Protocoles pour l'assemblage standard d'ADN de C-Brick utilisant Cpf1

Les vidéos suivantes détaillent une procédure d’utilisation de la norme C-Brick pour assembler des parties d’ADN à l’aide de la protéine associée à CRISPR, Cpf1. Cette méthode peut favoriser le développement de l’assemblage de l’ADN dans le domaine de la biologie synthétique. Par exemple en facilitant la construction de circuits génétiques compliqués.

Le principal avantage de cette méthode est qu’elle est indépendante de la séquence et qu’elle permet l’assemblage itératif de constructions d’ADN. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons remarqué que Cpf1 était guidé par un seul siRNA et de l’ADN catalytique empilés. Par conséquent, la génération de DKN.

La démonstration de la procédure sera assurée par Shi-Yuan Li, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Pour réparer les matrices d’ARNcr, remettez en suspension les oligonucléotides individuels dans de l’eau exempte de RNase à une concentration de 10 micromolaires. Dans un tube PCR de 0,2 millilitre, ajoutez de l’oligonucléotide de brin supérieur, de l’oligonucléotide de brin inférieur et un tampon de recuit 10x, comme indiqué dans le document d’accompagnement.

Assurez-vous que le volume total est de 50 microlitres. Ce tableau présente six oligonucléotides du brin inférieur différents, chacun d’entre eux devant être apparié individuellement au brin supérieur, T7-F. Les lettres minuscules représentent la séquence à transcrire dans la séquence guide de l’ARNcr.

Placez le tube PCR dans un thermocycleur. Exécutez le programme de recuit avec une dénitration initiale à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis un refroidissement de 95 à 20 degrés Celsius avec une diminution d’un degré Celsius par minute. Après le recuit, effectuez immédiatement la transcription en combinant le produit recuit avec de l’eau libre de RNase, un tampon de transcription T-7, un mélange NTP, un inhibiteur de RNase recombinant et une RNase polymérase T-7 dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.

Incuber la réaction dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, utilisez un kit de nettoyage et de concentration de l’ARN pour purifier l’ARN transcrit. Utilisez un spectrophotomètre UV-Vis pour quantifier l’ARN.

Ensuite, diluez l’ARN à une concentration de 10 micromolaires. Si les échantillons ne sont pas utilisés immédiatement, conservez-les à 80 degrés Celsius. La construction de pièces en brique C peut être réalisée par plusieurs méthodes.

Dans cette section de la vidéo, trois cassettes de chromoprotéines, cjBlue, eforRed et amilGFP, seront assemblées à l’aide de la méthode d’assemblage sans soudure. Commencez par concevoir et commander les oligonucléotides pour l’amplification PCR des cassettes de chromoprotéines. Lorsque les oligonucléotides arrivent, mettez-les en suspension dans de l’eau ultrapure à une concentration de 10 micromolaires.

Ensuite, pour configurer les réactions PCR, placez des tubes PCR de 0,2 millilitre sur de la glace. Ajoutez de l’eau ultrapure, deux tampons XPCR, des DNTP, des amorces directes et inverses, une matrice de chromoprotéines et une ADN polymérase haute fidélité. Placez les tubes directement dans le thermocycleur et lancez le programme.

Utilisez les échantillons immédiatement, ou congelez-les et conservez-les à 20 degrés Celsius. Après amplification, purifier les produits PCR à l’aide d’un kit. Ensuite, pour digérer le vecteur standard C-Brick avec BamH1, ajoutez de l’eau ultrapure, du plasmide, un tampon 10x et BamH1 dans le tube.

Incuber jusqu’à deux heures à 37 degrés Celsius dans un bain-marie. Purifier le vecteur linéarisé à l’aide d’un kit de nettoyage en gel. Après le nettoyage, combinez le vecteur linéarisé, le produit PCR, un tampon d’assemblage sans soudure 5x et une enzyme d’assemblage sans soudure à partir d’un kit d’assemblage sans soudure dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.

Assurez-vous que le volume total est de 10 microlitres. Placez-le dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l’incubation, utilisez les échantillons immédiatement ou congelez-les sur de la glace et conservez-les à 20 degrés Celsius.

À 90 microlitres d’e coli DH10B, ajoutez 10 microlitres de la construction. Effectuer une transformation chimique. Ensuite, étalez les cellules transformées sur une plaque LB et incubez à 37 degrés Celsius.

Le lendemain, sélectionnez plusieurs clones à cultiver dans des tubes liquides LB de cinq millilitres et incubez-les à 37 degrés Celsius sur un agitateur à 220 tr/min pendant la nuit. Extrayez le plasmide à l’aide d’un kit de préparation de plasmide. Ensuite, identifiez les clones corrects par séquençage de Sanger.

Sachez que la construction des chemins C-Brick peut également être accomplie par l’application de PCI réactive, ou par restriction dans la digestion immédiate du milieu de l’ADN ligase T4 à la ligature. Ensuite, pour digérer le vecteur C-Brick avec Cpf1, combinez de l’eau libre RNase, un tampon 10x Cpf1, le plasmide, un inhibiteur de RNase recombinant et Cpf1 dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Pour insérer un fragment d’ADN étranger dans les sites T1 et T2, ajoutez un microlitre d’ARNcr T2 et incubez le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ensuite, en gardant le tube dans le bain-marie, ajoutez un microlitre d’ARNcr T1, un microlitre de Cpf1 et incubez pendant encore 30 minutes. L’ARNcr T2 est ajouté en premier, car les deux sites de reconnaissance sont plus proches sur l’ADN vecteur. La liaison de Cpf1 sur le site T1 peut influencer le litage du site T2.

De plus, si le site T2 remplaçait le site T2, le site T2 serait perturbé si l’ARNc T1 était ajouté en premier. Ajoutez un microlitre de phosphatase alcaline thermosensible et incubez le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant une heure supplémentaire. Effectuez une électrophorèse sur gel d’agarose et purifiez le vecteur à l’aide d’un kit de système de nettoyage de gel.

Utilisez les échantillons immédiatement, ou congelez-les et conservez-les à 20 degrés Celsius. Pour digérer le fragment d’ADN d’intérêt avec Cpf1, combinez de l’eau libre de RNase, un tampon 10x Cpf1, un plasmide, un inhibiteur de RNase recombinant et Cpf1 dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Pour insérer un fragment d’ADN étranger dans les sites T1 et T2, ajoutez un microlitre d’ARNcr T1 et un microlitre d’ARNc T3 dans le tube et incubez-le dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant deux heures.

Après l’incubation, effectuez une électrophorèse sur gel d’agarose et purifiez le fragment à l’aide d’un kit de nettoyage de gel. Utilisez les échantillons immédiatement, ou congelez-les et conservez-les à 20 degrés Celsius. Ensuite, pour ligaturer le fragment d’ADN étranger dans le vecteur C-Brick, combinez le vecteur linéarisé et le fragment d’ADN dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.

Ajoutez 10 tampons d’ADN ligase T4 et d’ADN ligase T4. Ensuite, incubez pendant deux heures à 22 degrés Celsius. Utilisez les échantillons immédiatement, ou congelez-les et conservez-les à 20 degrés Celsius.

Ajouter 10 microlitres des produits de ligature aux cellules compétentes d’e coli DH10B, et effectuer une transformation chimique. Ensuite, étalez l’e coli transformé sur des plaques LB et incubez-les à 37 degrés Celsius. Le lendemain, ajoutez plusieurs clones dans des tubes de liquide LB de 5 millilitres et incubez-les pendant la nuit sur un agitateur à 220 tr/min et 37 degrés Celsius.

Extrayez le plasmide à l’aide d’un kit de préparation de plasmide. Ensuite, identifiez les clones corrects par séquençage de Sanger. Effectuez un nouveau tour d’assemblage de C-Brick.

À l’aide de l’échantillon, les clones de fissure peuvent être utilisés comme nouveau vecteur C-Brick ou morceau d’ADN pour un assemblage itératif ultérieur de C-Brick. Trois cassettes de chromoprotéines, cjBlue, eforRed et amilGFP, ont été assemblées comme décrit dans cette vidéo. Trois chromoprotéines ont été exprimées dans e coli cultivé sur une plaque.

Les bactéries témoins négatives, sans chromoprotéines, sont montrées sur la quatrième plaque. Par la suite, deux cassettes d’expression des couleurs ont été assemblées avec la norme C-Brick pour créer plus de couleurs. Trois chromoprotéines et trois chromoprotéines doubles assemblées ont été exprimées dans des bactéries E. coli cultivées dans un milieu liquide LB.

De un à six, les constructions exprimées sont eforRed, un, amilGFP, deux, cjBlue, trois, amilGFP plus eforRed, quatre, eforRed plus cjBlue, cinq, et amilGFP plus cjBlue, six. Les bactéries colorées sur une seule plaque, ou dans un seul tube de microcentrifugation, ont été cultivées à partir d’un clone vérifié à une seule séquence. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une semaine, si elle est correctement exécutée.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que tous les matériaux doivent être exempts de RNase, pour la préparation des siRNA et la clairance de Cpf1. Je recommande toujours que cette tactique ait aidé les chercheurs dans le domaine de la biologie synthétique à construire une vitrine génétique des voies métaboliques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’assembler un chemin d’ADN à l’aide de la norme C-Brick.