Name: Protocoles pour lassemblage standard dADN de C-Brick utilisant Cpf1 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Apprenez l'assemblage d'ADN par la norme C-Brick utilisant Cpf1 pour la biologie synthétique. Cette méthode séquence-indépendante permet la construction itérative de circuits génétiques complexes.

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Nous remercions Shanghai Tolo Biotech pour son assistance technique lors du développement de la norme C-Brick. Ce travail a été soutenu par des subventions du Programme de recherche prioritaire stratégique de l&#39;Académie chinoise des sciences (Subvention n ° XDB19040200).

1. Préparation de crRNA <ol><li> Préparation des modèles CRRNA <ol><li> Ré-suspendre les oligonucléotides individuels ( Tableau 1 ) dans de l&#39;eau exempte de RNase à une concentration de 10 uM. </li><li> Ajouter 22,5 μl d&#39;oligonucléotide de brin supérieur (T7-F dans le tableau 1 ), 22,5 μl d&#39;oligonucléotide de brin inférieur ( Tableau 1 ) et 5 μL de tampon de recuit 10x à un tube de PCR de 0,2 ml. Assurez-vous que le volume total est de 50 μL. REMARQUE: Six différents oligonucleotides de brin sont présentés dans le tableau 1 , chacun desquels doivent être couplés individuellement avec le brin T7-F supérieur. Les lettres minuscules dans le tableau 1 représentent la séquence à transcrire dans la séquence guide de crRNA. Le tampon de PCR Taq 10x peut être utilisé à la place du tampon de recuit 10x. </li><li> Placez le tube PCR dans un thermocycleur. </li><li> Exécuter le programme de recuit: dénaturation initiale à 95 ° C pour5 min, puis un temps de refroidissement de 95 à 20 ° C, avec une diminution de 1 ° C par minute sur le thermocycleur. REMARQUE: Utilisez immédiatement les échantillons pour l&#39;étape 1.2.1. </li></ol></li><li> Transcription et purification de crRNA <ol><li> Ajouter 38 μL d&#39;eau exempte de RNase, 8 μL du gabarit de l&#39;étape 1.1.4, 20 μL de tampon de transcription 5x T7, 20 μL de mélange de NTP (10 μM), 4 μl d&#39;inhibiteur de RNase recombinante (RRI) et 10 ΜL d&#39;ARN polymérase T7 à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Assurez-vous que le volume total est de 100 μL. </li><li> Mettez le tube de microcentrifugeuse dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant la nuit (environ 16 h). </li><li> Utilisez un kit de nettoyage et de concentration d&#39;ARN pour purifier l&#39;ARN transcrit; Suivre le protocole du fabricant. </li><li> Quantifier les ARN avec des spectrophotomètres UV-Vis et diluer l&#39;ARN à une concentration de 10 μM. Utilisez les échantillons immédiatement ou rangez-les à -80 ° C. NOTE: La séquence CRRNAS sont listés dans le tableau 2 . </li></ol></li></ol> 2. Construction de pièces en C-Brick ( c.-à-d. L&#39;insertion de pièces biologiques dans un vecteur standard de C-Brick) REMARQUE: Cette étape comporte trois sous-étapes. Pour les parties biologiques courtes ( par exemple, les promoteurs et les terminateurs), il est préférable d&#39;utiliser la méthode de PCR directe pour insérer les parties biologiques dans un vecteur standard C-Brick 4 . Toute la séquence vectorielle est affichée dans les données supplémentaires, et la séquence de préfixe et de suffixe est illustrée à la Figure 1 (étape 2.1 ci-dessous). Pour les parties biologiques qui peuvent être facilement obtenues par PCR ( par exemple, avec des modèles d&#39;ADN génomique , des plasmides ou des séquences d&#39;ADN synthétisées de novo ), il est préférable d&#39;utiliser le procédé d&#39;assemblage sans soudure pour insérer les parties biologiques dans un vecteur standard C-Brick (Étape 2.2 ci-dessous). Pour les pièces obtenues des normes BioBrick et BglBrick, la restrictionLa digestion à médiation enzymatique et la ligature médiée par l&#39;ADN ligase T4 peuvent être utilisées pour insérer les parties biologiques dans un vecteur standard C-Brick (étape 2.3, ci-dessous). <ol><li> Construction par amplification directe par PCR <ol><li> Concevoir et commander des oligonucléotides pour l&#39;amplification par PCR. NOTE: L&#39;extrémité 5 &#39;de l&#39;oligonucléotide contient la séquence de la partie ADN et l&#39;extrémité 3&#39; de l&#39;oligonucléotide contient la séquence vectorielle ( c&#39;est-à-dire &quot;GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG&quot; à l&#39;extrémité 3 &#39;du brin avant et &quot;GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG&quot; Dans le brin inverse). Soit aucun surplomb ni un surplomb de ~ 20 pb ne peut être conçu à l&#39;extrémité 5 &#39;de l&#39;oligonucléotide. Des exemples spécifiques peuvent être trouvés dans une étude précédente 4 . </li><li> Ré-suspendre les oligonucléotides individuels dans de l&#39;eau ultra-pure à une concentration de 10 uM. </li><li> Mettre en place des réactions de PCR sur de la glace dans un tube de PCR de 0,2 ml: ajouter 18 μL d&#39;eau ultra-pure, 25 μL de 2x PLe tampon CR, 1 μL de dNTP (10 μM), 2,5 μL de chaque primaire (10 μM) à partir de l&#39;étape 2.1.2, 0,5 μL de vecteur standard C-Brick (50 ng) en tant que modèle et 0,5 μL De l&#39;ADN polymérase haute fidélité. Assurez-vous que le volume total est de 50 μL. </li><li> Placez le tube directement dans un thermocycleur et démarrez le programme de thermocycleur. Utilisez les échantillons immédiatement ou congéluez-les et rangez-les à -20 ° C. </li><li> Programme Thermocycler: un cycle pendant 3 min à 98 ° C; Trente cycles pendant 10 s à 98 ° C, 20 s à 55 ° C et 2 min à 72 ° C; Et un cycle pendant 10 min à 72 ° C. Conserver l&#39;échantillon à 16 ° C. </li><li> Ajouter 9 μL du mélange de l&#39;étape 2.1.4 à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. </li><li> Ajouter 1 μL de DpnI et incuber pendant 1 h dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. NOTE: Si les amorces n&#39;ont pas de séquences chevauchantes, ajouter 0,5 μL de polynucléotide kinase T4 (PNK) et 0,5 μL d&#39;ADN ligase T4 et incuber dansUn bain d&#39;eau à 22 ° C pendant 1 h. Sinon, si les amorces contiennent une séquence de superposition de ~ 20 nt, transformez directement les produits traités par DpnI en cellules compatibles avec E. coli (DH10B) (étape 2.4). Le produit de PCR linéarisé sera circularisé par le système de recombinaison dans l&#39;hôte. </li><li> Utilisez les échantillons immédiatement ou rangez-les à -20 ° C. </li></ol></li><li> Construction par assemblage sans couture <ol><li> Concevoir et commander des oligonucléotides pour l&#39;amplification par PCR. NOTE: L&#39;extrémité 3 &#39;de l&#39;oligonucléotide contient la séquence terminale de la partie ADN et l&#39;extrémité 5&#39; de l&#39;oligonucléotide contient le terminal de la séquence vectorielle standard C-Brick linéarisée ( c&#39;est-à-dire &quot;CTAGAAAGAGAGAAAGGATCC&quot; pour le 5 &#39; -end du brin avant et &quot;CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC&quot; pour l&#39;extrémité 5 &#39;du brin inverse). Des exemples spécifiques peuvent être trouvés dans une étude précédente 4 . </li><li> Re-suspendre les individusUal dans de l&#39;eau ultra-pure à une concentration de 10 uM. </li><li> Mettre en place des réactions de PCR sur de la glace dans un tube de PCR de 0,2 ml: ajouter 18 μL d&#39;eau ultrapure, 25 μL de tampon PCR 2x, 1 μL de dNTP (10 μM), 2,5 μL chacune des amorces avant et inverse (10 μM ) À partir de l&#39;étape 2.2.2, 0,5 μL de gabarit (20-500 ng) et 0,5 μl d&#39;ADN polymerase haute fidélité. Assurez-vous que le volume total est de 50 μL. </li><li> Placez le tube directement dans le thermocycleur et exécutez le programme de thermocycleur. Utilisez les échantillons immédiatement ou congéluez-les et rangez-les à -20 ° C. REMARQUE: Réglez le programme thermocycler sur: un cycle pendant 3 min à 98 ° C; 30 cycles pendant 10 s à 98 ° C, 20 s à 55 ° C (selon la température de recuit de l&#39;amorce) et 1 min (selon la longueur des parties biologiques) à 72 ° C; Et un cycle pendant 10 min à 72 ° C. Conserver l&#39;échantillon à 16 ° C. </li><li> Purifier le produit de PCR en utilisant un système de nettoyage par PCRKit de température; Suivre le protocole du fabricant. </li><li> Recréer le vecteur standard C-Brick avec BamHI: ajouter 34 μL d&#39;eau ultra-pure, 10 μL de plasmide (1 μg), 5 μL de tampon 10x et 1 μL de BamHI au tube de microcentrifugeuse. Incuber jusqu&#39;à 2 h à 37 ° C dans un bain d&#39;eau. </li><li> Purifier le produit ci-dessus à l&#39;aide d&#39;un kit de système de nettoyage de gel; Suivre le protocole du fabricant. </li><li> Ajouter 2 μL de vecteur linéarisé (50 ng) à partir de l&#39;étape 2.2.7, 5 μL de fragment (200 ng) de l&#39;étape 2.2.4, 2 μL de tampon d&#39;assemblage sans soudure 5x et 1 μL d&#39;enzyme de montage sans soudure à partir d&#39;un kit d&#39;assemblage sans soudure À un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml. Assurez-vous que le volume total est de 10 μL. </li><li> Placez-le dans un bain-marie à 37 ° C pendant 30 min. Utilisez les échantillons immédiatement ou congéluez-les et rangez-les à -20 ° C. </li></ol></li><li> Construction par restriction de la digestion à médiation enzymatique et ligature médiée par l&#39;ADN ligase T4. REMARQUE: Pour les pièces obtenues à partir des normes BioBrick (étape 2.3.4-2.3.7) et BglBrick (étape 2.3.1-2.3.3), la digestion à restriction enzymatique et la ligature médiée par la ligase T4 ADN peuvent être utilisées pour insérer le Biologiques dans un vecteur standard C-Brick. <ol><li> Recréer les pièces standard BglBrick avec BamHI et BglII: ajouter 34 μL d&#39;eau ultrapure, 10 μL de plasmide (2 μg), 5 μL de 10x tampon 3, 0,5 μL de BamHI et 0,5 μL de BglII au tube de microcentrifugeuse. Incuber pendant 2 h dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Exécuter une électrophorèse sur gel d&#39;agarose à 1% et purifier le fragment en utilisant un kit de système de nettoyage de gel. </li><li> Relier le fragment et le vecteur standard de C-Brick: ajouter 2 μL de vecteur linéarisé (50 ng) de l&#39;étape 2.1.12 et 6 μL de fragment (200 ng) de l&#39;étape 2.3.3 à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Ajouter 1 μL de 10 x T4 ADN ligase tampon et 1 μL de T4 ADN ligase. Incuber pendant 2 h à 22 ° C. Utilisez les échantillons immédiatement ou freezE et rangez-les à -20 ° C. </li><li> Recréer les pièces standard BioBrick avec XbaI et SpeI: ajouter 34 μL d&#39;eau ultra-pure, 10 μL de plasmide (2 μg), 5 μL de tampon 10x, 0,5 μL de XbaI et 0,5 μL de SpeI au tube de microcentrifugeuse. Incuber pendant 2 h dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Digérer le vecteur standard C-Brick avec XbaI et SpeI: ajouter 34 μL d&#39;eau ultrapure, 10 μL de plasmide (1 μg), 5 μL de tampon 10x, 0,5 μL de XbaI et 0,5 μL de SpeI au tube de microcentrifugeuse . Incuber pendant 2 h dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Exécuter une électrophorèse sur gel d&#39;agarose à 1% et purifier le fragment de l&#39;étape 2.3.4 et le vecteur linéarisé de l&#39;étape 2.3.5 avec un kit de système de nettoyage de gel; Suivant le protocole du fabricant. </li><li> Relier le fragment et le vecteur C-Brick: ajouter 2 μL de vecteur linéarisé (50 ng) de l&#39;étape 2.3.5 et 6 μL de fragment (200 ng) de l&#39;étape 2.3.4 à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Un dD 1 μL de 10x T4 ADN ligase tampon et 1 μL de T4 ADN ligase. Incuber pendant 2 h à 22 ° C. Utilisez les échantillons immédiatement ou congéluez-les et rangez-les à -20 ° C. </li></ol></li><li> Ajouter 10 μL des produits à partir des étapes 2.1.8, 2.2.9, 2.3.3 ou 2.3.7 pour la transformation chimique dans les cellules compétentes de E. coli (DH10B). </li><li> Ramener plusieurs clones dans un tube liquide Luria-Bertani (LB) de 5 ml et incuber à 37 ° C sur un agitateur (220 tr / min) pendant une nuit. </li><li> Extraire le plasmide en utilisant un kit de préparation de plasmide; Suivre le protocole du fabricant. </li><li> Identifiez les clones appropriés par le séquençage de Sanger 11 . </li></ol> 3. Ensemble C-Brick ( Figure 2 ) <ol><li> Digestion du vecteur C-Brick avec Cpf1 <ol><li> Ajouter 22,5 μl d&#39;eau exempte de RNase, 4 μL de tampon Cpf1 10x, 10 μL du plasmide à partir de l&#39;étape 2.6 (1 μg), 0,5 μL de RRI et 1 &amp;# 181; L de Cpf1 (5 μM) à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml. REMARQUE: Cpf1 peut être acheté commercialement ou purifié suivant le protocole dans une étude précédente 4 . </li><li> Pour insérer un fragment d&#39;ADN étranger dans les sites T1 et T2, ajouter 1 μL de crRNA-T2 (10 μM) et incuber dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant 30 minutes. Un dd 1 μL de crRNA-T1 (10 μM) et Cpf1 (5 μM) pendant encore 30 min. NOTE: En variante, pour insérer un fragment d&#39;ADN étranger dans les sites T3 et T4, ajouter 1 μL de crRNA-T3 (10 μM) et incuber dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant 30 minutes. Ajouter 1 μL de crRNA-T4 (10 μM) pendant 30 minutes supplémentaires. </li><li> Ajouter 1 μL de phosphatase alcaline thermosensible et incuber le tube dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant 1 heure supplémentaire. </li><li> Exécutez une électrophorèse sur gel d&#39;agarose et purifiez le vecteur en utilisant un kit de système de nettoyage de gel. Utilisez les échantillons immédiatement ou congéluez-les et rangez-les à -20 ° C. </li></ol></Li&gt; <li> Digestion du fragment d&#39;ADN avec Cpf1 <ol><li> Ajouter 21,5 μl d&#39;eau exempte de RNase, 4 μL de tampon Cpf1 10x, 10 μL de plasmide à partir de l&#39;étape 2.6 (2 μg), 0,5 μL de RRI et 2 μL de Cpf1 (5 μM) à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml. </li><li> Pour insérer un fragment d&#39;ADN étranger dans les sites T1 et T2, ajouter 1 μL de crRNA-T1 (10 μM) et 1 μL de crRNA-T3 (10 μM) et incuber dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant 2 h. NOTE: En variante, ajouter 1 μL de crRNA-T2 (10 μM) et 1 μL de crRNA-T4 (10 μM) et incuber dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant 2 h. </li><li> Exécutez une électrophorèse sur gel d&#39;agarose et purifiez le fragment en utilisant un kit de système de nettoyage de gel. Utilisez les échantillons immédiatement ou congéluez-les et rangez-les à -20 ° C. </li></ol></li><li> Assemblage C-Brick et vérification supplémentaire <ol><li> Relier le fragment d&#39;ADN étranger et le vecteur C-Brick: ajouter 2 μL du vecteur linéarisé (50 ng) de l&#39;étape 3.1.4 et 6 μL du fragment d&#39;ADN (200 ng) de l&#39;étape 3.2.3 à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Ajouter 1 μl de 10x T4 ADN Ligase tampon et 1 μL de T4 ADN ligase. Incuber pendant 2 h à 22 ° C. Utilisez les échantillons immédiatement ou congéluez-les et rangez-les à -20 ° C. </li><li> Ajouter 10 μL des produits de ligature (étape 3.3.1) pour la transformation chimique dans des cellules compatibles avec E. coli (DH10B). </li><li> Ajouter plusieurs clones dans un tube LB liquide de 5 mL et incuber pendant une nuit sur un agitateur à 220 tr / min et 37 ° C. </li><li> Extraire le plasmide en utilisant un kit de préparation de plasmide; Suivre le protocole du fabricant. </li><li> Identifiez les clones corrects par Sanger séquencing 11 . </li></ol></li><li> Effectuer un nouveau cycle d&#39;assemblage de C-Brick. Les clones corrects de l&#39;étape 3.3.4 peuvent être utilisés comme un nouveau vecteur C-Brick ou partie ADN pour un nouvel assemblage itératif C-Brick, suivant le même protocole à partir des étapes 3.1-3.3. NOTE: T2 &#39;et T3&#39; sIls sont conçus comme la sauvegarde des sites T2 et T3 ( Figure 1a ). Pour les plasmides obtenus à partir de l&#39;étape 2.3.7, seuls les T2 et T3 peuvent être utilisés pour l&#39;assemblage standard C-Brick. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Ce protocole décrit une procédure pour la norme d&#39;assemblage d&#39;ADN C-Brick. L&#39;étape la plus importante dans ce protocole est la linéarisation du vecteur standard C-Brick; Le clivage incomplet du vecteur pourrait affecter gravement le taux de réussite. En outre, bien que Cpf1 couvre principalement les séquences d&#39;ADN cible dans le schéma de clivage &quot;18-23&quot;, un clivage inexact près des deux bases a également été détecté 4 , ce qui peut provoquer un petit nombre de mutation...

La standardisation des parties biologiques de l&#39;ADN est importante pour le développement de la biologie synthétique 1 . Le développement d&#39;une procédure d&#39;assemblage d&#39;ADN peut remplacer des conceptions expérimentales ponctuelles et éliminer plusieurs des résultats inattendus qui surviennent lors de l&#39;assemblage de composants génétiques dans des systèmes plus vastes. La norme BioBrick (BBF RFC 10) était l&#39;une des premières normes d&#39;assemblage d&#39;ADN proposées. Il utilise la séquence de préfixe (contenant des sites de coupe EcoRI et XbaI) et la séquence de suffixe (contenant les sites de coupe SpeI et PstI) 2 , 3 . Étant donné que XbaI et SpeI ont des extrémités cohésives complémentaires, les pièces d&#39;ADN BioBrick qui sont coupées avec XbaI et SpeI peuvent être jointes, générant un nouveau BioBrick pour un assemblage itératif supplémentaire. Certains défauts ont été identifiés avec l&#39;utilisation de la norme BioBrick 4 . Par exemple, il produit une cicatrice de 8 pbEntre les parties d&#39;ADN, ce qui ne permet pas la construction de protéines in-fusion. En outre, les quatre types de sites de restriction de 6 pb susmentionnés doivent être retirés des pièces d&#39;ADN, ce qui est très gênant. La norme BglBrick a été établie pour résoudre le premier problème 5 . Il crée une cicatrice &quot;GGATCT&quot; de 6 p. 100, produisant Gly-Ser et permettant la fusion de protéines multiples ou de domaines protéiques. IBrick a été développé pour traiter le deuxième problème 6 . Il utilise des endonucléases homing (HE) qui reconnaissent de longues séquences d&#39;ADN. Comme les sites de reconnaissance HE existent rarement dans les séquences d&#39;ADN naturelles, la norme iBrick peut être utilisée pour la construction directe de pièces iBrick sans modifier leurs séquences d&#39;ADN. Cependant, la norme iBrick laisse une cicatrice de 21 pb entre les parties de l&#39;ADN, ce qui pourrait être la raison de son impopularité. Au cours des dernières années, les répétitions palindromiques courtes classées régulièrement (CRISPR) s&#39;est développé rapidement 7 , 8 . Parmi les protéines associées au CRISPR (Cas), l&#39;endonucléase Cas9 de Streptococcus pyogenes est maintenant largement utilisée. Il introduit principalement des ruptures d&#39;ADN bicaténaires (DSB) avec des extrémités franches 9 . En 2015, Zhang et ses collègues ont caractérisé pour la première fois Cpf1 (CRISPR de Prevotella et Francisella 1). Il appartient au système CRISPR-Cas de classe 2 de type V et est une endonucléase 10 CRISRP (CRARN). Contrairement à Cas9, Cpf1 introduit un DSB avec un surtension de 5 ou 5 nt 5 &#39;10. Sur la base de cette caractéristique, Cpf1 a été utilisé pour développer une norme d&#39;assemblage d&#39;ADN, C-Brick 4 . Sur un vecteur standard C-Brick, quatre sites Cpf1 de T1 / T2 préfixés et T3 / T4 suffixés flanquent les parties biologiques; Ceci est similaire à la norme BioBrick. Comme le clivage des sites T2 et T3 pTransforme les extrémités collantes complémentaires, il est possible d&#39;effectuer l&#39;assemblage itératif des pièces d&#39;ADN tout en générant une cicatrice &quot;GGATCC&quot; entre les pièces. Notamment, la norme C-Brick a deux avantages principaux: reconnaître des séquences cibles longues et laisser des cicatrices courtes. La cicatrice &quot;GGATCC&quot; de 6 pb générée par C-Brick encode Gly-Ser, qui permet la construction de protéines de fusion. En outre, la norme C-Brick est également partiellement compatible avec les standards BglBrick et BioBrick.

<table><tbody><tr><td>Oligonucléotide commercial</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Taq PCR Buffer</td><td>Transgen</td><td>#J40928</td><td></td></tr><tr><td>Eau distillée ultra pure</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>5x Tampon de transcription d’ARN</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0441</td><td></td></tr><tr><td>T7 ARN polymérase</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EP0111</td><td></td></tr><tr><td>Mélange NTP</td><td>Sangon</td><td>#ND0056</td><td></td></tr><tr><td>RRI (inhibiteur de la RNase recombinante)</td><td>Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>ARN propre & Concentrateur-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre UV-Vis</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nano-Drop 2000C</td><td></td></tr><tr><td>2x Phanta Max Buffer</td><td>Vazyme</td><td>PB505</td><td>Tampon PCR</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Transgen</td><td>AD101</td><td></td></tr><tr><td>Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Vazyme</td><td>P505-d1</td><td></td></tr><tr><td>Ezmax pour le clonage en une étape</td><td>Tolobio</td><td>24303-1</td><td>kit de montage sans soudure</td></tr><tr><td>5x Tampon pour clonage en une étape Ezmax</td><td>Tolobio</td><td>32006</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>#R0136L</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>#R3136L</td><td></td></tr><tr><td>BglII&nbsp ;</td><td>NEB</td><td>#R0144L</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>#R0145L</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>NEB</td><td>#R3133L</td><td></td></tr><tr><td>10x Buffer 3</td><td>NEB</td><td>#B7003S</td><td></td></tr><tr><td>10x CutSmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA ligase Buffer</td><td>Tolobio</td><td>32002</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>Tolobio</td><td>32206</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>Tolobio</td><td>32210</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>#R01762</td><td></td></tr><tr><td>SV Système de nettoyage gel et PCR</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide Mini Kit I</td><td>Omega</td><td>D6943-02</td><td>Kit de préparation de plasmide</td></tr><tr><td>phosphatase alcaline thermosensible&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EF0651</td><td>FastAP</td></tr><tr><td>10x Cpf1 tampon</td><td>Tolobio</td><td>32008</td><td></td></tr><tr><td>Cpf1</td><td>Tolobio</td><td>32105</td><td>FnCpf1</td></tr><tr><td>thermocycleur</td><td>Applied Biosystems</td><td>veriti 96 puits</td><td></td></tr><tr><td>C-Brick vecteur standard</td><td>Tolobio</td><td>98101</td><td></td></tr><tr><td>E. coli [DH10B]</td><td>Invitrogen</td><td>18297010</td><td></td></tr><tr><td>Milieux Luria-Bertani (tryptone)</td><td>Oxoid</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Milieux Luria-Bertani (extrait de levure)</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>Milieux Luria-Bertani (NaCl)</td><td>Sangon Biotech</td><td>B126BA0007</td><td></td></tr></tbody></table>

protocoles pour l&#39;assemblage standard d&#39;adn de c-brick utilisant cpf1

Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

La protéine CPf1 associée au CRISPR clive l&#39;ADN bicaténaire sous la direction de l&#39;ARN CRISPR (CRRNA), générant des extrémités collantes. En raison de cette caractéristique, Cpf1 a été utilisé pour l&#39;établissement d&#39;une norme d&#39;assemblage d&#39;ADN appelée C-Brick, qui présente l&#39;avantage de longs sites de reconnaissance et de cicatrices courtes. Sur un vecteur C-Brick standard, il existe quatre sites de reconnaissance Cpf1 - le préfixe (sites T1 et T2) et le suffixe (sites T3 et T4) - éléments d&#39;ADN biologiques flanquant. Le clivage des sites T2 et T3 produit des extrémités collantes complémentaires, qui permettent l&#39;assemblage de pièces d&#39;ADN avec des sites T2 et T3. Pendant ce temps, une courte cicatrice &quot;GGATCC&quot; est générée entre les pièces après l&#39;assemblage. Comme le plasmide nouvellement formé contient à nouveau les quatre sites de clivage Cpf1, la méthode permet l&#39;assemblage itératif de pièces d&#39;ADN, ce qui est similaire à celui des standards BioBrick et BglBrick. Une procédure décrivant l&#39;utilisation de la norme C-Brick pour assembler des pièces d&#39;ADNEst décrit ici. La norme C-Brick peut être largement utilisée par les scientifiques, les étudiants diplômés et les étudiants de premier cycle, et même les amateurs.

<html> Ce protocole a démontré l&#39;assemblage de trois cassettes de chromoprotéines (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012) et amilGFP (BBa_K592010)). Tout d&#39;abord, les séquences codantes des trois gènes et terminateurs mentionnés ci-dessus ont été clones individuellement dans un vecteur standard C-Brick. Des parties d&#39;ADN courtes, un promoteur et un terminateur, ont été introduits dans le vecteur C-Brick par amplification PCR en utilisant des amorces contenant les petites ...

La protéine Cpf1 associée à CRISPR peut être guidée par un ARN CRISPR spécialement conçu (CRRNA) pour cliver l&#39;ADN bicaténaire aux sites souhaités, générant des extrémités collantes. Sur la base de cette caractéristique, une norme d&#39;assemblage d&#39;ADN (C-Brick) a été établie, et un protocole détaillant son utilisation est décrit ici.

Protocoles pour l&#39;assemblage standard d&#39;ADN de C-Brick utilisant Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

Les vidéos suivantes détaillent une procédure d’utilisation de la norme C-Brick pour assembler des parties d’ADN à l’aide de la protéine associée à CRISPR, Cpf1. Cette méthode peut favoriser le développement de l’assemblage de l’ADN dans le domaine de la biologie synthétique. Par exemple en facilitant la construction de circuits génétiques compliqués.Le principal avantage de cette méthode est qu’elle est indépendante de la séquence et qu’elle permet l’assemblage itératif de constructions d’ADN. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons remarqué que Cpf1 était guidé par un seul siRNA et de l’ADN catalytique empilés. Par conséquent, la génération de DKN.La démonstration de la procédure sera assurée par Shi-Yuan Li, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Pour réparer les matrices d’ARNcr, remettez en suspension les oligonucléotides individuels dans de l’eau exempte de RNase à une concentration de 10 micromolaires. Dans un tube PCR de 0,2 millilitre, ajoutez de l’oligonucléotide de brin supérieur, de l’oligonucléotide de brin inférieur et un tampon de recuit 10x, comme indiqué dans le document d’accompagnement.Assurez-vous que le volume total est d

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