Un système intégré pour déclencher à distance Transduction de signaux intracellulaires par Photoactivation Kinase induite par l’Upconversion Nanoparticle

Dans ce protocole, "cage" protéine kinase A (PKA), un bioeffector de transduction du signal cellulaire, a été immobilisé sur une surface de nanoparticules, micro dans le cytosol et activé par l’upconvertis UV lumière par irradiation de proche infrarouge (NIR), induisant désintégration de fibre stress en aval dans le cytosol.

Le but de cette expérience est de démontrer la faisabilité de photoactiver une enzyme en utilisant l’irradiation dans le proche infrarouge. La protéine kinase A en cage est immobilisée à cette surface de nanoparticules de conversion ascendante micro-injectées dans les cellules et la réponse induite par la kinase dans les cellules vivantes est observée après irradiation dans le proche infrarouge. La photoactivation traditionnelle nécessite une lumière UV phototoxique et, inévitablement, co-induira une réaction chimique indésirable et une réponse similaire, cependant, dans nos options amicales, comme l’irradiation proche infrarouge ne peut pas déclencher de réaction en raison de sa faible énergie.

La nanoparticule de conversion ascendante peut convertir efficacement un photon proche IR de faible énergie biologique en photon UV de haute énergie pour déclencher une réaction chimique près de la surface de la particule sans rayonnement UV direct. La kinase joue un rôle clé dans l’oncogenèse, cette technique peut nous aider à examiner plus d’informations sur la transduction du signal avec un bruit interférent beaucoup plus faible provenant de la phototoxicité UV et de sa réaction secondaire. En général, les personnes novices dans ce domaine rencontreront des difficultés à modifier les instruments et la configuration optique pour l’application de conversion ascendante.

Pour commencer, installez une lentille d’objectif 4x à côté du support de cuvette du fluorospectromètre, afin que le laser puisse être focalisé au milieu de la cuvette. Placez une diode laser accordable de 980 nanomètres à 90 degrés contre la lentille de l’objectif. Installez un miroir à réflectance complète et l’intersection du trajet lumineux de la lentille de l’objectif et du laser.

N’oubliez pas de placer une plaque métallique anodisée pour bloquer la fenêtre d’excitation du spectromètre afin de protéger les pièces intérieures. Placez ensuite une cuvette de solution de nanoparticules de conversion ascendante recouverte de silice dans le support. Un faisceau de conversion ascendante brillant peut être visualisé lorsque le laser s’allume.

Basculez la spectroscopie en mode luminescence, avec la tension PMT la plus basse lors des alignements. Ajustez le miroir et les platines laser de manière à ce que le faisceau passe par le milieu de la cuvette pour que le PMT capte le signal le plus fort. Après avoir installé un miroir dichroïque et un filtre d’excitation, installez une diode laser de 980 nanomètres dans le chemin lumineux de niveau inférieur.

Ajoutez un collimateur entre le laser et le miroir pour aider à diffuser et à élargir la zone d’irradiation proche infrarouge dans le plan focal. Utilisez ensuite une solution de nanoparticules à conversion ascendante pour visualiser le faisceau proche infrarouge. Ajustez la position de la platine laser pour centrer le faisceau de lumière proche infrarouge pour terminer l’alignement.

Effectuez une synthèse de PKA en cage et démobilisez la PKA/UCNP en cage pour générer une PKA/UCNP en cage comme décrit dans le protocole texte. Pour mesurer l’activité des deux constructions avant la photolyse UV, mesurez la diminution des absorbants NADH dans le mélange de test au fil du temps après l’ajout de deux microlitres de solution de PKA au mélange de test. Répétez la mesure pour PKA/UCNP.

Ensuite, effectuez une photolyse UV à 200 milliwatts par centimètre carré de PKA/PKA en cage, dans un bain d’eau glacée, pour vous assurer que la PKA peut être activée. L’activité de la PKA est déterminée par un test couplé à l’enzyme pyruvate kinase lactate déshydrogénase. Avec une diminution des absorbants NADH, est mesuré au fil du temps après l’ajout de solution PKA.

Incuber les cellules dans 10 % de sérum fœtal bovin contenant du milieu L15 pendant la période de micro-injection pour un contrôle stable du pH à l’extérieur de l’incubateur. Configurez l’extracteur d’aiguille pour une pointe en forme de cône d’un diamètre d’environ 1,5 micron pour une ouverture ultérieure de la pointe. Pour ouvrir l’embout, installez l’aiguille sur le micro-injecteur, déplacez l’embout de l’aiguille en contact avec le bord d’une lame et poursuivez avec un bouton doux sur la platine du microscope.

Cette force de vibration est suffisante pour casser légèrement la pointe et agrandir l’ouverture. Examinez l’ouverture de l’aiguille pour vous assurer qu’elle a un diamètre extérieur de 1,3 à 1,5 micron, ce qui peut être confirmé par des images au microscope à l’aide d’un objectif 40x. Ensuite, réglez la pression d’injection de 50 à 75 hectopascals avec un intervalle de pression de 200 à 300 millisecondes et réglez la pression de compensation constante à 15 à 30 hectopascals pour éviter un reflux moyen dans l’aiguille.

Chargez le complexe caged-PKA/UCNP avec le colorant TAMRA en position arrière de l’aiguille. L’aiguille chargée est ensuite installée sur un micromanipulateur hydraulique à un axe, avec un angle de 30 degrés à 45 degrés. Vérifiez l’aiguille au microscope pour vous assurer qu’aucune bulle n’a été générée après le chargement de l’échantillon.

Après avoir immergé l’aiguille dans le milieu, passez en mode fluorescence, pour confirmer une libération en rafale du colorant lorsque la pression d’injection est appliquée et une libération lente du colorant lorsque la pression de compensation est constamment appliquée. Passez ensuite en mode champ clair à contraste de phase, pour démarrer la micro-injection cellulaire. L’onde de choc membranaire peut être observée lors d’injections réussies.

Lavez les cellules deux fois et vérifiez que les cellules injectées ne sont pas fluorescentes par TAMRA afin de localiser les cellules micro-injectées avec succès. Les cellules avec admission UCNP mais sans signal de colorant co-injecté, indiquent que la membrane cellulaire a été rompue lors de l’injection et doivent être exclues des expériences ultérieures. Irradiez les cellules avec une diode laser de 980 nanomètres dans le chemin lumineux de niveau inférieur focalisé par une lentille d’objectif 10x pendant 15 minutes.

Prévoyez un intervalle d’obscurité de cinq minutes après chaque cinq minutes d’irradiation pour éviter l’échauffement. Si un temps d’activation plus court est nécessaire, par exemple quelques secondes ou même moins de secondes, il suffit de passer à un objectif 40x pour une densité de photons de mise au point plus élevée. Après la photolyse et la récupération cellulaire, fixez les cellules dans un millilitre ou 4 % de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 20 minutes, avant que d’autres alexa 594 ne suivent dans la coloration.

Enfin, visualisez la désintégration des fibres de contrainte induite par le NIR. Après irradiation NIR, les cellules microinjectées avec de la PKA/UCNP en cage, comme indiqué par des flèches blanches, montrent une émission de conversion ascendante. La désintégration des fibres de stress causée par une photoactivation réussie de PKA NIR, expose davantage d’actine f et entraîne par conséquent une forte coloration verte près de l’UCNP.

Un contrôle négatif où les cellules sont micro-injectées mais restent dans l’obscurité, ne montre aucune désintégration des fibres de stress. Le niveau d’exposition à l’actine f après photoactivation NIR peut être coloré avec alexa 594 suivi à l’intérieur et quantifié par l’image J.Les courbes d’intensité de la coloration de l’actine f le long de la flèche rouge ont été tracées, fournissant des informations quantitatives sur la désintégration des fibres de stress qui peuvent être corrélées à l’activité PKA induite par le NIR. Une fois familiarisé avec la micro-injection, cette technique peut être réalisée en une journée, y compris la préparation et le contrôle de la qualité de la PKA/UCNP en cage.

Avec nos instructions pour les modifications de nos instruments et les expériences, la réaction souhaitée peut être déclenchée par l’IR proche, en résolution temporelle très spatiale comme les UV traditionnels pour les méthodes de titrage, mais sans la phototoxicité, ce n’est pas contagieux. Après avoir regardé cette vidéo, j’espère que vous avez une bonne compréhension de la façon de délivrer un complexe de nanoparticules d’enzyme dans une cellule par micro-injection et de photoactiver l’enzyme, en utilisant une lumière proche infrarouge compatible avec Bell. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie chimique, qui ont besoin d’utiliser la lumière pour déclencher la réaction enzymatique souhaitée dans les cellules vivantes pour une résolution spatio-temporelle lorsque la cellule ne peut pas tolérer la phototoxicité UV.

Suite à cette procédure, d’autres bio-affecteurs peuvent être associés à des nanoparticules de conversion ascendante, pour répondre à des questions supplémentaires nécessitant une photoactivation spatio-temporelle. Si le bio-affecteur fonctionne de manière extracellulaire, la micro-injection n’est même pas nécessaire. La plate-forme de photoactivation dans le proche infrarouge peut également fournir une plus grande profondeur de pénétration dans les tissus et peut donc être appliquée chez de petits animaux pour déclencher les réactions souhaitées au moment et à l’endroit donnés.