Analyse de la microglie et des macrophages dérivés de monocytes du système nerveux central par cytométrie de flux

L’objectif général de cette expérience est d’évaluer les différents marqueurs exprimés par les sous-populations de macrophages dans le système nerveux central ou SNC. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neuroimmunologie, telles que les macrophages duperry lorsque nous essayons de donner des étourdissements au SNC, et quels sont les phénotypes du SNC dans les macrophages. Les principaux avantages de cette technique sont l’isolement d’un grand nombre de sous-populations de macrophages hautement purifiés, ainsi qu’une contification du marqueur cellulaire de la sous-population de macrophages.

Commencez par utiliser des ciseaux fins pour couper la peau ventrale juste en dessous du processus xiphoïde afin d’exposer la cavité thoracique. Faites une incision dans le diaphragme et coupez les côtés de la cage thoracique dans une direction caudale à rostrale pour exposer le cœur. Après avoir identifié le ventricule gauche et l’oreillette droite, insérez un cathéter papillon avec une aiguille de calibre 25 dans le ventricule gauche.

Faites une incision sur l’oreillette droite et commencez à profoncer 20 millilitres de PBS à travers le cathéter à un rythme de dix millilitres par minute dès que le sang commence à circuler. Une profusion réussie sera indiquée par un blanchiment des poumons et du foie lors du déplacement du sang. Ensuite, utilisez des ciseaux fins pour disséquer la colonne vertébrale.

Exciser la musculature de la paroi abdominale sur la face ventrale de la colonne vertébrale et couper la colonne vertébrale à la base de la queue pour enlever la colonne vertébrale au fur et à mesure qu’elle est récoltée. Insérez une seringue de dix millilitres de PBS équipée d’une pointe de pipette modifiée de 200 microlitres dans le côté lombaire de la colonne vertébrale. Ensuite, rincez la moelle épinière du côté cervical.

Retirez la peau au-dessus du crâne et insérez une pointe des ciseaux à la base du crâne. Coupez le crâne en suivant la suture sagittale. Insérez ensuite de petites pinces dans la incision et retirez délicatement le haut du crâne.

Disséquez le cerveau de la tête de souris et retirez le bulbe olfactif et le cervelet. Placez ensuite le cerveau et la moelle épinière dans un tube d’un point cinq millilitres contenant un point un deux huit millilitres de cocktail de digestion. Pour dissocier les cellules, utilisez de petits ciseaux pour couper finement le cerveau et la moelle épinière en morceaux d’un à deux millimètres cubes et placez les morceaux à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant 30 minutes.

À la fin de l’incubation, arrêtez la digestion avec 20 microlitres d’EDTA zéro virgule cinq molaires, suivie d’une trituration douce avec une pipette de cinq millilitres. Filtrez la suspension cellulaire résultante à travers une passoire à mailles de 70 microns dans un tube conique de 50 millilitres à l’aide du piston d’une seringue de dix millilitres pour faire macérer doucement tout tissu restant du cerveau ou de la moelle épinière. Rincez la passoire avec 20 millilitres de cinq pour cent de FBS et PBS.

Et collecter les cellules filtrées par centrifugation. Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille. Pour la séparation par gradient de densité des cellules, nous suspendons la pastille avec quatre millilitres de milieu à gradient de densité de 30 pour cent et transférons les cellules dans un tube conique de 15 millilitres.

Sous-couche doucement quatre millilitres de milieu à gradient de densité de 37 %, suivis de quatre millilitres de milieu à gradient de densité de 70 % sous le milieu à gradient de densité de 37 %. Transférez le tube dans une centrifugeuse de paillasse pour séparer les cellules. Les cellules microgliales et macrophages seront à l’interface des couches de gradient de densité de 70 et 37 %.

Le tube apparaîtra stratifié. Après avoir soigneusement retiré la couche supérieure de myéline, transférez trois à quatre millilitres de la couche d’interphase microgliale macrophage dans un nouveau tube de 15 millilitres. Ensuite, lavez les cellules immunitaires avec trois centrifugeuses dans 15 millilitres de PBS, en remettant la pastille en suspension dans un millilitre de PBS après le lavage final.

Pour évaluer l’expression du marqueur de la sous-population de macrophages, transférez les cellules dans un tube d’analyse par cytométrie en flux de cinq millilitres, suivi de l’ajout d’un microlitre de réactif de coloration des cellules mortes fixable. Après 30 minutes sur la glace, à l’abri de la lumière, lavez les échantillons dans deux millilitres de PBS et remettez la pastille en suspension dans 400 microlitres de tampon de fax par tube d’analyse expérimental. Divisez les cellules en un nombre approprié de tubes d’analyse par cytométrie en flux de cinq millilitres.

Bloquez ensuite la liaison du récepteur FC non spécifique avec un microgramme de cocktail d’anticorps bloquants CD 16 CD 32 pour 100 microlitres de cellules pour une incubation de 10 à 15 minutes sur glace, à l’abri de la lumière. Ensuite, étiquetez les cellules avec 100 microlitres d’anticorps primaires appropriés, pour une incubation de 30 minutes sur de la glace, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, lavez quatre fois les cellules dans deux millilitres de PBS.

Ajoutez ensuite 100 microlitres d’anticorps secondaires appropriés pendant 30 minutes sur de la glace, à l’abri de la lumière, suivis de quatre lavages dans du PBS comme nous venons de le démontrer. Après le dernier lavage, remettez doucement les granulés en suspension dans 100 microlitres de paraformaldéhyde à un pour cent pendant 15 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. Ensuite, lavez les cellules quatre fois dans du PBS.

Remettez en suspension les pastilles finales dans 200 microlitres de PBS frais, et analysez les cellules par cytométrie en flux. Les microglies dérivées du cerveau et de la moelle épinière et les macrophages dérivés des monocytes sont identifiés en fonction de leur expression de CD 11 B et de CD 45. L’expression de CX3CR1 et de Tmem119 par les cellules microgliales moyennes CD 11 B positives CD 45 permet de distinguer davantage cette population cellulaire des macrophages CD 45 CD 45 supérieurs dérivés des monocytes, qui n’expriment aucun de ces marqueurs, mais expriment CCR2.

Après séparation par gradient de densité, 85 à 95 % des cellules sont encore viables. En l’absence d’isolement par gradient de densité, les sous-populations de macrophages ne sont pas identifiables dans un diagramme de dispersion bilatéral avant, en raison de la présence de cellules non macrophages et de débris de myéline. Comme l’épitope reconnu par l’anticorps anti-Tmem119 est intracellulaire, la perméabilisation est nécessaire pour le marquage de cet important marqueur des cellules microgliales.

Notez que la perméabilisation induit cependant un rétrécissement cellulaire, ce qui fait que les sous-populations de macrophages apparaissent plus petites par l’analyse de diffusion directe ou latérale. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq heures si elle est exécutée correctement. Bien que j’aie tenté cette procédure, il est important de se rappeler de configurer très soigneusement la gradiance de densité.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, comme la rt-PCR quantitative, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur les voies de signalisation des sous-populations de macrophages. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs en neurosciences pour explorer l’activation de la sous-population de macrophages dans un modèle murin de maladie neurologique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez soit effectuer des tests, soit suivre cette tradition en tant que sous-populations de macrophages par cytométrie en flux.

N’oubliez pas que travailler avec du paraformaldéhyde peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l’utilisation d’une cagoule doivent toujours être prises lors de cette procédure.