Quantification de la densité de branchement dans les boîtes entières de glandes mammaires de rat utilisant la méthode d'analyse Sholl

L'objectif général de cette méthode assistée par ordinateur est de quantifier de manière objective la densité des ramifications et la décroissance des ramifications du glande mammaire, deux indicateurs de développement importants chez les rongeurs, en appliquant une analyse de Sholl modifiée à des images de montages complets du glande mammaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans le domaine de la biologie du glande mammaire, telles que la manière dont l'exposition à des produits chimiques peut modifier le développement du glande mammaire. Le principal avantage de cette technique réside dans son utilisation d'un logiciel libre permettant de quantifier de façon objective des caractéristiques fondamentales du développement du glande mammaire.

Pour cette procédure, munissez-vous d'images de montages entiers montrant l'épithélium glandulaire à un grossissement fixe. Commencez par ouvrir une image dans ImageJ. Ensuite, sélectionnez l'outil de tracé à main levée.

Tracer l'épithélium glandulaire et effacer la zone environnante. Ensuite, tracer le ganglion lymphatique et supprimer cette partie de l'image à l'aide de la commande de découpe. Si l'arrière-plan de l'image est noir, il doit être converti en blanc.

Cliquez sur Éditer, puis sur Options, puis sur Couleurs. Dans la boîte de dialogue, sélectionnez blanc dans le menu déroulant des options d'arrière-plan. Bien que l'arrière-plan puisse rester noir, il sera traité comme blanc lors du traitement de l'image.

Maintenant, séparez les canaux de couleur en trois images en niveaux de gris de huit bits. Ensuite, sélectionnez le canal offrant le meilleur contraste, généralement le canal bleu. Soustrayez ensuite le fond du canal de couleur sélectionné.

Ensuite, procédez à la sélection des paramètres souhaités et prévisualisez les modifications. Cochez l'option d'arrière-plan clair et prévisualisez dans la boîte de dialogue, puis ajustez le nombre de pixels jusqu'à l'obtention du contraste souhaité. Si un contraste supplémentaire est nécessaire, utilisez l'option Masque flou.

Vérifiez l'aperçu dans la boîte de dialogue et ajustez le rayon de pixel et le poids du masque jusqu'à l'obtention du contraste souhaité. Après avoir appliqué le filtre de masque de netteté, supprimez la bordure créée par le filtre. Cliquez sur le bouton de double flèche rouge dans la barre d'outils et sélectionnez Outils de dessin.

Ensuite, sélectionnez l'outil de gomme. Ajustez son diamètre en cliquant avec le bouton droit sur le bouton de l'outil de gomme, puis maintenez enfoncé le bouton gauche de la souris pour effacer la bordure. Un seul niveau d'annulation est autorisé pendant l'effacement, faites donc attention.

Après avoir appliqué l'un des filtres, supprimez manuellement le bruit restant. Reportez-vous à une copie de l'image d'origine et supprimez le bruit identifié en cliquant d'abord sur le bouton de la double flèche rouge dans la barre d'outils, puis en sélectionnant les outils de dessin. Ensuite, choisissez l'outil gomme.

Réglez son diamètre en cliquant avec le bouton droit sur le bouton de l'outil de gomme. Ensuite, maintenez enfoncé le bouton gauche de la souris pour effacer le bruit. Une seule annulation est autorisée lors de l'effacement, faites donc attention.

Ensuite, ajustez le seuil de l'image. Déplacez les curseurs pour régler les valeurs minimales et maximales du seuil afin d'améliorer l'image de la glande. Cliquez ensuite sur Appliquer.

Supprimez automatiquement le bruit supplémentaire en utilisant l'une des deux méthodes. La première option consiste à utiliser la commande de suppression des taches. La deuxième option consiste à utiliser la commande de suppression des valeurs aberrantes.

Ce processus remplace un pixel par la médiane de son voisinage immédiat uniquement si le pixel s'écarte de la médiane de plus d'une valeur seuil définie par l'utilisateur. À présent, en utilisant l'image d'origine comme référence, reconstruisez les parties de l'épithélium glandulaire qui ont été supprimées par seuil et élimination du bruit. Lors de la reconstruction de l'image, veillez à procéder avec soin et de manière minimale afin de préserver l'intégrité de l'image.

Sélectionnez l'outil aérographe parmi les outils de dessin. Cliquez avec le bouton droit sur le bouton de l'outil aérographe pour régler sa taille, puis remplissez soigneusement les sections manquantes de la glande à l'aide du bouton gauche de la souris. Ensuite, créez une image esquélétisée de la glande destinée à l'analyse de Sholl.

Tout d'abord, convertir l'image en format binaire. Ensuite, effectuer l'élagage de l'image. Cette opération supprime de façon répétée les pixels situés sur les bords de l'image binaire jusqu'à ce qu'elle soit réduite à une forme d'un seul pixel de largeur.

Maintenant, dilatez l'image une fois pour fermer les espaces créés par le seuillage et le squelettage. Ensuite, enregistrez l'image sous un nouveau fichier à l'aide de la commande « enregistrer sous ». Enfin, vérifiez la précision de l'image squelette par rapport à l'originale en superposant les deux images.

Dans la boîte de dialogue d'ajout d'image, sélectionnez l'image du squelette et réglez son opacité à 30 %. Ensuite, enregistrez la superposition sous forme d'une nouvelle image pour référence ultérieure. Pour commencer, ouvrez une image du squelette et convertissez l'image en format binaire. Définissez maintenant l'échelle de l'image.

Saisissez le nombre de pixels par millimètre, puis réglez à la fois la distance connue et le rapport d'aspect des pixels à un, ensuite indiquez les millimètres comme unité de longueur et activez l'option globale pour appliquer l'échelle à toutes les images. Ensuite, déterminez le rayon final pour l'analyse de Sholl à l'aide de l'outil de dessin de ligne. Tracez une ligne depuis le début du canal principal jusqu'au point le plus distal de l'épithélium glandulaire.

Ensuite, appuyez sur la touche M et la distance de la ligne sera indiquée. Saisissez maintenant les paramètres pour l'analyse de Sholl. Tout d'abord, sélectionnez les options dans la section définition des couches, réglez le rayon initial à 0,00 millimètre et définissez l'incrément de rayon à 0,1 millimètre.

Définissez le nombre d'échantillons à un. La longueur de la ligne venant d'être tracée est automatiquement saisie dans le champ du rayon final. Pour les options de plusieurs échantillons par rayon, choisissez la moyenne pour l'intégration.

Pour les descripteurs et les options d'ajustement courbe, réglez la limite du rayon englobant à un. Choisissez déduire du rayon initial pour le nombre de branches primaires, puis sélectionnez les options de degré d'ajustement linéaire et optimal. Ensuite, dans profils sans normalisation, sélectionnez le plus informatif.

À présent, dans la section méthodes de Sholl, choisissez « aire » pour le profil normalisé. Enfin, dans la section sortie, sélectionnez « créer un masque d'intersections » afin de générer une carte thermique des intersections. Ouvrez ensuite une fenêtre de prévisualisation de l'image avec les anneaux et confirmez la zone d'analyse.

Si tout semble correct, cliquez sur « OK » pour exécuter l'analyse. L'exécution de l'analyse créera une fenêtre linéaire de profil sholl, une fenêtre semi-logarithmique de profil sholl, une fenêtre de résultats sholl, contenant toutes les valeurs de sortie sholl, et une fenêtre de fichiers nommée « profils sholl », qui indique le nombre d'intersections à chaque rayon déterminé par le polynôme. Pour mesurer la MEA, travaillez à partir de l'image du squelette de la glande dans ImageJ.

Ouvrez l'outil polygone et dessinez un polygone autour du périmètre de la glande. Utilisez des clics de souris pour ajouter des segments de ligne. Une fois toute la zone épithéliale contournée, double-cliquez pour fermer le polygone.

Ensuite, appuyez sur la touche M pour ouvrir une fenêtre de résultats. La valeur dans la colonne surface correspond à la MEA. Si l'épithélium glandulaire s'étend au-delà du ganglion lymphatique, soustrayez la surface du ganglion lymphatique de la MEA lors du calcul de la densité de ramification.

La zone du ganglion lymphatique peut être mesurée de la même manière que la MEA. À l’aide des méthodes décrites, deux groupes de rats appariés par âge ont été analysés. Les animaux du groupe B ont reçu un produit chimique connu pour provoquer un développement précoce de la glande mammaire.

La représentation du nombre d'intersections des branches le long du rayon de la glande illustre la variation des résultats. Les résultats de l'analyse de Sholl ont révélé une différence nette dans le nombre moyen d'intersections entre les groupes. Toutefois, les données d'intersection doivent être normalisées par rapport à la surface de la glande mammaire afin de tirer des conclusions.

L'analyse de Sholl et les mesures de la surface épithéliale du gland mammaire fournissent deux paramètres physiologiques utiles pour effectuer une analyse comparative. Il est clair que la taille des glandes était beaucoup plus importante dans le groupe traité. L'analyse de Sholl renvoie la valeur de Sum N, qui est utilisée pour calculer la densité de ramification et la valeur de k.

Dans le groupe traité, la densité moyenne de ramification plus élevée et la valeur moyenne inférieure de k, qui reflète un taux de décroissance de la ramification plus faible, indiquent que les animaux traités présentaient des glandes plus développées que les animaux non traités. Lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel de garder à l'esprit que l'élimination du bruit constitue l'étape la plus cruciale. Enlever trop ou trop peu peut compromettre l'intégrité de la glande et fausser les résultats.

Lorsque l'on utilise cette méthode, il est important de commencer avec un bourgeon mammaire entier propre. Une image squelettisée précise ne peut être obtenue s'il existe des imperfections, telles que des déchirures ou des plis. La création d'une image squelettisée précise demande de la patience et de la pratique.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 15 à 20 minutes par glande analysée si elle est effectuée correctement.