Name: Isolement des cellules de ganglion rétiniennes murines primaires (RGC) par cytométrie de flux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Découvrez l'isolement de cellules de ganglion rétiniennes murines primaires par cytométrie de flux. Cette méthode standardisée permet d'obtenir une population enrichie de RGCs vivantes pour étudier les mécanismes de dégénérescence rétinienne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs tiennent à remercier M. Tim Higgins, Illustrateur principal du Département de microbiologie, d&#39;immunologie et de biochimie, pour l&#39;assistance vidéo technique; Dr. Matthew W. Wilson pour les discussions et les membres des laboratoires Jablonski et Morales-Tirado pour leurs commentaires utiles. Ce travail a été soutenu par le Prix du jeune chercheur de l&#39;Institut de recherche d&#39;Alcon (VMM-T), la Fondation de recherche de l&#39;Université de Tennessee (VMM-T), l&#39;Institut national des yeux EY021200 (MMJ), Gerwin Fellowship (VMM-T); La bourse pré-doctorale Gerwin (ZKG), la recherche médicale et le commandement du matériel du ministère de la Défense (VMM-T) et la subvention sans restriction de la recherche pour prévenir la cécité.

<ol><li>Flammer, J., Orgul, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+nerve+blood-flow+abnormalities+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Optic nerve blood-flow abnormalities in glaucoma.</a> Prog Retin Eye Res. 17 (2), 267-289 (1998).</li>
<li>Bathija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+nerve+blood+flow+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Optom%22%5BJournal%5D)">Optic nerve blood flow in glaucoma.</a> Clin Exp Optom. 83 (3), 180-184 (2000).</li>
<li>Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hypothesis+to+explain+ganglion+cell+death+caused+by+vascular+insults+at+the+optic+nerve+head%3A+possible+implication+for+the+treatment+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A hypothesis to explain ganglion cell death caused by vascular insults at the optic nerve head: possible implication for the treatment of glaucoma.</a> Br J Ophthalmol. 85 (10), 1252-1259 (2001).</li>
<li>Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulation+and+axonal+transport+in+the+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Circulation and axonal transport in the optic nerve.</a> Eye (Lond). 18 (11), 1089-1095 (2004).</li>
<li>Tian, N., Hwang, T. N., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+excitatory+and+inhibitory+spontaneous+synaptic+activity+in+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of excitatory and inhibitory spontaneous synaptic activity in mouse retinal ganglion cells.</a> J Neurophysiol. 80 (3), 1327-1340 (1998).</li>
<li>Schmidt, K. G., Bergert, H., Funk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+diseases+of+the+retina+and+potential+for+protection+and+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Neuropharmacol%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative diseases of the retina and potential for protection and recovery.</a> Curr Neuropharmacol. 6 (2), 164-178 (2008).</li>
<li>Dreher, B., Sefton, A. J., Ni, S. Y., Nisbett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphology%2C+number%2C+distribution+and+central+projections+of+Class+I+retinal+ganglion+cells+in+albino+and+hooded+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Evol%22%5BJournal%5D)">The morphology, number, distribution and central projections of Class I retinal ganglion cells in albino and hooded rats.</a> Brain Behav Evol. 26 (1), 10-48 (1985).</li>
<li>Williams, R. W., Strom, R. C., Rice, D. S., Goldowitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+environmental+control+of+variation+in+retinal+ganglion+cell+number+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic and environmental control of variation in retinal ganglion cell number in mice.</a> J Neurosci. 16 (22), 7193-7205 (1996).</li>
<li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The major cell populations of the mouse retina.</a> J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).</li>
<li>Surgucheva, I., Weisman, A. D., Goldberg, J. L., Shnyra, A., Surguchov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-synuclein+as+a+marker+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Gamma-synuclein as a marker of retinal ganglion cells.</a> Mol Vis. 14, 1540-1548 (2008).</li>
<li>Nadal-Nicolas, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brn3a+as+a+marker+of+retinal+ganglion+cells%3A+qualitative+and+quantitative+time+course+studies+in+naive+and+optic+nerve-injured+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3860-3868 (2009).</li>
<li>Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+binding+protein+with+multiple+splicing%3A+a+new+marker+for+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (2), 1052-1058 (2010).</li>
<li>Van Bergen, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recharacterization+of+the+RGC-5+retinal+ganglion+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Recharacterization of the RGC-5 retinal ganglion cell line.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (9), 4267-4272 (2009).</li>
<li>Wood, J. P., Chidlow, G., Tran, T., Crowston, J. G., Casson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+differentiation+protocols+for+RGC-5+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">A comparison of differentiation protocols for RGC-5 cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (7), 3774-3783 (2010).</li>
<li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological%2C+morphological%2C+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1 (9), 791-803 (1998).</li>
<li>Hong, S., Iizuka, Y., Kim, C. Y., Seong, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+mouse+retinal+ganglion+cells+using+immunopanning-magnetic+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary mouse retinal ganglion cells using immunopanning-magnetic separation.</a> Mol Vis. 18, 2922-2930 (2012).</li>
<li>Julius, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sensitivity+of+exponentials+and+other+curves+to+their+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Biomed+Res%22%5BJournal%5D)">The sensitivity of exponentials and other curves to their parameters.</a> Comput Biomed Res. 5 (5), 473-478 (1972).</li>
<li>Reif, A. E., Allen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Akr+Thymic+Antigen+and+Its+Distribution+in+Leukemias+and+Nervous+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The Akr Thymic Antigen and Its Distribution in Leukemias and Nervous Tissues.</a> J Exp Med. 120, 413-433 (1964).</li>
<li>Watanabe, M., Noguchi, T., Tsukada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional%2C+cellular%2C+and+subcellular+distribution+of+Thy-1+antigen+in+rat+nervous+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Regional, cellular, and subcellular distribution of Thy-1 antigen in rat nervous tissues.</a> Neurochem Res. 6 (5), 507-519 (1981).</li>
<li>Haeryfar, S. M., Hoskin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1%3A+more+than+a+mouse+pan-T+cell+marker%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thy-1: more than a mouse pan-T cell marker.</a> J Immunol. 173 (6), 3581-3588 (2004).</li>
<li>Sahagun, G., Moore, S. A., Fabry, Z., Schelper, R. L., Hart, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+murine+endothelial+cell+cultures+by+flow+cytometry+using+fluorescein-labeled+griffonia+simplicifolia+agglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Purification of murine endothelial cell cultures by flow cytometry using fluorescein-labeled griffonia simplicifolia agglutinin.</a> Am J Pathol. 134 (6), 1227-1232 (1989).</li>
<li>Shoge, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+retinal+ganglion+cells+culture+enriched+with+the+magnetic+cell+sorter%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Rat retinal ganglion cells culture enriched with the magnetic cell sorter.</a> Neurosci Lett. 259 (2), 111-114 (1999).</li>
<li>Chintalapudi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Molecular+Profiling+of+Primary+Mouse+Retinal+Ganglion+Cells%3A+Comparison+of+Phenotypes+from+Healthy+and+Glaucomatous+Retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation and Molecular Profiling of Primary Mouse Retinal Ganglion Cells: Comparison of Phenotypes from Healthy and Glaucomatous Retinas.</a> Front Aging Neurosci. 8, 93(2016).</li>
<li>Nagdeve, N. G., Yaddanapudi, S., Pandav, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+different+doses+of+ketamine+on+intraocular+pressure+in+anesthetized+children%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr+Ophthalmol+Strabismus%22%5BJournal%5D)">The effect of different doses of ketamine on intraocular pressure in anesthetized children.</a> J Pediatr Ophthalmol Strabismus. 43 (4), 219-223 (2006).</li>
<li>Ding, C., Wang, P., Tian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+general+anesthetics+on+IOP+in+elevated+IOP+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model.</a> Exp Eye Res. 92 (6), 512-520 (2011).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Aerts, J., Nys, J., Arckens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+reproducible+and+straightforward+method+to+perform+in+vivo+ocular+enucleation+in+the+mouse+after+eye+opening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A highly reproducible and straightforward method to perform in vivo ocular enucleation in the mouse after eye opening.</a> J Vis Exp. (92), e51936(2014).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+AP-2delta+reduces+retinal+ganglion+cell+numbers+and+axonal+projections+to+the+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Loss of AP-2delta reduces retinal ganglion cell numbers and axonal projections to the superior colliculus.</a> Mol Brain. 9 (1), 62(2016).</li>
<li>Moshiri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+complete+loss+of+retinal+ganglion+cells+in+the+math5%2Fbrn3b+double+knockout+elicits+severe+reductions+of+other+cell+types+during+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Near complete loss of retinal ganglion cells in the math5/brn3b double knockout elicits severe reductions of other cell types during retinal development.</a> Dev Biol. 316 (2), 214-227 (2008).</li>
<li>Danias, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+retinal+ganglion+cell+%28RGC%29+loss+in+aging+DBA%2F2NNia+glaucomatous+mice%3A+comparison+with+RGC+loss+in+aging+C57%2FBL6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (12), 5151-5162 (2003).</li>
<li>Jakobs, T. C., Ben, Y., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD15+immunoreactive+amacrine+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">CD15 immunoreactive amacrine cells in the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 465 (3), 361-371 (2003).</li>
<li>Uusitalo, M., Schlotzer-Schrehardt, U., Kivela, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+localization+of+the+HNK-1+carbohydrate+epitope+to+glial+and+neuronal+cells+of+the+human+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural localization of the HNK-1 carbohydrate epitope to glial and neuronal cells of the human retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (3), 961-964 (2003).</li>
<li>Jackson, C. J., Garbett, P. K., Nissen, B., Schrieber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+human+endothelium+to+Ulex+europaeus+I-coated+Dynabeads%3A+application+to+the+isolation+of+microvascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Binding of human endothelium to Ulex europaeus I-coated Dynabeads: application to the isolation of microvascular endothelium.</a> J Cell Sci. 96 ( Pt 2), 257-262 (1990).</li>
<li>Pennartz, S., Perraut, M., Pfrieger, F. Purification of retinal ganglion cells from postnatal rats by magnetic cell sorting. MACSmore. 12 (2), 16-18 (2010).</li>
<li>Nadal-Nicolas, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Displaced+retinal+ganglion+cells+in+albino+and+pigmented+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Displaced retinal ganglion cells in albino and pigmented rats.</a> Front Neuroanat. 8, 99(2014).</li>
<li>Nadal-Nicolas, F. M., Salinas-Navarro, M., Vidal-Sanz, M., Agudo-Barriuso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+methods+to+trace+retinal+ganglion+cells+with+fluorogold%3A+from+the+intact+optic+nerve+or+by+stereotactic+injection+into+the+optic+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Two methods to trace retinal ganglion cells with fluorogold: from the intact optic nerve or by stereotactic injection into the optic tract.</a> Exp Eye Res. 131, 12-19 (2015).</li>
<li>Barnstable, C. J., Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1+antigen%3A+a+ganglion+cell+specific+marker+in+rodent+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Thy-1 antigen: a ganglion cell specific marker in rodent retina.</a> Neuroscience. 11 (4), 847-855 (1984).</li>
<li>Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+labeling+of+retinal+ganglion+cells+by+application+of+fluoro-gold+on+the+surface+of+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont pas d&#39;intérêts financiers concurrents.

FACS est la technique de choix pour purifier les populations cellulaires. D&#39;autres méthodes d&#39;isolement comprennent l&#39;immunopanning, les perles magnétiques et l&#39;appauvrissement de la fixation du complément. L&#39;avantage de FACS par rapport à ces autres méthodes est basé sur l&#39;identification simultanée des marqueurs de surface cellulaire avec des degrés d&#39;intensité variables. L&#39;intensité fluorescente de la molécule est proportionnelle à la quantité d&#39;expression protéique. Jusqu&#39;à pré...

Les RGC sont des neurones à différenciation terminale et, par conséquent, les cellules primaires sont nécessaires à l&#39;expérimentation. Le développement d&#39;un protocole pour l&#39;isolement et l&#39;enrichissement des cellules ganglionnaires rétiniennes murines primaires (RGC) est fondamental pour révéler les mécanismes de la santé et de la dégénérescence du RGC in vitro . Ceci est particulièrement important pour les études qui cherchent à générer des thérapies potentielles pour promouvoir la fonction RGC et pour minimiser leur décès. La dégénérescence des RGC est associée à des maladies dégénératives de la rétine, telles que le glaucome, la rétinopathie diabétique et le vieillissement normal. Bien que les mécanismes cellulaires spécifiques sous-jacents à la perte de RGC ne soient pas clairs, une série de facteurs de risque ont été identifiés. Le manque d&#39;oxygénation à la tête du nerf optique 1 , 2 , 3 provoque la mort de RGC 4 et agit comme la perturbation de l&#39;homéostasie entre l&#39;activation de l&#39;excitation et iRécepteurs nhibiteurs dans les RGC individuels 5 , 6 . Une série de défis empêchent les progrès vers l&#39;utilisation de ces cellules pour des études approfondies. Tout d&#39;abord, le nombre de RGC présents dans une rétine murine est faible. Les RGC représentent moins de 1% des cellules rétiniennes totales 7 , 8 , 9 . Deuxièmement, la plupart des marqueurs spécifiques de RGC sont des protéines intracellulaires 10 , 11 , 12 . La sélection basée sur ces marqueurs laisse les cellules non viables, ce qui empêche les analyses fonctionnelles en aval. Enfin, les protocoles actuellement disponibles sont longs et manquent de standardisation 13 , 14 . Les premiers protocoles d&#39;isolement RGC étaient basés sur les méthodes d&#39;immunopanning. Barres et al. 15 Adapté l&#39;immunop classiqueEt a ajouté une deuxième étape, qui exclut les monocytes et les cellules endothéliales de l&#39;essentiel des cellules rétiniennes avant une sélection positive basée sur l&#39;immunopostivité à l&#39;antigène anti-thymocyte (aka Thy1), un marqueur de surface cellulaire. Des années plus tard, Hong et al. Techniques combinées d&#39;isolation des perles magnétiques avec des stratégies de tri cellulaire pour isoler les RGC avec une pureté supérieure 16 . L&#39;utilisation de perles magnétiques est toujours utilisée dans de nombreuses applications scientifiques. Ensemble, les perles magnétiques et les protocoles de cytométrie de flux ont amélioré la pureté des cellules isolées. Cependant, ces systèmes de purification n&#39;ont pas encore été normalisés pour l&#39;isolement des RGC murins à partir de la rétine dissociée. La cytométrie de flux est une méthode analytique puissante qui mesure les caractéristiques optiques et de fluorescence des suspensions cellulaires. Les cellules sont analysées quantitativement et qualitativement avec un niveau élevé de sensibilité, fournissant une analyse multidimensionnelle de la population cellulaireAtion. La discrimination cellulaire repose sur deux propriétés physiques principales: la taille de la cellule ou la surface et la granularité ou la complexité interne 17 . Une analyse multidimensionnelle peut être réalisée en combinant des anticorps marqués avec des fluorochromes ayant des longueurs d&#39;onde d&#39;excitation similaires et des émissions différentes. La cytométrie de flux est rapide, reproductible et sensible. Les lasers Multitpe permettent des analyses multidimensionnelles encore plus importantes de cellules simples par cytométrie de flux. Ainsi, c&#39;est une méthodologie attrayante pour l&#39;étude de spécimens cytologiques. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) utilise les différences phénotypiques multidimensionnelles identifiées par la cytométrie de flux pour trier les cellules individuelles en sous-populations distinctes. Au cours de la dernière décennie, de multiples protéines superficielles et intracellulaires ont été identifiées comme biomarqueurs potentiels pour la sélection des cellules, y compris les neurones. Les études initiales visant à isoler les RGC des rats ont utilisé Thy1 comme un ganglion celL marqueur. Malheureusement, Thy1, aka CD90, a plusieurs isoformes dans d&#39;autres espèces de rongeurs 18 , 19 , 20 et est exprimé par plusieurs types de cellules rétiniennes 19 , 20 , ce qui en fait un marqueur non spécifique pour les RGC. Un autre marqueur de surface, CD48, se trouve sur des populations monocytaires dans la rétine, y compris les macrophages et la microglie. En utilisant ces deux marqueurs de surface, une signature RGC modifiée - Thy1 + et CD48 cellules négatives - a été développée 15 , 16 , 21 , 22 . Malheureusement, ces deux critères de sélection ne suffisent pas à choisir pour une population RGC très enrichie. Pour répondre à ces besoins non satisfaits, un protocole de cytométrie de flux a été développé 23 en fonction de critères de sélection positifs et négatifs multicouches usiNg marqueurs de surface cellulaire connus pour enrichir et purifier les RGC murins primaires.

<table><tbody><tr><td>Anti-souris CD15 PE</td><td>BioLegend</td><td>125606</td><td>Clone MC-480</td></tr><tr><td>Anti-souris CD48 PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>103424</td><td>Clone HM48-1</td></tr><tr><td>Anti-souris CD57</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6680-100TST</td><td>Clone VC1.1</td></tr><tr><td>Anti-souris CD90.2 AF700</td><td>BioLegend</td><td>105320</td><td>Clone 30-H12</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 Goat Anti-souris IgG</td><td>BioLegend</td><td>405317</td><td>Clone Poly4053</td></tr><tr><td>Purifié Anti-souris CD16/32</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td>FcgRII/III block, Clone 93</td></tr><tr><td>Zombie Aqua&nbsp ;</td><td>BioLegend</td><td>423102</td><td>Discrimination des cellules vivantes/des cellules mortes</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>Origine américaine</td></tr><tr><td>AbC Kit de perles de compensation totale des anticorps</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10497</td><td>Multi-species Ig</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td>Ajouter le sérum au milieu avant la culture.</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td>Solution saline</td></tr><tr><td>Microscope de dissection Olympus</td><td></td><td>SZ-PT Modèle</td><td>Stéréomicroscope</td></tr><tr><td>Centrifugeuse Sorvall Thermo</td><td>Scientific</td><td>ST 16R</td><td>Toute la centrifugation effectuée&nbsp ; à la</td></tr><tr><td>plaque de base RT &ndash ; Plateau de dissection</td><td>Fisher Scientific</td><td>SB15233FIM</td><td>Une plaque de cire peut également être utilisée</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Aesculap</td><td>5002-7</td><td>4 &frac12 ; pouces</td></tr><tr><td>Ciseaux à iris, Droit</td><td>Aesculap</td><td>1360</td><td>5 &frac12 ; pouces</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL tubes coniques</td><td>Fisher Scientific</td><td>352097</td><td>Tubes en polypropylène</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL Tubes coniques</td><td>Fisher Scientific</td><td>352098</td><td>Tubes en polypropylène</td></tr><tr><td>BD FACS Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>352003</td><td>Tubes en polypropylène</td></tr><tr><td>Boîtes de 40 mm</td><td>MidSci</td><td>TP93040</td><td>Culture tissulaire traitée</td></tr><tr><td>70 &mu ; passoire en nylon</td><td>MidSci</td><td>70ICS</td><td>stérile</td></tr><tr><td>40 &mu ; passoire en nylon</td><td>MidSci</td><td>40ICS</td><td>stérile</td></tr><tr><td> Seringue BD 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>301604 Seringue jetable sans aiguille</td></tr><tr><td>Pestles</td><td>MidSci</td><td>PEST</td><td></td></tr> stérile <tr><td>Wheaton Vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>986734</td><td>No Liner</td></tr><tr><td>Aiguille BD 30 G</td><td>Fisher Scientific</td><td>305128</td><td>1 pouce</td></tr><tr><td>Chambre de comptage en verre Hausser Scientific Bright-Line</td><td>Fisher Scientific</td><td>0267151B</td><td>Hémocytomètre</td></tr><tr><td>Gibco Trypan blue 0,4 % Solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>Viability</td></tr><tr><td>Tubes Eppendorf</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td>1,5mL</td></tr><tr><td>EVOS Imagerie des cellules floïdes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>447113</td><td>Imagerie par fluorescence avec un objectif 20X</td></tr><tr><td>100 % éthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-452</td><td>Utilisé pour fabriquer 70 % d’éthanol</td></tr><tr><td>Pipette Pipet-Lite LTS L-1000XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014282</td><td>LTS</td></tr><tr><td>Pipette Pipet-Lite LTS L-200XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014391</td><td>LTS Pipette</td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS L-20XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td>LTS Pipette Rack LTS</td></tr><tr><td>LTS 1000 mL &ndash ; GPS-L1000S</td><td>Rainin</td><td>17005088</td><td>Blue Rack Supports d’embouts stériles</td></tr><tr><td>LTS 250 mL &ndash ; GPS-L250S</td><td>Rainin</td><td>17005092</td><td>Green Rack Supports d’embouts stériles</td></tr><tr><td>LTS 20 mL &ndash ; GPS-L10S</td><td>Rainin</td><td>17005090</td><td>Red Rack Pointes stériles</td></tr><tr><td>FACSAria II Trieur de cellules</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>Commande personnalisée</td></tr><tr><td>LSR II Cytomètre</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>Commande personnalisée</td></tr><tr><td>Abca8a</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00462440_m1</td><td>M&uuml ; ller cells</td></tr><tr><td>Aldh1al</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00657317_m1</td><td>M&uuml ; cellules ller</td></tr><tr><td>Aqp4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00802131_m1</td><td>Astrocytes</td></tr><tr><td>Calb2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00801461_m1</td><td>Amacrine, Horizontal</td></tr><tr><td>Cd68Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>Mm03047340_m1</td><td>Cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes</td></tr><tr><td>Gad2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00484623_m1</td><td>Amacrine</td></tr><tr><td>Hprt</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01545399_m1</td><td>Ménage gene</td></tr><tr><td>Lhx1Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>Mm01297482_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Lim2Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>Mm00624623_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Nrl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00476550_m1</td><td>Photorécepteurs</td></tr><tr><td>Ntrk1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01219406_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Pcp4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00500973_m1</td><td>Bipolaire, Amacrine</td></tr><tr><td>Pou4f1Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>Mm02343791_m1</td><td>Cellules</td></tr> <tr>ganglionnaires rétiniennes<td>Prdx6</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00725435_s1</td><td>Astrocytes</td></tr><tr><td>Prkca</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00440858_m1</td><td>Bipolaire</td></tr><tr><td>Prox1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00435969_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Pvalb</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00443100_m1</td><td>Amacrine</td></tr><tr><td>Rbpms</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm02343791_m1</td><td>Cellules ganglionnaires rétiniennes</td></tr><tr><td>Rom1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00436364_g1</td><td>Photorécepteurs</td></tr><tr><td>Rpe65</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00504133_m1</td><td>Cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes</td></tr><tr><td>Slc1a3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00600697_m1</td><td>Astrocytes</td></tr><tr><td>Slc6a9</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00433662_m1</td><td>Amacrine</td></tr><tr><td>SncgThermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>Mm00488345_m1</td><td>Cellules ganglionnaires rétiniennes</td></tr><tr><td>Tubb3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00727586_s1</td><td>Cellules ganglionnaires rétiniennes</td></tr><tr><td>Vim</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01333430_m1</td><td>M&uuml ; cellules ller</td></tr><tr><td>Taqman Universal Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4440047</td><td>qPCR Réactif</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>Isolation de l’ARN</td></tr><tr><td>SuperScript VILO Kit de synthèse d’ADNc</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11754250</td><td>Synthèse d’ADNc</td></tr><tr><td>Taqman PreAmp Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4391128</td><td>Étape de préamplification</td></tr><tr><td>BD Cytofix/ Cytoperm</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>Tampon de fixation/ perméabilisation</td></tr><tr><td>BD Perm/ Wash</td><td>BD Biosciences</td><td>554723</td><td>Solution de perméabilisation</td></tr><tr><td>RBPMS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-86815</td><td>Anticorps intracellulaire</td></tr><tr><td>SNCG</td><td>Gene Tex</td><td>GTX110483</td><td>Anticorps intracellulaire</td></tr><tr><td>BRN3A</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-8429</td><td>Anticorps intracellulaire</td></tr><tr><td>TUJ1</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td>anticorps intracellulaire</td></tr></tbody></table>

isolement des cellules de ganglion rétiniennes murines primaires (rgc) par cytométrie de flux

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Les maladies neurodégénératives ont souvent un impact dévastateur sur les personnes touchées. La perte de cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC) est impliquée dans une série de maladies, y compris la rétinopathie diabétique et le glaucome, en plus du vieillissement normal. Malgré leur importance, les RGC ont été extrêmement difficiles à étudier jusqu&#39;à maintenant en raison en partie du fait qu&#39;ils ne comprennent qu&#39;un faible pourcentage de la grande variété de cellules de la rétine. En outre, les méthodes d&#39;isolement actuelles utilisent des marqueurs intracellulaires pour identifier les RGC, qui produisent des cellules non viables. Ces techniques impliquent également de longs protocoles d&#39;isolement, de sorte qu&#39;il existe un manque de méthodes pratiques, normalisées et fiables pour obtenir et isoler les RGC. Ce travail décrit une méthode efficace, complète et fiable pour isoler les RGC primaires des rétines de souris en utilisant un protocole basé sur des critères de sélection positifs et négatifs. Les méthodes présentées permettent l&#39;étude future des RGC, dans le but de mieux comprendre les grandsDéclin de l&#39;acuité visuelle résultant de la perte de RGC fonctionnels dans les maladies neurodégénératives.

<html> L&#39;étude approfondie des RGC est entravée par de nombreux facteurs, y compris leur faible fréquence et l&#39;absence d&#39;une méthodologie robuste et standardisée pour leur isolement. La figure 1 montre la méthodologie utilisée pour l&#39;isolement des rétines. Les variations de la procédure d&#39;énucléation existent en fonction du type d&#39;analyse, comme si l&#39;énucléation fait partie de l&#39;expérimentation in vivo <sup class="xref...

Des millions de personnes souffrent de maladies dégénératives de la rétine qui entraînent une cécité irréversible. Un élément commun de nombreuses de ces maladies est la perte de cellules ganglionnaires de la rétine (RGC). Ce protocole détaillé décrit l&#39;isolement des RGC murins primaires par sélection positive et négative avec cytométrie de flux.

Isolement des cellules de ganglion rétiniennes murines primaires (RGC) par cytométrie de flux

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler une population homogène enrichie de cellules ganglionnaires rétiniennes primaires murines. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans le domaine des cellules ganglionnaires rétiniennes concernant les mécanismes sous-jacents à la baisse de l'acuité visuelle chez les populations âgées et chez celles atteintes de maladies dégénératives de la rétine. Le principal avantage de cette technique est qu'elle peut offrir un protocole rapide, visible, reproductible et standardisé pour l'isolement de cellules ganglionnaires rétiniennes primaires murines enrichies.Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode lorsque Sumana Chintalapudi, qui était alors étudiante diplômante dans mon laboratoire et première auteure de cette étude, a présenté lors de notre club de lecture un article de 2013 par Krishna Murtheadol, dont l'étude démontrait clairement que la lignée cellulaire RGC cinq, initialement créée comme une lignée de cellules ganglionnaires rétiniennes de rat immortalisées, n'était plus d'origine rat et ne possédait pas non plus le phénotype RGC. Il est devenu évident pour nous que ce problème laissait un grand vide dans les ressources disponibles pour la communauté de recherche en vision, y compris pour notre propre laboratoire. Sumana et moi avons contacté le Dr Morales-Tirado et, ensemble, nous avons mis au point une nouvelle méthode permettant d'isoler des cellules ganglionnaires rétiniennes vivantes et fortement enrichies.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car les objectifs de cette méthode consistent à isoler une population cellulaire vivante et fortement enrichie pouvant être cultivée soit comme cellules primaires, soit immortalisée en une lignée cellulaire. Pour cette raison, il est essentiel de faire très attention à ne pas endommager les cellules que l'on cherche à isoler. En outre, les paramètres de la méthode de tri cellulaire doivent être adaptés aux cellules spécifiques que l'on tente d'isoler.Les deux méthodes nécessitent des compétences particulières. Les procédures seront démontrées par le Dr Xiang Di Wang, chercheur associé du laboratoire du Dr Jablonski, et par M. Zach Goldsmith, doctorant de mon laboratoire. Pour énucléer l'œil, insérez d'abord une pince sous le globe oculaire.Agripper le nerf optique et tirer vers le haut. Le globe sera énucléé avec le nerf optique intact. Placer l'œil dans un flacon de PBS sur de la glace, puis énucléer l'autre œil.Lorsque tous les yeux ont été collectés, placez un œil dans une boîte de Pétri contenant du PBS frais sous un microscope de dissection, puis utilisez une pince pour saisir délicatement le globe oculaire à la base du nerf optique. À l’aide d’une aiguille fine de calibre 30, percez la cornée afin de permettre l’écoulement de l’humeur aqueuse, ce qui facilite la manipulation de l’œil avec la pince. En tenant la cornée avec la pince, utilisez des ciseaux pour pratiquer une petite incision dans le tissu cornéen, puis retirez délicatement la cornée et la sclère à l’aide de la pince.Lorsque le globe oculaire est épluché à moitié, utiliser la pince pour dérouler la rétine et le cristallin. Placer la rétine dans une petite boîte de Pétri de 40 millimètres contenant du PBS et 1 % de FPS dans une hotte de sécurité biologique, puis laver la rétine trois fois dans du PBS frais additionné de FBS pour chaque lavage. Une fois que tous les yeux ont été lavés, placer jusqu'à 12 rétines sur un tamis stérile en nylon de 70 microns humidifié avec du PBS et du FBS, puis macérer doucement les rétines à l’aide de l’extrémité arrière du piston d’une seringue de 10 millilitres, en effectuant un mouvement circulaire.Lorsque toutes les cellules ont été dissociées, placer le filtre au-dessus d'un tube de collecte en polypropylène et utiliser une pipette P1000 pour faire passer les cellules à travers le filtre dans le tube de collecte. Rincer le filtre avec du PBS et du FBS, en récupérant la solution de rinçage dans le tube de collecte. Ajouter suffisamment de PBS complété avec du FBS afin d'obtenir un volume final de un millilitre de solution par rétine, puis recueillir les cellules par centrifugation.Ensuite, resuspendre le culot dans du PBS supplémenté de FBS à raison d'un millilitre de milieu par cinq rétines, si le marquage immunologique doit être effectué immédiatement. Sinon, incuber les cellules resuspendues dans un milieu pour cellules neuronales toute la nuit à quatre degrés Celsius en position horizontale. Pour marquer immunologiquement les cellules rétiniennes, centrifuger la suspension de cellules rétiniennes et resuspendre le culot dans 50 microlitres de PBS frais supplémenté de FBS dans un tube fax.Mettons de côté cinq fois 10 à la puissance six cellules pour le témoin négatif non marqué. Ensuite, bloquons toute liaison non spécifique aux récepteurs Fc dans chaque tube à l’aide d’un microlitre d’anticorps anti-CD16/32 de souris par 1 × 10⁶ cellules, pendant 10 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation de blocage, ajoutons le cocktail d’anticorps d’intérêt aux cellules par pipetage doux, puis incubons pendant 30 minutes sur de la glace, à l’abri de la lumière.Ensuite, laver les cellules deux fois dans un volume final de 1 litre de PBS et de FBS. Marquer les cellules avec un anticorps secondaire approprié pendant encore 30 minutes sur de la glace, à l'abri de la lumière, puis effectuer deux lavages dans du PBS additionné de FBS comme vient d'être montré. Resuspendre les culots dans du PBS et du FBS frais pour le comptage des cellules.Pour ajuster la compensation, ajoutez trois gouttes de microsphères de polystyrène dans un tube stérile par florafors et un microgramme du florafors respectif dans chaque tube. Incubez les microsphères pendant 15 minutes à température ambiante, à l'abri de la lumière. Lavez ensuite les microsphères avec trois millilitres de PBS et de SBF, puis retirez soigneusement le surnageant.Resuspendre les pastilles de microsphères dans 250 microlitres de PBS et de SFB, puis charger l'échantillon non étiqueté dans le tube sur le cytomètre en flux. Dans le logiciel du cytomètre en flux, sélectionner l'expérience, configurer la compensation et créer les témoins de compensation. Ajouter les témoins spécifiques florafor à partir de la liste affichée, puis cliquer sur OK. Vérifier la lumière dispersée vers l'avant et la lumière dispersée latérale, puis délimiter la population initiale.Ensuite, installer le tube témoin négatif sur le cytomètre et cliquer sur charger. Vérifier que la population d'intérêt ou P1 est affichée, puis sélectionner la population. Faire un clic droit sur la fenêtre P1 et sélectionner calculer la compensation.Ensuite, cliquez sur enregistrer les données. Une fois l'enregistrement terminé, cliquez sur décharger pour retirer le tube, puis chargez le tube témoin suivant afin de régler les contrôles de compensation. Lorsque tous les échantillons témoins ont été enregistrés, créez un graphique de diffusion avant en fonction de la diffusion latérale pour le premier tube expérimental, puis délimitez la population P1.Ensuite, ouvrez un graphique en pseudo-couleurs de la hauteur de la diffusion latérale en fonction de la largeur de la diffusion latérale et sélectionnez les cellules uniques. À partir des cellules uniques, créez un graphique de la hauteur de la diffusion avant en fonction de la largeur de la diffusion avant, puis sélectionnez pour exclure les doublets. Ensuite, générez un graphique en pseudo-couleurs de CD48 en fonction de CD90.2 et sélectionnez les cellules CD90.2 positives et CD48 négatives afin d'éliminer les monocytes, suivi d'un graphique en pseudo-couleurs de CD57 en fonction de CD15 pour éliminer d'éventuels contaminants de cellules amacrines.Définissez maintenant les populations à collecter pour l'échantillon dans la feuille de configuration du tri, puis triez les cellules. À la fin du tri, utilisez un aliquot de cellules égal à 2,5 fois 10 à la puissance 4 pour confirmer la pureté de la population cellulaire isolée. Après avoir passé les rétines dans le tamis cellulaire, plusieurs cellules de la couche rétinienne interne peuvent être visualisées, même si les cellules ganglionnaires rétiniennes ont perdu leur morphologie caractéristique en raison de l'axotomie survenue pendant la procédure d'isolement cellulaire.Le phénotype classique de coloration positive pour CD48 et négative pour la surface n'est pas suffisant pour identifier et isoler les cellules ganglionnaires rétiniennes murines, car ces cellules expriment des gènes associés aux cellules amacrines, de Müller, bipolaires, horizontales, photoréceptrices et épithéliales pigmentaires rétiniennes. Les cellules triées expriment également des marqueurs intracellulaires associés aux cellules ganglionnaires rétiniennes, tels que la synucléine gamma, BRN3A, TUJ1 et RBPMS, dont la localisation intracellulaire est davantage confirmée par la cytométrie de flux d'imagerie. Certaines des cellules triées commencent même à présenter une morphologie de cellules ganglionnaires rétiniennes après une culture cellulaire in vitro.En outre, l'analyse par PCR quantitative de la population cellulaire triée fortement enrichie révèle un accroissement de plusieurs ordres de grandeur des gènes codant pour des marqueurs intracellulaires spécifiques des cellules ganglionnaires rétiniennes. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de six heures si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder la suspension cellulaire stérile, de bloquer les récepteurs FC présents dans la suspension cellulaire, d'éviter la liaison non spécifique des anticorps, et de discuter avec l'opérateur du trieur cellulaire des détails ou de la stratégie de tri cellulaire.Après cette procédure, d'autres méthodes comme la PCR quantitative peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant le profilage de l'expression génique. N'oubliez pas que l'utilisation d'équipements spécialisés, tels qu'un trieur cellulaire, nécessite un opérateur hautement qualifié. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la vision pour mieux comprendre les mécanismes de survie et de mort des cellules ganglionnaires de la rétine, dans le but de développer de nouveaux traitements visant à préserver la vision.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler une population homogène enrichie de cellules ganglionnaires rétiniennes primaires de souris.

isolation-primary-murine-retinal-ganglion-cells-rgcs-flow

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Cet article fournit une description de la manière de disséquer et d'enregistrer à partir de la préparation isolée de la rétine chez la souris. En particulier, nous décrivons comment enregistrer les réponses de lumière provenant d'une population de cellules ganglionnaires marqués par fluorescence et par la suite identifier et d'analyser sa morphologie.

Une préparation isolée rétinienne pour enregistrer la réponse de Lumière génétiquement marqués cellules ganglionnaires rétiniennes

Cette vidéo montre la procédure d’isolement des cellules ganglionnaires primaires de la rétine (CGR) murines à l’aide de la cytométrie en flux. Cette méthode permet l’étude future des CGR, dans le but de mieux comprendre le déclin majeur de l’acuité visuelle qui résulte de la perte des CGR fonctionnels dans les maladies neurodégénératives.

Isolement de cellules ganglionnaires rétiniennes murines à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence

Source : Laboissonnière, et. al. Séquençage de l’ARN unicellulaire de sous-ensembles définis de cellules ganglionnaires rétiniennes. J. Vis. exp. (2017).  Cette vidéo présente une technique de traçage par fluorescence pour identifier les sous-types de cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) dans une rétine de souris transgénique. Le processus consiste à fixer la rétine isolée dans une chambre d’enregistrement, à maintenir la viabilité cellulaire grâce à une perfusion oxygénée et à cibler les...

Identification de sous-types de cellules ganglionnaires rétiniennes de souris par traçage fluorescent

phagocytose microgliale est essentiel pour le maintien de l'homéostasie tissulaire et la fonction phagocytaire insuffisante a été impliquée dans la pathologie. Cependant, l' évaluation de la fonction microglies in vivo est techniquement difficile. Nous avons mis au point une technique simple mais robuste pour surveiller et quantifier le potentiel phagocytaire de la microglie dans un cadre physiologique précisément.

Évaluation Retinal microglial phagocytaire Fonction<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;utilisation d&#39;un test basé sur la cytométrie de flux

Ici, nous présentons une approche combinatoire pour classer les types de cellules neuronales avant l'isolement et pour la caractérisation ultérieure des transcriptomes monocellulaires. Ce protocole optimise la préparation d'échantillons pour un séquençage d'ARN réussi (RNA-Seq) et décrit une méthodologie conçue spécifiquement pour une meilleure compréhension de la diversité cellulaire.

L&#39;ARN monocellulaire-séquentiel des sous-ensembles définis des cellules ganglionnaires rétiniennes

Ce protocole présente deux techniques pour isoler les compartiments subcellulaires des photorécepteurs de bâtonnets murins pour l’analyse des protéines. La première méthode utilise de la rétine vivante et du papier filtre de cellulose pour séparer les segments extérieurs des tiges, tandis que la seconde utilise de la rétine lyophilisée et du ruban adhésif pour décoller les couches internes et externes des segments.

Deux méthodes de peeling pour l’isolement des compartiments des cellules photoréceptrices dans la rétine de la souris pour l’analyse des protéines

Ce protocole décrit une méthode d’isolement des cellules endothéliales rétiniennes postnatales murines optimisées pour le rendement, la pureté et la viabilité cellulaires. Ces cellules conviennent aux approches de séquençage de nouvelle génération.

Isolement de cellules endothéliales rétiniennes murines pour le séquençage de nouvelle génération

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour isoler les cellules gliales rétiniennes de Müller des yeux de souris. Le protocole commence par l’énucléation et la dissection des yeux de souris, suivies de l’isolement, de l’ensemencement et de la culture des cellules de Müller.

Isolement de cellules gliales gliales rétiniennes primaires de souris

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) agit comme une barrière cruciale entre la choroïde et la rétine, favorisant la santé et la fonction des types de cellules rétiniennes, telles que les photorécepteurs. Nous décrivons ici un protocole simple et efficace pour isoler et cultiver l’EPR murin adulte.

Méthode simplifiée d’isolement et de culture de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes de souris adultes

Ce protocole décrit la procédure d’isolement de la rétine de souris et d’immunomarquage pour marquer toutes les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR). Le processus est suivi d’une imagerie et d’un comptage automatique des CGR à l’aide d’un logiciel basé sur l’IA, offrant une méthode simple, rapide et précise pour quantifier les CGR dans l’ensemble de la rétine de la souris.

Immunocoloration intégrale et comptage automatique des cellules ganglionnaires rétiniennes de souris

Cet article présente un protocole détaillé pour isoler les cellules primaires de Müller de la rétine chez le rat Sprague-Dawley (SD) néonatal. La procédure comprend l’énucléation des globes oculaires, la dissection du tissu rétinien, l’extraction et l’identification des cellules, ainsi que des considérations clés pour la culture cellulaire ultérieure.

Isolement et culture de cellules primaires de Müller rétiniennes chez des rats Sprague-Dawley (SD)

Découvrez l'isolement de cellules de ganglion rétiniennes murines primaires par cytométrie de flux. Cette méthode standardisée permet d'obtenir une population enrichie de RGCs vivantes pour étudier les mécanismes de dégénérescence rétinienne.

Isolement des cellules de ganglion rétiniennes murines primaires (RGC) par cytométrie de flux

Explorer plus de vidéos