécessite encore une modification de mesurer, visualiser et d’utiliser la lumière upconversion. Dans ce travail, la livraison d’un complexe de PKA-UCNP en cage dans une cellule à l’aide de la microinjection et les modifications essentielles suivantes en microscopie et spectroscopie pour NIR photoactivation sera décrite en détail.

<table><tbody><tr><td><fort>réactif</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxyméthyl)aminométhane</td><td>Sigma</td><td>154563</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Sigma</td><td>12636</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’yttrium&nbsp ; hydrate</td><td>Sigma</td><td>326046</td><td>Y(C2H3CO2)3 &middot ; xH2O</td></tr><tr><td>Hydrate d’acétate de thulium(III)</td><td>Alfa Aesar</td><td>14582</td><td>Tm(CH3CO2)3 &middot ; xH2O</td></tr><tr><td>Acétate d’ytterbium(III) tétrahydraté</td><td>Sigma</td><td>326011</td><td>Yb(C2H3O2)3 &middot ; 4H2O</td></tr><tr><td>1-Octadécène</td><td>Sigma</td><td>O806</td><td></td></tr><tr><td>Acide oléique</td><td>Sigma</td><td>364525</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol&nbsp ;</td><td>macron</td><td>304168</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Sigma</td><td>30620</td><td></td></tr><tr><td>Fluorure d’ammonium</td><td>J.T.Baker</td><td>69804</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL&nbsp ; CO-520</td><td>Sigma</td><td>238643</td><td></td></tr><tr><td>Cyclohexane</td><td>J.T.Baker</td><td>920601</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde d’ammonium (28 % - 30 %)</td><td>J.T.Baker</td><td>972101</td><td></td></tr><tr><td>Ammonia Tetraethyl Orthosilicate (TEOS)</td><td>Sigma</td><td>8658</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroxymaléimide (NHM)</td><td>Sigma</td><td>226351</td><td>PKA réactif bloquant l’activité</td></tr><tr><td>Solution stabilisante protéique Prionex à partir de collagène porcin</td><td>Sigma</td><td>81662</td><td>Solution stabilisante protéique</td></tr><tr><td>Bromure de 2-nitrobenzyle (NBB)</td><td>Sigma</td><td>107794</td><td>PKA Réactif de cage</td></tr><tr><td>8-(4-Chlorophénylthio)adénosine 3&prime ;,5&prime ;--Sel sodique monophosphate cyclique</td><td>Sigma</td><td>C3912</td><td>8-CPT-cAMP</td></tr><tr><td>Pyruvate kinase/Déshydrogénase lactique enzymes du muscle du lapin</td><td>Sigma</td><td>P0294</td><td>PK/LDH</td></tr><tr><td>Adénosine 5'-triphosphate disodique</td><td>Sigma</td><td>A2387</td><td>ATP</td></tr><tr><td>&beta ;-NADH réduite à partir du dipotassium</td><td>Sigma</td><td>N4505</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoénolpyruvate</td><td>Sigma</td><td>P7127</td><td>PEP</td></tr><tr><td>Coomassie Réactif d’analyse de la protéine, 950 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>23200</td><td>Réactif d’essai Bradford</td></tr><tr><td>Protéine kinase dépendante de l’AMPc</td><td>Promega</td><td>V5161</td><td>Contrôle de l’activité PKA</td></tr><tr><td>Plasmide pET15b-PKACAT</td><td>Addgene</td><td>#14921</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide pKaede-MC1</td><td>CoralHue</td><td>AM-V0012</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4</td><td>Thermo Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glycémie élevée, pyruvate</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td>Cellule milieu de culture</td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 Medium</td><td>Biological Industries</td><td>01-115-1A</td><td>Milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Biological Industries</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>ACROS</td><td>416785000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Colorant de coloration du noyau</td></tr><tr><td>Alexa 594-phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td>Colorant colorant d’actine F</td></tr><tr><td>5(6)-Carboxytétraméthylrhodamine&nbsp ;</td><td>Novabiochem</td><td>8.51030.9999</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Coomassie (Bradford) Kit de dosage des protéines</td><td>Thermo Scientific</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>CelluSep T4 Tubulures/Puissance nominale du filtre MWCO 12 000 - 14 000 Da</td><td>Membrane Filtration Products, Inc.</td><td>1430-33</td><td>Membrane de dialyse</td></tr><tr><td>Millex-HV Unité de filtre pour seringue, 0,45 & micro ; m, PVDF, 13 mm, stérilisé aux rayons gamma</td><td>EMD Milipore</td><td>SLHVX13NL<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS</td><td>Malvern</td><td>M104</td><td></td></tr><tr><td>Microscope électronique à transmission</td><td>JEOL</td><td>JEM-1400</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre à fluorescence</td><td>Agilent Technologies</td><td>10075200</td><td>Cary Eclipse&nbsp ;</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre UV-Vis</td><td>Agilent Technologies</td><td>10068900</td><td>Cary 50&nbsp ;</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td></td></tr><tr><td>950 nm filtre passe-long&nbsp ;</td><td>Thorlabs</td><td>FEL0950</td><td></td></tr><tr><td>850 nm miroir dichroïque passe-court</td><td>Chroma</td><td>NC265609</td><td></td></tr><tr><td>RT3 système CCD couleur</td><td>SPOT</td><td>RT2520</td><td></td></tr><tr><td>Éclairage par fluorescence</td><td>PRIOR</td><td>Lumen 200</td><td></td></tr><tr><td>980 nm Laser à diode infrarouge</td><td>CNI</td><td>MDL-N-980-8W</td><td></td></tr><tr><td>UV LED Spot Source lumineuse</td><td>UVATA</td><td>UVATA-UPS412</td><td>Avec une LED UPH-056-365 nm à 200 mW/cm2</td></tr><tr><td>Capteur thermique à pile thermique</td><td>OPHIR</td><td>12A-V1-ROHS</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td>Systèmes de distribution par micro-injection intracellulaire</td></tr><tr><td>PC-10 Extracteur d’aiguille</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>MANOMÈTRE Manomètre numérique</td><td>Lutron</td><td>PM-9100</td><td></td></tr><tr><td>Mono-axe Micromanipulateur hydraulique à huile</td><td>Narishige</td><td>MMO-220A</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Heraeus Fresco 17, réfrigérée</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002421</td><td></td></tr></tbody></table>

un système intégré pour déclencher à distance transduction de signaux intracellulaires par photoactivation kinase induite par l’upconversion nanoparticle

An Integrated System to Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction by Upconversion Nanoparticle-mediated Kinase Photoactivation

Nanoparticules de conversion ascendante (UCNP)-médiation photoactivation est une nouvelle approche de contrôle à distance des bioeffectors beaucoup moins phototoxicité et avec une pénétration plus profonde des tissus. Toutefois, les instruments existants sur le marché ne sont pas difficilement compatibles avec l’application de conversion ascendante. Par conséquent, modifier l’instrument disponible dans le commerce est essentiel pour cette recherche. Dans cet article, nous illustrons tout d’abord les modifications d’un fluorimètre conventionnel et le microscope à fluorescence pour les rendre compatibles pour des expériences de conversion ascendante de photon. Nous décrivons ensuite la synthèse d’un proche infrarouge (NIR)-a déclenché la sous-unité catalytique kinase A (PKA) de "cage" protéine immobilisé sur un complexe UCNP. On rapporte également les paramètres pour microinjection et procédures de photoactivation NIR. Après que la "cage" PKA-UCNP est microinjected dans les cellules de fibroblaste de REF52, l’irradiation de NIR, qui est nettement supérieure à une irradiation UV classique, déclenche efficacement la voie de transduction de signal PKA dans les cellules vivantes. En outre, les expériences positives et négatives de témoins confirment que la voie induite par la PKA menant à la désintégration des fibres de stress est spécifiquement déclenchée par une irradiation NIR. Ainsi, l’utilisation de protéines modifiées UCNP fournit une approche novatrice pour contrôler à distance les expériences cellulaires lumière modulée, dans lequel une exposition directe aux rayons ultraviolets doit être évitée.

La conception de la construction de la "cage" enzyme-UCNP est illustrée à la Figure 1. L’enzyme PKA a été tout d’abord réagir avec bromure de 2-nitrobenzyle pour générer un PKA inactif "cage", et il a été immobilisé puis électrostatiquement sur la surface du UCNP. UCNPs émettent de la lumière upconvertis et par conséquent photolyse cliver les groupes o-nitrobenzyle sur 199 Cys et 343 Cys, générant la PKA activé. Images TEM et analyse de Bradford a confirmé qu...

Dans ce protocole, "cage" protéine kinase A (PKA), un bioeffector de transduction du signal cellulaire, a été immobilisé sur une surface de nanoparticules, micro dans le cytosol et activé par l’upconvertis UV lumière par irradiation de proche infrarouge (NIR), induisant désintégration de fibre stress en aval dans le cytosol.

Un système intégré pour déclencher à distance Transduction de signaux intracellulaires par Photoactivation Kinase induite par l’Upconversion Nanoparticle

Upconversion nanoparticle (UCNP)-mediated photoactivation is a new approach to remotely control bioeffectors with much less phototoxicity and with deeper ...

L'objectif de cette expérience est de démontrer la faisabilité de photoactiver une enzyme à l'aide d'une irradiation proche infrarouge. Une protéine kinase A piégée est immobilisée à la surface de nanoparticules de conversion ascendante micro-injectées dans des cellules, et la réponse induite par la kinase dans des cellules vivantes est observée après irradiation proche infrarouge. L'activation photochimique traditionnelle nécessite une lumière UV phototoxique et entraîne inévitablement des réactions chimiques indésirables ainsi que des réponses similaires ; toutefois, dans notre option plus douce, comme l'irradiation proche infrarouge, aucune réaction n'est déclenchée en raison de son faible niveau d'énergie.La nanoparticule de conversion ascendante peut efficacement convertir des photons proches du domaine infrarouge, à faible énergie et biocompatibles, en photons ultraviolets à haute énergie, déclenchant ainsi une réaction chimique à proximité de la surface de la particule, sans nécessiter d'irradiation UV directe. Les kinases jouent un rôle clé dans l'oncogenèse ; cette technique peut nous aider à examiner davantage d'informations sur la transduction du signal, avec un bruit parasite bien moindre provenant de la phototoxicité UV et de ses réactions secondaires. En général, les personnes novices dans ce domaine éprouvent des difficultés à modifier les instruments et le montage optique pour des applications de conversion ascendante.Pour commencer, installez un objectif 4x à côté du porte-cuvette du fluorospectromètre, de sorte que le laser puisse être focalisé au centre de la cuvette. Placez une diode laser réglable de 980 nanomètres à 90 degrés par rapport à l'objectif. Installez un miroir de réflexion totale et l'intersection du trajet lumineux entre l'objectif et le laser.N'oubliez pas de placer une plaque métallique anodisée pour bloquer la fenêtre d'excitation du spectromètre afin de protéger les pièces internes. Ensuite, placez une cuvette contenant une solution de nanoparticules de conversion ascendante revêtues de silice dans le porte-cuvette. Un faisceau de conversion ascendante intense peut être visualisé lorsque le laser s'allume.Passer la spectroscopie en mode luminescence, avec la tension PMT la plus faible pendant les alignements. Ajuster les miroirs et les supports du laser afin que le faisceau traverse le centre de la cuvette pour que le PMT capte le signal le plus intense. Après avoir installé un miroir dichroïque et un filtre d'excitation, installer une diode laser de 980 nanomètres dans le trajet lumineux du niveau inférieur.Ajoutez un collimateur entre le laser et le miroir pour aider à diffuser et agrandir la zone d'irradiation dans le plan focal. Ensuite, utilisez une solution de nanoparticules de conversion ascendante pour visualiser le faisceau infrarouge. Ajustez la position de la platine du laser afin de centrer le faisceau lumineux infrarouge pour terminer l'alignement.Réalisez la synthèse de la PKA piégée et démobilitsez la PKA piégée/UCNP, afin de générer la PKA piégée/UCNP comme décrit dans le protocole écrit. Pour mesurer l'activité des deux constructions avant la photolyse UV, mesurez la diminution de l'absorbance du NADH dans le mélange d'essai au cours du temps après l'ajout de deux microlitres de solution de PKA au mélange d'essai. Répétez la mesure pour la PKA/UCNP.Ensuite, effectuez une photolyse UV à 200 milliwatts par centimètre carré sur la PKA piégée et le complexe PKA piégée/UCNP, dans un bain d’eau glacée, afin de s’assurer que la PKA peut être activée. L’activité de la PKA est déterminée par un dosage enzymatique couplé impliquant la pyruvate kinase et la lactate déhydrogénase. Une diminution de l’absorbance de la NADH est mesurée au cours du temps après l’ajout de la solution de PKA.Incuber les cellules dans un milieu L15 contenant 10 % de sérum de veau fœtal pendant la période de microinjection afin d'assurer un contrôle stable du pH en dehors de l'incubateur. Configurer l'extracteur d'aiguille pour obtenir une pointe en forme de cône d'un diamètre d'environ 1,5 micron pour l'ouverture ultérieure de la pointe. Pour ouvrir la pointe, installer l'aiguille sur le microinjecteur, amener la pointe de l'aiguille au contact du bord d'une lame, puis donner une légère tape sur la platine du microscope.Cette force de vibration est suffisante pour casser légèrement la pointe et agrandir l'ouverture. Examiner l'ouverture de l'aiguille afin de s'assurer qu'elle possède un diamètre externe compris entre 1,3 et 1,5 micromètre, ce qui peut être confirmé par des images au microscope utilisant un objectif de 40x. Ensuite, régler la pression d'injection entre 50 et 75 hectopascals avec un intervalle de pressurisation de 200 à 300 millisecondes, et régler la pression de compensation constante entre 15 et 30 hectopascals afin d'empêcher le reflux du milieu dans l'aiguille.Chargez le complexe PKA piégée/UCNP avec le colorant TAMRA à l'extrémité arrière de l'aiguille. L'aiguille chargée est ensuite fixée sur un micromanipulateur hydraulique uniaxial, avec un angle compris entre 30 et 45 degrés. Vérifiez l'aiguille au microscope afin de vous assurer qu'aucune bulle n'est formée après le chargement de l'échantillon.Après avoir plongé l'aiguille dans le milieu, passez en mode fluorescence pour confirmer une libération soudaine de colorant lorsque la pression d'injection est appliquée, et une libération lente du colorant lorsque la pression de compensation est maintenue constante. Puis, passez en mode champ clair en contraste de phase afin de commencer la microinjection cellulaire. L'onde de choc membranaire peut être observée lors d'injections réussies.Lavez les cellules deux fois et vérifiez la fluorescence TAMRA co-injectée pour repérer les cellules ayant été microinjectées avec succès. Les cellules ayant intégré les UCNP mais ne présentant pas de signal de colorant co-injecté indiquent que la membrane cellulaire a été rompue pendant l'injection et doivent être exclues des expériences ultérieures. Irradiez les cellules avec une diode laser de 980 nanomètres dans le trajet lumineux inférieur, focalisée par un objectif 10x, pendant 15 minutes.Prévoir un intervalle d'obscurité de cinq minutes après chaque période d'irradiation de cinq minutes afin d'éviter tout échauffement. Si un temps d'activation plus court est nécessaire, comme quelques secondes ou même des sous-secondes, il suffit de passer à un objectif 40x pour obtenir une densité de photons plus élevée au point de focalisation. Après la photolyse et la récupération des cellules, fixer les cellules dans un millilitre de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant 20 minutes, avant de procéder à une coloration ultérieure avec l'Alexa 594.Enfin, visualisez la désintégration des fibres de stress induite par le proche infrarouge (NIR). Après irradiation par le NIR, les cellules microinjectées avec PKA piégée/UCNP, indiquées par des flèches blanches, présentent une émission de conversion ascendante. La désintégration des fibres de stress provoquée par une photoactivation réussie du PKA par le NIR expose davantage d'actine F, ce qui entraîne par conséquent une coloration verte intense au voisinage des UCNP.Un témoin négatif, dans lequel les cellules sont microinjectées mais restent à l’obscurité, ne montre aucune désintégration des fibres de stress. Le niveau d'exposition de l'actine F après photoactivation par lumière proche infrarouge peut être marqué par l'Alexa 594, suivi puis quantifié à l'aide d'ImageJ. Des courbes d'intensité de la coloration de l'actine F le long de la flèche rouge ont été tracées, fournissant des informations quantitatives sur la désintégration des fibres de stress, que l'on peut corréler à l'activité PKA induite par la lumière proche infrarouge. Une fois la microinjection maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une seule journée, y compris la préparation et le contrôle qualité du PKA piégé/UCNP.Avec nos instructions concernant les modifications de l'instrument et les expériences, la réaction souhaitée peut être déclenchée par un rayonnement proche infrarouge, avec une résolution spatio-temporelle élevée, comme les méthodes classiques utilisant l'UV pour les titrages, mais sans phototoxicité, et elle n'est pas contagieuse. Après avoir visionné cette vidéo, nous espérons que vous comprenez bien comment délivrer un complexe nanoparticule-enzyme dans une cellule par microinjection et activer l'enzyme par photoactivation, en utilisant une lumière proche infrarouge compatible avec les systèmes biologiques. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs en biologie chimique, qui doivent utiliser la lumière pour déclencher des réactions enzymatiques spécifiques dans des cellules vivantes avec une résolution spatio-temporelle, lorsque les cellules ne tolèrent pas la phototoxicité induite par l'UV.Après cette procédure, d'autres bioactivateurs peuvent être associés à des nanoparticules de conversion ascendante, afin de répondre à des questions supplémentaires nécessitant une photoactivation spatiotemporelle. Si le bioactivateur agit de manière extracellulaire, une microinjection n'est même pas nécessaire. La plateforme de photoactivation proche infrarouge peut également offrir une pénétration plus profonde dans les tissus et peut donc être utilisée chez de petits animaux pour déclencher des réactions souhaitées au moment et à l'endroit précisés.

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Un système intégré pour déclencher à distance Transduction de signaux intracellulaires par Photoactivation Kinase induite par l’Upconversion Nanoparticle (Vidéo) | JoVE Journal

Un système intégré pour déclencher à distance Transduction de signaux intracellulaires par Photoactivation Kinase induite par l’Upconversion Nanoparticle

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