Isolement des cellules de ganglion rétiniennes murines primaires (RGC) par cytométrie de flux

L’objectif global de cette procédure est d’isoler une population homogène enrichie de cellules ganglionnaires rétiniennes primaires murines. Cette méthode peut aider à répondre aux questions dans le domaine des cellules ganglionnaires rétiniennes sur les mécanismes sous-jacents à la baisse de l’acuité visuelle dans les populations d’âge et dans les populations atteintes de maladies dégénératives rétiniennes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut offrir un protocole rapide, visible, reproductible et standardisé pour l’isolement de cellules ganglionnaires rétiniennes primaires enrichies.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque Sumana Chintalapudi, qui était alors étudiante diplômée dans mon laboratoire et première auteure de cette étude, a présenté à notre club de lecture un article de 2013 de Krishna Murtheadol, et leur étude a clairement démontré que la lignée cellulaire à cinq cellules RGC, qui a été générée à l’origine comme une lignée cellulaire ganglionnaire rétinienne de rat immortalisée, n’était plus d’origine rataire et ne possédait pas le phénotype RGC. Il nous est apparu évident que ce problème laissait un grand vide dans les ressources disponibles pour le milieu de la recherche sur la vision, y compris notre propre laboratoire. Sumana et moi avons contacté le Dr Morales-Tirado et, ensemble, nous avons développé une nouvelle méthode pour isoler les CGR vivants et hautement enrichis.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal, car les objectifs de cette méthode sont d’isoler une population cellulaire vivante et hautement enrichie qui peut être soit cultivée en tant que cellules primaires, soit immortalisée en tant que lignée cellulaire. Pour cette raison, il faut faire très attention à ne pas endommager les cellules que l’on essaie d’isoler. De plus, les paramètres de la méthode de tri cellulaire doivent être adaptés aux cellules spécifiques que l’on essaie d’isoler.

Les deux méthodes nécessitent des compétences particulières. La démonstration des procédures sera assurée par le Dr Xiang Di Wang, associé de recherche du laboratoire du Dr Jablonski, et M. Zach Goldsmith, candidat au doctorat de mon laboratoire. Pour énucléer l’œil, insérez d’abord une pince sous le globe de l’œil.

Saisissez le nerf optique et tirez vers le haut. Le globe sera énucléé avec le nerf optique intact. Placez l’œil dans une fiole de PBS sur de la glace et énucléez l’autre œil.

Lorsque tous les yeux ont été prélevés, placez un œil dans une boîte de Pétri de PBS frais sous un microscope de dissection et utilisez une pince pour saisir soigneusement le globe à la base du nerf optique. À l’aide d’une aiguille pointue de calibre 30, percez la cornée pour permettre à l’humeur aqueuse de s’écouler, ce qui facilite la tenue de l’œil avec la pince. En tenant la cornée à l’aide de la pince, utilisez des ciseaux pour faire une petite incision dans le tissu cornéen et utilisez la pince pour retirer doucement la cornée et la sclère.

Lorsque le globe est pelé à moitié, utilisez la pince pour dérouler la rétine et le cristallin. Placez la rétine dans une petite boîte de Pétri de 40 millimètres contenant du PBS et 1 % FPS dans une armoire de biosécurité et lavez la rétine trois fois avec du PBS frais plus FBS pour chaque lavage. Lorsque tous les yeux ont été lavés, placez jusqu’à 12 rétines sur une passoire stérile en nylon de 70 microns imbibée de PBS et de FBS et faites macérer doucement les rétines avec l’extrémité arrière d’un piston de seringue de 10 millilitres, en utilisant un mouvement circulaire.

Lorsque toutes les cellules ont été dissociées, placez la passoire sur un tube de collecte en polypropylène et utilisez une pipette P1000 pour filtrer les cellules à travers la passoire dans le tube de collecte. Rincez la passoire avec du PBS et du FBS, en regroupant le linge dans le tube de collecte. Ajoutez suffisamment de PBS et de FBS pour porter le volume final à un millilitre de solution par rétine et collectez les cellules par centrifugation.

Ensuite, réintroduisez la pastille dans du PBS plus FBS à raison d’un millilitre de milieu pour cinq concentrations de rétine, si l’immunomarquage doit être effectué immédiatement. Alternativement, incubez les cellules remises en suspension dans un milieu cellulaire neural pendant la nuit à quatre degrés Celsius en position horizontale. Pour immunomarquer les cellules rétiniennes, centrifuger la suspension de cellules rétiniennes et remettre en suspension la pastille dans 50 microlitres de PBS frais plus FBS dans un tube de télécopie.

Mettez de côté cinq fois 10 à la sixième cellule pour le contrôle négatif non étiqueté. Ensuite, bloquez toute liaison non spécifique du récepteur FC dans chaque tube avec un microlitre d’anticorps anti-souris CD 16 32 par fois 10 cellules à la sixième, pendant 10 minutes à température ambiante. A la fin de l’incubation bloquante, ajouter le cocktail d’anticorps d’intérêt aux cellules par pipetage doux pour une incubation de 30 minutes sur glace à l’abri de la lumière.

Ensuite, lavez les cellules deux fois dans une formule litre volume final de PBS et FBS. Étiquetez les cellules avec un anticorps secondaire approprié pendant encore 30 minutes sur de la glace à l’abri de la lumière, suivies de deux lavages dans PBS plus FBS comme nous venons de le démontrer. Remettre les granulés en suspension dans du PBS et du FBS frais pour le comptage des cellules.

Pour ajuster la compensation, ajoutez trois gouttes de microsphères de polystyrène dans un tube de fax stérile par flore et un microgramme de la flore correspondante pour chaque tube. Incuber les microsphères pendant 15 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière. Ensuite, lavez les microsphères dans trois millilitres de PBS et FBS et retirez soigneusement le surnageant.

Remettez les granulés de microsphères en suspension dans 250 microlitres de PBS et de FBS et chargez le tube d’échantillon non étiqueté sur le cytomètre en flux. Dans le logiciel de cytomètre en flux, sélectionnez l’expérience, la configuration de la compensation et créez des commandes de compensation. Ajoutez la flore pour des commandes spécifiques à partir de la liste affichée et cliquez sur OK. Vérifiez la lumière diffusée vers l’avant et la lumière diffusée latéralement, et repérez la population initiale.

Installez ensuite le tube de contrôle négatif sur le cytomètre et cliquez sur charger. Vérifiez que la population d’intérêt ou P1 est affichée et sélectionnez-la. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur la porte P1 et sélectionnez Calculer l’indemnisation.

Cliquez ensuite sur Enregistrer les données. Une fois l’enregistrement terminé, cliquez sur décharger pour retirer le tube et chargez le tube de commande suivant pour régler les commandes de compensation. Lorsque tous les échantillons de contrôle ont été enregistrés, créez un diagramme de dispersion vers l’avant et vers l’extérieur pour le premier tube expérimental et repérez la population P1.

Ensuite, ouvrez un pseudo tracé de couleur hauteur de diffusion latérale en fonction de la largeur de diffusion latérale et contrôlez les cellules individuelles. À l’aide des cellules individuelles, créez un tracé de hauteur de diffusion vers l’avant en fonction de la largeur de diffusion vers l’avant, ainsi qu’une porte pour exclure les doublons. Générez ensuite un pseudo-tracé de couleur CD48 par rapport à CD90.2 et contrôlez les cellules négatives CD48 positives CD90.2 pour éliminer les monocytes, suivi d’un pseudo-tracé de couleur CD57 par rapport à CD15 pour éliminer tout contaminant de cellules amacrines.

Définissez maintenant les populations à collecter pour l’échantillon dans la feuille de tri et triez les cellules. À la fin du tri, utilisez une aliquote de 2,5 fois 10 à la quatrième cellule pour confirmer la pureté de la population de cellules isolées. Après avoir maillé les rétines dans la crépine cellulaire, plusieurs cellules rétiniennes internes peuvent être visualisées, même si les cellules ganglionnaires de la rétine ont perdu leur morphologie caractéristique, en raison de l’axotomie pendant la procédure d’isolement cellulaire.

Le phénotype de surface CD48 négatif positif classique n’est pas suffisant pour identifier et isoler les cellules ganglionnaires rétiniennes murines, car ces cellules expriment des gènes associés aux cellules épithéliales de l’amacrine, de la muller, du bipolarité, du photorécepteur horizontal et de la pigmentation rétinienne. Les cellules triées expriment également des marqueurs intracellulaires associés aux cellules ganglionnaires rétiniennes tels que la synucléine gamma, BRN3A, TUJ1 et RBPMS, la localisation intracellulaire des marqueurs étant confirmée par cytométrie en flux d’imagerie. Certaines des cellules triées commencent même à présenter une morphologie des cellules ganglionnaires rétiniennes après une culture cellulaire in vitro.

De plus, l’analyse quantitative par PCR de la population de cellules triées hautement enrichies révèle une multiplication par plusieurs des gènes codant pour des marqueurs intracellulaires spécifiques des ganglions rétiniens. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de six heures si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de garder votre suspension cellulaire stérile, de bloquer les récepteurs FC de la suspension cellulaire, d’éviter la liaison non spécifique des anticorps et de discuter des détails de votre tri cellulaire ou de votre stratégie avec l’opérateur du trieur de cellules.

Après cette procédure, d’autres méthodes comme la QPCR peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur le profilage de l’expression génique. N’oubliez pas que le travail d’un équipement spécialisé, comme un trieur de cellules, nécessite un opérateur hautement spécialisé. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la vision pour aider à comprendre les mécanismes de survie et de mort dans les cellules ganglionnaires rétiniennes, pour le développement de nouvelles thérapies pour la préservation de la vision.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler une population homogène enrichie de cellules ganglionnaires rétiniennes murines primaires.