Analyse de la microglie et des macrophages dérivés de monocytes du système nerveux central par cytométrie de flux

L'objectif général de cette expérience est d'évaluer les différents marqueurs exprimés par les sous-populations de macrophages au sein du système nerveux central ou SNC. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neuro-immunologie, telles que les macrophages duperry alors que nous essayons de comprendre le SNC en état de vertiges, et quels sont les phénotypes des macrophages du SNC. Les principaux avantages de cette technique sont l'isolement d'un grand nombre de sous-populations de macrophages hautement purifiées, ainsi que la caractérisation des marqueurs cellulaires des sous-populations de macrophages.

Commencez par utiliser des ciseaux fins pour couper la peau ventrale juste en dessous du processus xiphoïde afin d'exposer la cavité thoracique. Faites une incision dans le diaphragme et coupez les parties latérales de la cage thoracique dans un sens caudal à rostral pour exposer le cœur. Après avoir identifié le ventricule gauche et l'oreillette droite, insérez un cathéter papillon muni d'une aiguille de calibre 25 dans le ventricule gauche.

Pratiquer une incision sur l'oreillette droite et commencer à perfuser 20 millilitres de PBS à travers le cathéter à un débit de dix millilitres par minute dès que le sang commence à s'écouler. Une perfusion réussie sera indiquée par un blanchissement des poumons et du foie au fur et à mesure du remplacement du sang. Ensuite, utiliser des ciseaux fins pour disséquer la colonne vertébrale.

Retirer les muscles de la paroi abdominale sur la face ventrale de la colonne vertébrale, puis sectionner la colonne vertébrale à la base de la queue afin d'extraire la moelle épinière au moment de sa récolte. Introduire une seringue de dix millilitres de PBS munie d'une pointe de pipette modifiée de 200 microlitres dans la région lombaire de la colonne vertébrale. Ensuite, rincer la moelle épinière du côté cervical.

Retirer la peau au-dessus du crâne et insérer une pointe des ciseaux à la base du crâne. Couper le crâne en suivant la suture sagittale. Puis insérer une petite pince dans l'incision et retirer délicatement le sommet du crâne.

Dissez le cerveau de la tête de la souris et retirez le bulbe olfactif et le cervelet. Ensuite, placez le cerveau et la moelle épinière dans un tube de un virgule cinq millilitre contenant un virgule un deux huit millilitre de cocktail de digestion. Pour dissocier les cellules, utilisez de petites ciseaux pour couper finement le cerveau et la moelle épinière en morceaux d’un à deux millimètres cubes et placez les morceaux à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant 30 minutes.

À la fin de l'incubation, arrêter la digestion avec 20 microlitres de EDTA à zéro virgule cinq molaire, suivie d'une trituration douce à l'aide d'une pipette de cinq millilitres. Filtrer la suspension cellulaire obtenue à travers un tamis de 70 microns dans un tube conique de 50 millilitres en utilisant le piston d'une seringue de dix millilitres pour macérer délicatement tout tissu cérébral ou médullaire résiduel. Rincer le tamis avec 20 millilitres de PBS contenant cinq pour cent de FBS.

Et récupérez les cellules filtrées par centrifugation. Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant sans perturber le culot. Pour la séparation des cellules par gradient de densité, nous resuspendons le culot avec quatre millilitres de milieu de gradient de densité à 30 pour cent, puis transférons les cellules dans un tube conique de 15 millilitres.

Superposer délicatement quatre millilitres de milieu de gradient de densité à 37 %, puis quatre millilitres de milieu de gradient de densité à 70 % sous le milieu de gradient de densité à 37 %. Transférer le tube dans une centrifugeuse de banc pour séparer les cellules. Les microglies et les cellules macrophages se trouveront à l'interface des couches de gradient de densité à 70 et 37 %.

Le tube apparaîtra stratifié. Après avoir soigneusement retiré la couche supérieure de myéline, transférez trois à quatre millilitres de la couche intermédiaire de microglie et de macrophages dans un nouveau tube de 15 millilitres. Lavez ensuite les cellules immunitaires par trois centrifugations dans 15 millilitres de PBS, en redispersant le culot dans un millilitre de PBS après le dernier lavage.

Pour évaluer l'expression des marqueurs des sous-populations de macrophages, transférez les cellules dans un tube d'analyse en cytométrie en flux de cinq millilitres, puis ajoutez un microlitre de réactif vital pour coloration des cellules mortes fixable. Après 30 minutes sur de la glace, à l'abri de la lumière, lavez les échantillons avec deux millilitres de PBS, puis remettez en suspension le culot dans 400 microlitres de tampon fax par tube d'analyse expérimental. Répartissez les cellules dans le nombre approprié de tubes d'analyse en cytométrie en flux de cinq millilitres.

Ensuite, bloquer la liaison non spécifique des récepteurs Fc à l’aide d’un microgramme de cocktail d’anticorps bloquants CD 16 CD 32 par 100 microlitres de cellules, en incubant 10 à 15 minutes sur de la glace, à l’abri de la lumière. Puis, marquer les cellules avec 100 microlitres des anticorps primaires appropriés, en incubant 30 minutes sur de la glace, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, laver les cellules quatre fois avec deux millilitres de PBS.

Ensuite, ajouter 100 microlitres des anticorps secondaires appropriés pendant 30 minutes sur de la glace, à l’abri de la lumière, suivis de quatre lavages dans le PBS comme vient d’être démontré. Après le dernier lavage, re-suspendre délicatement les culots dans 100 microlitres de paraformaldéhyde à un pour cent pendant 15 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. Puis laver les cellules quatre fois dans le PBS.

Resuspendre les culots finaux dans 200 microlitres de PBS frais et analyser les cellules par cytométrie en flux. Les microglies provenant du cerveau et de la moelle épinière, ainsi que les macrophages dérivés des monocytes, sont identifiés en fonction de leur expression de CD11b et de CD45. L'expression de CX3CR1 et de Tmem119 par les cellules microgliales CD11b positif et CD45 de niveau intermédiaire permet de distinguer davantage cette population cellulaire des macrophages dérivés des monocytes CD11c positif et CD45 élevé, qui n'expriment aucun de ces marqueurs, mais expriment en revanche CCR2.

Après la séparation par gradient de densité, 85 à 95 pour cent des cellules sont encore viables. En l'absence d'isolement par gradient de densité, les sous-populations de macrophages ne sont pas identifiables sur un tracé de dispersion bi-latérale directe, en raison de la présence de cellules non macrophagiques et de débris de myéline. Étant donné que l'épitope reconnu par l'anticorps anti-Tmem119 est intracellulaire, une perméabilisation est nécessaire pour l'étiquetage de ce marqueur important des microglies.

Remarquez que la perméabilisation induit un rétrécissement des cellules, ce qui fait que les sous-populations de macrophages apparaissent plus petites lors de l'analyse de la diffusion directe par rapport à la diffusion latérale. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq heures si elle est effectuée correctement. Lorsque j'ai tenté cette procédure, il est important de se rappeler de préparer très soigneusement le gradient de densité.

Après cette procédure, d'autres méthodes, comme la RT-PCR quantitative, peuvent être réalisées pour répondre à des questions supplémentaires concernant les voies de signalisation des sous-populations de macrophages. Depuis son développement, cette technique a permis aux chercheurs du domaine des neurosciences d'explorer l'activation des sous-populations de macrophages dans un modèle murin de maladie neurologique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez soit effectuer des tests, soit suivre cette démarche en caractérisant les sous-populations de macrophages par cytométrie en flux.

N'oubliez pas que le travail avec le paraformaldéhyde peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que l'utilisation d'une hotte, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.