Name: Analyse de la microglie et des macrophages dérivés de monocytes du système nerveux central par cytométrie de flux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Découvrez l'analyse des sous-populations de microglie et de macrophages du système nerveux central par cytométrie de flux chez la souris adulte. Cette méthode permet d'identifier les marqueurs cellulaires spécifiques et d'étudier les rôles fonctionnels dans la neuroinflammation.

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Ce travail a été soutenu par des subventions de l&#39;Agence Nationale pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), de l&#39;Association France Alzheimer et de Bpifrance. Notre laboratoire est également soutenu par l&#39;Inserm, le CNRS, l&#39;Université Pierre et Marie-Curie et le programme &quot;Investissements d&#39;avenir&quot; ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Nous tenons à remercier l&#39;assistance de l&#39;établissement de base CELIS de la culture cellulaire.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel pour les soins et l&#39;utilisation des animaux à l&#39;Institut ICM et par le Comité d&#39;éthique française de Darwin, et sont couverts par le protocole 01407.02. 1. Préparation <ol><li> Préparez le cocktail de digestion dans un tube de 1,5 mL en combinant les suivants pour chaque souris: 1 ml de solution salée tamponnée au phosphate (PBS); 123 μL enzyme de digestion (voir tableau de matériaux) à 13 wunsch / mL (solution mère), concentration finale 1,6 wunsch / mL; Et 5 μL d&#39;ADNase I (voir tableau de matières) à 100 mg / mL (solution mère), concentration finale 0,5 mg / mL. </li></ol> 2. Perfusion et dissection <ol><li> Éuthaniser les souris avec une dose létale de pentobarbital (100 μL à 400 mg / mL). </li><li> Placez l&#39;animal en position couchée et humectez le corps avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Couper la peau ventrale avec des ciseaux fins juste en dessous du processus xyphoïde pour exposer la cavité thoraciqueY. </li><li> Faire une incision dans le diaphragme et couper les aspects latéraux de la cage thoracique avec un ciseau fin dans une direction caudale à rostrale pour exposer le cœur (et éviter de couper d&#39;autres organes). Identifiez le ventricule gauche (LV) et l&#39;oreillette droite (RA). </li><li> Insérez un cathéter papillon avec une aiguille de 25 G à l&#39;intérieur du LV. Faire une incision sur la RA avec des ciseaux fins et au début du flux sanguin, commencer la perfusion à un débit de 10 ml / min dans le LV avec 20 ml de PBS pour éliminer les cellules et le sang des vaisseaux; Une perfusion réussie est notée par le blanchiment des poumons et le foie à mesure que le sang est déplacé. </li><li> Décapiter l&#39;animal avec des ciseaux moyens. Dissectionnez la colonne vertébrale avec des ciseaux fins et séparez-le du corps en excitant la musculature de la paroi abdominale sur le côté ventral de la colonne vertébrale et en coupant la colonne vertébrale à la base de la queue. </li><li> Insérez une seringue de 10 ml contenant du PBS et une pointe de pipette de 200 μL montée dans le côté lombaire deLa colonne vertébrale et rincer la moelle épinière du côté cervical. REMARQUE: la pointe de la pipette de 200 μL est coupée avec des ciseaux à son extrémité la plus large (environ 1 cm) et bien insérée sur une seringue de 10 ml précédemment remplie de PBS. </li><li> Retirez la peau au-dessus du crâne et utilisez une pince pour exposer le cerveau. Insérez une lame à ciseaux à la base du crâne et coupez le crâne suivant la suture sagittale. Insérez de petites pinces dans la coupe et soulevez doucement le crâne. Dissecez le cerveau de la tête de la souris et retirez l&#39;ampoule olfactive et le cervelet. </li><li> Recueillir le cerveau et la moelle épinière dans un tube de 1,5 ml contenant 1,128 mL de PBS avec un cocktail de digestion (à partir de l&#39;étape 1.1). </li></ol> 3. Dissociation cellulaire <ol><li> Couper finement le cerveau et la moelle épinière dans le tube de 1,5 mL (étape 2.9) en 1-2 mm 3 avec de petits ciseaux ( Figure 1 ). </li><li> Incuber le tube de 1,5 ml contenant les tissus émincés pendant 30 min dans une incubaÀ 37 ° C avec 5% de CO 2 . REMARQUE: Préparez le gradient de densité à cette étape. </li><li> Ajouter 20 μL d&#39;EDTA 0,5 M (solution mère), concentration finale 10 mM, au tube de 1,5 ml pour arrêter la réaction enzymatique. </li><li> Faites doucement une suspension de cellules en pipetant vers le haut et vers le bas avec une pipette de 5 mL. </li><li> Passer la suspension cellulaire à travers un maille de nylon (taille de pores de 70 μm) dans un tube de 50 ml en utilisant le piston d&#39;une seringue de 10 ml. </li><li> Laver le filet de nylon avec 20 mL de sérum bovin fêtal 5% (FBS) -PBS. </li><li> Centrifugeuse pendant 7 min (300 xg) à température ambiante (18 ° C). Jeter le surnageant par aspiration et passer à l&#39;étape suivante. Soyez extrêmement prudent lorsque vous retirez le surnageant; Ne pas déranger la pastille, qui peut être facilement aspirée par la pipette d&#39;aspiration. </li></ol> 4. Dégradé de densité <ol><li> Préparer une solution stock du milieu gradient de densité en ajoutant la quantité appropriée de PBS 10x au milieu à gradient de densité. REMARQUE: Ajoutez une partie 10X PBS à un gradient de densité de neuf parties. </li><li> Diluer le milieu de gradient de densité de stock avec 1x PBS pour les différents pourcentages, comme décrit dans le tableau 1 . </li><li> Remettre en suspension la pastille (à partir de l&#39;étape 3.7) avec un milieu gradient de densité de 4 mL et 30% et passer à un tube de 15 mL. </li><li> Placer une pipette Pasteur dans le fond du tube de 15 ml et sous-couche lentement 4 mL de milieu de gradient de densité de 37%. </li><li> Ajouter 4 mL de milieu à gradient de densité à 70%, comme décrit ci-dessus. </li><li> Centrifuger le gradient pendant 40 min (800 xg) à température ambiante (18 ° C). Assurez-vous que la centrifugeuse s&#39;arrête avec un frein minimal ou nul, de sorte que l&#39;interphase n&#39;est pas perturbée. REMARQUE: Le tube apparaîtra stratifié. Les cellules superposées à l&#39;interface à gradient de densité de 70% à 37% sont les cellules immunitaires mononucléées (sous-populations de microglie et de macrophages); Les niveaux supérieurs sont respectivement les débris cellulaires et la myéline ( figure 2 ). </li><lI&gt; En utilisant une pipette de transfert, retirez doucement la couche de myéline. </li><li> Recueillir 3 à 4 ml de l&#39;interphase de gradient de densité 70 à 37% contenant les cellules des sous-populations de macrophages dans un tube propre de 15 ml. </li><li> Lavez les cellules 3x avec du PBS, volume total de 15 ml. Assurez-vous que le milieu de gradient de densité contenant les cellules est dilué au moins trois fois avec du PBS et centrifuger pendant 7 minutes (500 xg, 4 ° C) avec le frein &quot;on&quot;. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire avec 1 mL de PBS pour l&#39;étiquetage cellulaire ou pour d&#39;autres essais fonctionnels. </li></ol> 5. Étiquetage cellulaire pour la cytométrie de flux <ol><li> Transférer les cellules (étape 4.10) dans un tube de cytométrie en flux. </li><li> Ajouter 1 μL de réactif de coloration de cellules mortes fixable à chaque échantillon de cellule obtenu à l&#39;étape 4.10. Incuber pendant 30 minutes sur de la glace, protégé de la lumière. </li><li> Laver les cellules une fois avec 2 ml de PBS et centrifuger pendant 5 min (300 xg, 4 ° C). </li><li> Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire avec400 μL de PBS 1% de BSA, 0,1% d&#39;azide. </li><li> Ajouter 1 μg d&#39;anticorps CD16 / CD32 à 100 μL des cellules pour bloquer les récepteurs Fc. Incuber 10 à 15 minutes sur de la glace, protégé de la lumière. </li><li> Préparer le mélange d&#39;anticorps primaire dans PBS 1% de BSA, 0,1% d&#39;azide ou PBS 1% de BSA, 0,1% d&#39;azide, 0,25% de saponine, pour la perméabilisation cellulaire pour la coloration intracellulaire. </li><li> Ajouter 100 μL de mélange d&#39;anticorps primaires (2x) et incuber pendant 30 minutes sur de la glace, protégé de la lumière. REMARQUE: Tous les anticorps doivent être titrés avant de mener l&#39;expérience afin d&#39;obtenir des résultats optimaux. </li><li> Laver les cellules avec 2 mL de PBS et centrifuger pendant 5 min (300 xg, 4 ° C). Répétez cette étape trois fois. </li><li> Ajouter 100 μL d&#39;un anticorps secondaire si les anticorps primaires ne sont pas directement conjugués à un fluorophore et incuber pendant 30 minutes sur de la glace, protégés de la lumière. </li><li> Laver les cellules avec 2 mL de PBS et centrifuger pendant 5 min à 300 xg à 4 ° C). Répétez cette étape trois fois. </li><li> Repare leCellules avec 100 μL de PFA à 1% pendant 15 minutes à température ambiante, protégées de la lumière. REMARQUE: Attention: le PFA est toxique. Utiliser dans une hotte et porter un équipement de protection individuelle. </li><li> Laver les cellules avec 2 ml de PBS et centrifuger pendant 5 minutes à 300 xg à 4 ° C. Répétez cette étape trois fois. </li><li> Remise en suspension de la pastille cellulaire avec 200 μl de PBS et procéder à l&#39;acquisition et à l&#39;analyse de la cytométrie en flux. Suivez la stratégie de verrouillage de la figure 3 . </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler

Il a été démontré que la microglie et le MDM ont différentes fonctions et phénotypes dans le SNC, et donc l&#39;identification et l&#39;analyse de ces sous-populations de macrophages sont essentielles pour mieux comprendre les maladies neurologiques 9 , 18 , 25 . L&#39;analyse de cytométrie de flux utilisant deux marqueurs (CD11b et CD45) permet la distinction entre chaque sous-population ( Figure 3C</stron...

Les microglies sont les macrophages résiduels du système nerveux central (SNC) parenchymateux. Ils jouent deux rôles fonctionnels clés: la défense immunitaire et le maintien de l&#39;homéostasie du SNC. Contrairement au MDM, qui sont renouvelés continuellement à partir des cellules souches hématopoïétiques dans la moelle osseuse, les cellules microgliales se différencient des cellules progénitrices hématopoïétiques primitifs provenant du sac vellé (YS) qui ont colonisé le cerveau pendant le développement embryonnaire 1 , 2 , 3 . Chez les rongeurs, le facteur de transcription Myb joue un rôle crucial dans le développement de tous les monocytes et macrophages dérivés de la moelle osseuse, mais pour la microglie dérivée de YS, ce facteur est dispensable et la différenciation reste dépendante du facteur de transcription PU.1 4 . Dans le SNC sain, les microglies sont des cellules dynamiques qui échantillonnent constamment leur environnement, scaEt l&#39;arpentage pour les agents pathogènes envahissants ou les dommages aux tissus 5 . La détection de ces signaux déclenche une voie pour résoudre la blessure. La microglie passe rapidement d&#39;une morphologie ramifiée à une amiboïde, suivie d&#39;une phagocytose et d&#39;une libération de divers médiateurs, tels que des cytokines pro ou anti-inflammatoires. Ainsi, selon leur microenvironnement, la microglie activée peut acquérir un spectre d&#39;états d&#39;amorçage distincts 6 . La microglie a un impact profond sur le développement et la progression de nombreux troubles neurologiques. Dans les modèles de rongeurs de la maladie d&#39;Alzheimer (AD) 7 , de la Sclérose latérale amyotrophique (ALS) 8 , de la Sclérose en plaques (MS) 9 ou de la maladie de Parkinson (PD) 10 , la microglie joue un double rôle, induisant une neurotoxicité néfaste ou agissant De manière neuroprotective, qui dépend deN la maladie spécifique, le stade de la maladie et si la maladie a été influencée par le compartiment immunitaire systémique 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . La plupart des lésions du SNC observées dans les maladies citées ci-dessus contiennent une population hétérogène de cellules myéloïdes, y compris non seulement la microglie parenchymateuse, mais aussi les macrophages périvasculaires et méningés, ainsi que le MDM infiltrant le SNC. Ces types de cellules peuvent contribuer de manière différentielle aux mécanismes pathophysiologiques liés aux blessures et à la réparation 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . Le défi actuel pour les chercheurs qui étudient ces modèles de maladie est d&#39;établir si les monocytes et les macrophages périphériques s&#39;infiltrent dans le SNC et, dans l&#39;affirmative,Astuce la microglie résidante de ces cellules. En effet, les cellules microgliales sont très plastiques; Lorsqu&#39;ils sont activés, les marqueurs de réticine de microglie sont habituellement exprimés par des monocytes périphériques et des macrophages. La question, par conséquent, repose sur l&#39;identification de marqueurs qui peuvent distinguer la microglie résidante des monocytes et des macrophages infiltrants. La discrimination de ces populations sur les tranches de cerveau par des applications immunohistologiques est limitée en raison du manque d&#39;anticorps spécifiques. Cependant, l&#39;analyse par cytométrie en flux est une technique efficace pour évaluer l&#39;expression de plusieurs marqueurs et pour distinguer les populations cellulaires (par exemple, lymphocytes, macrophages / MDM CD11b + CD45 haute et microglie CD11b + CD45 med ), ainsi que les sous-populations cellulaires 16 , 17 , 18 . Ce protocole décrit les procédures pour isoler lesDes cellules mononucléaires du SNC de souris dans des modèles de maladies neurologiques en utilisant une dissociation de tissu enzymatique optimisée et une centrifugation en gradient de densité; Ainsi qu&#39;une méthode pour différencier les populations de microglie et MDM dans le SNC en utilisant la cytométrie en flux. Une autre approche est d&#39;éliminer la myéline et de purifier les cellules en utilisant des billes magnétiques conjuguées à des anticorps spécifiques 19 , 20 , 21 . L&#39;élimination de la myéline à l&#39;aide de perles magnétiques anti-myéline est plus coûteuse et affecte la viabilité et le rendement des cellules isolées 22 . Cette étape et la séparation immunomagnétique suivante de la microglie, limitent les études supplémentaires de populations de cellules immunitaires spécifiques 21 , 22 . Ces procédures fournissent un moyen simple d&#39;étudier les sous-populations de macrophages dans le développement de la maladie, etPour déterminer les effets des médicaments ou les modifications des gènes sur les phénotypes et les états d&#39;activation des macrophages.

<table><tbody><tr><td>Souris de 5 mois</td><td>Janvier</td><td>C57BL/6J</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL Research Grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401020001</td><td>Enzyme de digestion</td></tr><tr><td>Déoxyribonucléase I du pancréas bovin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0891-01</td><td>Gradient de densité moyen</td></tr><tr><td>Cellule Strainer taille 70 &micro ; m Nylon</td><td>Corning</td><td>731751</td><td></td></tr><tr><td>Venofix 25 G</td><td>BRAUN</td><td>Seringue à</td> piston 4056370 <td></td></tr><tr><td>10 mL</td><td>Terumo</td><td>SS+10ES1</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur 230 mm</td><td>Dustcher</td><td>20420</td><td></td></tr><tr><td>Tube de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 123.328</td><td></td></tr><tr><td>Tube de 15 mL</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Tube de 50 mL</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>5 mL polystyrène tube à fond rond</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (1x) sans Ca2+/Mg2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (10x) sans Ca2+/Mg2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14200-067</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr> Solution <tr><td>d’albumine sérique bovine 30 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A7284</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde 32 % Solution</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15714-S</td><td>Attention -</td></tr><tr><td>Saponine</td> toxique <td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>PerCPCy5.5 Anti-souris pour rat CD11b (clone M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>45-0112</td><td></td></tr><tr><td>IgG2b K pour rat Contrôle de l’isotype PerCP-Cyanine5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-4031</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Anti-souris pour rat CD45 (clone 30-F11)</td><td>BD Biosciences</td><td>563890</td><td></td></tr><tr><td>BV421 IgG2b de rat, &kappa ; Contrôle des isotypes RUO</td><td>BD Biosciences</td><td>562603</td><td></td></tr><tr><td>Lapin anti-souris TMEM119 (clone28 - 3)</td><td>Abcam</td><td>ab209064</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 Âne anti-lapin IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A31573</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD16/CD32 Purifié</td><td>eBioscience</td><td>14-0161</td><td>Souris Fc Block</td></tr><tr><td>Kits de teinture à cellules mortes</td><td>fixables Invitrogen</td><td>L34969</td><td></td></tr><tr><td>Souris CCR2 APC-conjugué Anticorps</td><td>R& D</td><td>FAB5538A</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2B Contrôle d’isotype APC conjugué</td><td>R& D</td><td>IC013A</td><td></td></tr><tr><td>Souris CX3CR1 Anticorps conjugués PE</td><td>R& D</td><td>FAB5825P</td><td></td></tr><tr><td>IgG de chèvre conjugué à l’anticorps PE</td><td>R& D</td><td>IC108P</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Analyseur de cellules</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSVERSE</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse de données</td><td>FlowJo LLC</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux fins</td><td>F.S.T</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Pince à motif standard</td><td>F.S.T</td><td>11000-13</td><td></td></tr><tr><td>Mayo Ciseaux</td><td>F.S.T</td><td>14010-15</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pince</td><td>F.S.T</td><td>11251-20</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse de la microglie et des macrophages dérivés de monocytes du système nerveux central par cytométrie de flux

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

De nombreuses études ont démontré le rôle des cellules immunitaires, en particulier des macrophages, dans les pathologies du système nerveux central (SNC). Il existe deux principales populations de macrophages dans le SNC: (i) la microglie, qui sont les macrophages résidents du SNC et dérivent des progéniteurs du sac vésiculaire pendant l&#39;embryogenèse, et (ii) les macrophages dérivés des monocytes (MDM), qui peuvent infiltrer Le SNC pendant la maladie et sont dérivés de progéniteurs de moelle osseuse. Les rôles de chaque sous-population de macrophages diffèrent en fonction de la pathologie étudiée. En outre, il n&#39;y a pas de consensus sur les marqueurs histologiques ou les critères distinctifs utilisés pour ces sous-populations de macrophages. Cependant, l&#39;analyse des profils d&#39;expression des marqueurs CD11b et CD45 par cytométrie en flux nous permet de distinguer la microglie (CD11b + CD45 med ) du MDM (CD11b + CD45 haute ). Dans ce protocole, nous montrons que la centrifugation à gradient de densitéEt l&#39;analyse par cytométrie de flux peut être utilisée pour caractériser ces sous-populations de macrophages du SNC et pour étudier plusieurs marqueurs d&#39;intérêt exprimés par ces cellules au fur et à mesure de notre publication. Ainsi, cette technique peut favoriser notre compréhension du rôle des macrophages dans les modèles de souris de maladies neurologiques et peut également être utilisée pour évaluer les effets sur ces cellules.

Après la centrifugation en gradient de densité et la coloration d&#39;anticorps, les cellules ont été acquises sur un cytomètre de flux et analysées à l&#39;aide d&#39;une stratégie de fermeture morphologique comme suit. Une première grille a été définie dans la zone de répartition par points (FSC-A) par rapport à la hauteur réversible (FSC-H) pour discriminer les cellules individuelles des doublets ( Figure 3A ). Les cellules individuelles ont ensu...

Ce protocole fournit une analyse des sous-populations de macrophages dans le système nerveux central de souris par cytométrie de flux et est utile pour l&#39;étude de marqueurs multiples exprimés par ces cellules.

Analyse de la microglie et des macrophages dérivés de monocytes du système nerveux central par cytométrie de flux

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

L'objectif général de cette expérience est d'évaluer les différents marqueurs exprimés par les sous-populations de macrophages au sein du système nerveux central ou SNC. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neuro-immunologie, telles que les macrophages duperry alors que nous essayons de comprendre le SNC en état de vertiges, et quels sont les phénotypes des macrophages du SNC. Les principaux avantages de cette technique sont l'isolement d'un grand nombre de sous-populations de macrophages hautement purifiées, ainsi que la caractérisation des marqueurs cellulaires des sous-populations de macrophages.Commencez par utiliser des ciseaux fins pour couper la peau ventrale juste en dessous du processus xiphoïde afin d'exposer la cavité thoracique. Faites une incision dans le diaphragme et coupez les parties latérales de la cage thoracique dans un sens caudal à rostral pour exposer le cœur. Après avoir identifié le ventricule gauche et l'oreillette droite, insérez un cathéter papillon muni d'une aiguille de calibre 25 dans le ventricule gauche.Pratiquer une incision sur l'oreillette droite et commencer à perfuser 20 millilitres de PBS à travers le cathéter à un débit de dix millilitres par minute dès que le sang commence à s'écouler. Une perfusion réussie sera indiquée par un blanchissement des poumons et du foie au fur et à mesure du remplacement du sang. Ensuite, utiliser des ciseaux fins pour disséquer la colonne vertébrale.Retirer les muscles de la paroi abdominale sur la face ventrale de la colonne vertébrale, puis sectionner la colonne vertébrale à la base de la queue afin d'extraire la moelle épinière au moment de sa récolte. Introduire une seringue de dix millilitres de PBS munie d'une pointe de pipette modifiée de 200 microlitres dans la région lombaire de la colonne vertébrale. Ensuite, rincer la moelle épinière du côté cervical.Retirer la peau au-dessus du crâne et insérer une pointe des ciseaux à la base du crâne. Couper le crâne en suivant la suture sagittale. Puis insérer une petite pince dans l'incision et retirer délicatement le sommet du crâne.Dissez le cerveau de la tête de la souris et retirez le bulbe olfactif et le cervelet. Ensuite, placez le cerveau et la moelle épinière dans un tube de un virgule cinq millilitre contenant un virgule un deux huit millilitre de cocktail de digestion. Pour dissocier les cellules, utilisez de petites ciseaux pour couper finement le cerveau et la moelle épinière en morceaux d’un à deux millimètres cubes et placez les morceaux à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant 30 minutes.À la fin de l'incubation, arrêter la digestion avec 20 microlitres de EDTA à zéro virgule cinq molaire, suivie d'une trituration douce à l'aide d'une pipette de cinq millilitres. Filtrer la suspension cellulaire obtenue à travers un tamis de 70 microns dans un tube conique de 50 millilitres en utilisant le piston d'une seringue de dix millilitres pour macérer délicatement tout tissu cérébral ou médullaire résiduel. Rincer le tamis avec 20 millilitres de PBS contenant cinq pour cent de FBS.Et récupérez les cellules filtrées par centrifugation. Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant sans perturber le culot. Pour la séparation des cellules par gradient de densité, nous resuspendons le culot avec quatre millilitres de milieu de gradient de densité à 30 pour cent, puis transférons les cellules dans un tube conique de 15 millilitres.Superposer délicatement quatre millilitres de milieu de gradient de densité à 37 %, puis quatre millilitres de milieu de gradient de densité à 70 % sous le milieu de gradient de densité à 37 %. Transférer le tube dans une centrifugeuse de banc pour séparer les cellules. Les microglies et les cellules macrophages se trouveront à l'interface des couches de gradient de densité à 70 et 37 %.Le tube apparaîtra stratifié. Après avoir soigneusement retiré la couche supérieure de myéline, transférez trois à quatre millilitres de la couche intermédiaire de microglie et de macrophages dans un nouveau tube de 15 millilitres. Lavez ensuite les cellules immunitaires par trois centrifugations dans 15 millilitres de PBS, en redispersant le culot dans un millilitre de PBS après le dernier lavage.Pour évaluer l'expression des marqueurs des sous-populations de macrophages, transférez les cellules dans un tube d'analyse en cytométrie en flux de cinq millilitres, puis ajoutez un microlitre de réactif vital pour coloration des cellules mortes fixable. Après 30 minutes sur de la glace, à l'abri de la lumière, lavez les échantillons avec deux millilitres de PBS, puis remettez en suspension le culot dans 400 microlitres de tampon fax par tube d'analyse expérimental. Répartissez les cellules dans le nombre approprié de tubes d'analyse en cytométrie en flux de cinq millilitres.Ensuite, bloquer la liaison non spécifique des récepteurs Fc à l’aide d’un microgramme de cocktail d’anticorps bloquants CD 16 CD 32 par 100 microlitres de cellules, en incubant 10 à 15 minutes sur de la glace, à l’abri de la lumière. Puis, marquer les cellules avec 100 microlitres des anticorps primaires appropriés, en incubant 30 minutes sur de la glace, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, laver les cellules quatre fois avec deux millilitres de PBS.Ensuite, ajouter 100 microlitres des anticorps secondaires appropriés pendant 30 minutes sur de la glace, à l’abri de la lumière, suivis de quatre lavages dans le PBS comme vient d’être démontré. Après le dernier lavage, re-suspendre délicatement les culots dans 100 microlitres de paraformaldéhyde à un pour cent pendant 15 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. Puis laver les cellules quatre fois dans le PBS.Resuspendre les culots finaux dans 200 microlitres de PBS frais et analyser les cellules par cytométrie en flux. Les microglies provenant du cerveau et de la moelle épinière, ainsi que les macrophages dérivés des monocytes, sont identifiés en fonction de leur expression de CD11b et de CD45. L'expression de CX3CR1 et de Tmem119 par les cellules microgliales CD11b positif et CD45 de niveau intermédiaire permet de distinguer davantage cette population cellulaire des macrophages dérivés des monocytes CD11c positif et CD45 élevé, qui n'expriment aucun de ces marqueurs, mais expriment en revanche CCR2.Après la séparation par gradient de densité, 85 à 95 pour cent des cellules sont encore viables. En l'absence d'isolement par gradient de densité, les sous-populations de macrophages ne sont pas identifiables sur un tracé de dispersion bi-latérale directe, en raison de la présence de cellules non macrophagiques et de débris de myéline. Étant donné que l'épitope reconnu par l'anticorps anti-Tmem119 est intracellulaire, une perméabilisation est nécessaire pour l'étiquetage de ce marqueur important des microglies.Remarquez que la perméabilisation induit un rétrécissement des cellules, ce qui fait que les sous-populations de macrophages apparaissent plus petites lors de l'analyse de la diffusion directe par rapport à la diffusion latérale. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq heures si elle est effectuée correctement. Lorsque j'ai tenté cette procédure, il est important de se rappeler de préparer très soigneusement le gradient de densité.Après cette procédure, d'autres méthodes, comme la RT-PCR quantitative, peuvent être réalisées pour répondre à des questions supplémentaires concernant les voies de signalisation des sous-populations de macrophages. Depuis son développement, cette technique a permis aux chercheurs du domaine des neurosciences d'explorer l'activation des sous-populations de macrophages dans un modèle murin de maladie neurologique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez soit effectuer des tests, soit suivre cette démarche en caractérisant les sous-populations de macrophages par cytométrie en flux.N'oubliez pas que le travail avec le paraformaldéhyde peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que l'utilisation d'une hotte, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Les microglies sont les macrophages résidents qui fournissent la première ligne de défense et de la surveillance immunitaire du système nerveux central. Les microARN sont des molécules régulatrices qui jouent un rôle important dans de nombreux processus physiologiques, y compris l'activation et la différenciation des macrophages. Dans cet article, nous décrivons la méthode de mesure des microARN dans la microglie.

Détection des microARN dans la microglie par PCR en temps réel dans le SNC normal et pendant neuroinflammation

Cette vidéo montre la cytométrie en flux pour mesurer l’absorption microgliale de bioparticules fluorescentes après administration intravitréenne dans un œil de souris. La cytométrie en flux détecte les cellules vivantes exprimant CD11b et distingue les cellules microgliales phagocytaires présentant une fluorescence verte des autres cellules myéloïdes, y compris les monocytes exprimant Ly6C et les neutrophiles exprimant Ly6G.

Mesure de l’absorption microgliale de particules fluorescentes administrées par voie intravitréenne à l’aide de la cytométrie en flux

phagocytose microgliale est essentiel pour le maintien de l'homéostasie tissulaire et la fonction phagocytaire insuffisante a été impliquée dans la pathologie. Cependant, l' évaluation de la fonction microglies in vivo est techniquement difficile. Nous avons mis au point une technique simple mais robuste pour surveiller et quantifier le potentiel phagocytaire de la microglie dans un cadre physiologique précisément.

Évaluation Retinal microglial phagocytaire Fonction<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;utilisation d&#39;un test basé sur la cytométrie de flux

Analyse quantitative du contenu de la cellule dans le nerf sciatique murin est difficile en raison de la rareté du tissu. Ce protocole décrit une méthode de digestion de tissu et de préparation qui fournit des cellules suffisants pour analyse en cytométrie flux de populations de cellules immunitaires des nerfs de souris individuels.

Analyse des cellules immunitaires dans unique des nerfs sciatique et Ganglion de la racine dorsale d’une souris à l’aide de cytométrie en flux

Un protocole pour l’isolement des microglies primaire du cerveau murin est présenté. Cette technique contribue à faire avancer la compréhension actuelle des maladies neurologiques. Centrifugation en gradient de densité et de la séparation magnétique sont combinés pour produire une récolte suffisante d’un échantillon très pur. En outre, nous exposent les étapes pour la caractérisation des cellules microgliales.

La caractérisation et l’isolement des microglies primaire de souris par Centrifugation en Gradient de densité

Ce protocole fournit une méthode pour digérer des yeux entiers dans une suspension cellulaire simple aux fins de l’analyse cytométrique de flux multi-paramètres afin d’identifier des populations phagocytiques mononucléaires oculaires spécifiques, y compris les monocytes, les microglies, les macrophages et les cellules dendritiques.

Digestion des yeux de souris entières pour l’analyse cytométrique de flux multi-paramètres des phagocytes mononucléaires

Nous présentons ici deux protocoles pour quantifier l’engloutissement microglial des synapses vGLUT1-positives et des synaptosomes bruts marqués en rouge pHRodo à l’aide de la cytométrie en flux.

Quantification de l’engloutissement microglial du matériel synaptique à l’aide de la cytométrie en flux

Il est difficile d’identifier les microglies (MG) et les macrophages infiltrants périphériques (Mø) dans les moelles épinières lésées. Dans ce protocole, la cytométrie en flux (FCM) a été utilisée pour identifier respectivement la MG de type M1, la MG de type M2, la Mø de type M1 et la Mø de type M2. Cette technologie peut également être appliquée à d’autres maladies du système nerveux central pour comprendre le rôle de la MG et de la Mø.

Identification de la microglie et des macrophages infiltrants périphériques dans la moelle épinière lésée à l’aide de la cytométrie en flux

Ici, nous présentons un protocole pour évaluer la fonction des cellules immunitaires après un AVC ischémique à l’aide de l’analyse cytométrique en flux dans un modèle de mini-AVC. Cette méthode permet un examen détaillé des interactions neuro-immunes et peut être adaptée à l’étude d’autres maladies neurodégénératives, améliorant ainsi notre compréhension des réponses immunitaires dans la pathologie de l’AVC.

Isolement et évaluation par cytométrie en flux des interactions neuro-immunes dans un modèle murin de mini-AVC

Ce protocole combine la cytométrie en flux et le séquençage de l’ARN unicellulaire pour isoler et caractériser les états des cellules microgliales dans le cervelet des cerveaux de souris postnatals précoces. Il utilise la dissociation enzymatique, la centrifugation de Percoll et l’immunomarquage pour révéler l’hétérogénéité des microglies et améliorer la compréhension de leurs rôles dans le développement et la maladie cérébelleux.

Cytométrie en flux et analyse de cellules uniques pour caractériser l’activation de la microglie dans le développement postnatal précoce du cerveau de souris

Découvrez l'analyse des sous-populations de microglie et de macrophages du système nerveux central par cytométrie de flux chez la souris adulte. Cette méthode permet d'identifier les marqueurs cellulaires spécifiques et d'étudier les rôles fonctionnels dans la neuroinflammation.

Analyse de la microglie et des macrophages dérivés de monocytes du système nerveux central par cytométrie de flux

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