Name: Automatisée des protocoles de cristallisation macromoléculaire au laboratoire de biologie moléculaire MRC (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Découvrez les protocoles automatisés de cristallisation macromoléculaire pour la biologie structurale. Ces méthodes permettent de préparer jusqu'à 1 920 expériences de diffusion de vapeur en gouttelettes nanolitriques avec une intervention manuelle minimale.

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L’installation de cristallisation des MRC-LMB est pris en charge par le Medical Research Council (RU). Nous remercions les membres de la LMB pour leur soutien : Olga Perisic (PNAC), Tony Warne, Fusinita Van den Ent et Pat Edwards (études structurales), Steve Scotcher et les autres membres de l’atelier mécanique, Neil Grant et Jo Westmoreland (aides visuelles), Paul Hart et Tom Pratt (IT). Nous tenons également à remercier Steve Elliot (Tecan, UK), Mitchell Stuart et Heather Ringrose (Hamilton Robotics, UK), Paul Thaw, Robert Lewis et Joby Jenkins (TTP Labtech, UK), Paul Reardon (Swissci AG, Suisse), George Stephens et Donald Ogg (Alphabiotech, UK), Neil Williams (Markem Imaje, UK) et Graham Harris (l’Agence de Cleveland) pour l’aide technique.

1. les deux systèmes (présélection) entièrement automatisés
<ol><li>
Système 1 : préparation des plaques de 96 puits cristallisation 72 rempli de dépistage kits (plaques LMB)
	<ol>
<li>Avant d’effectuer la procédure, faire en sorte que les robots du système sont initialisées et leur logiciel de contrôle est ouvert. Allumez le refroidisseur du transporteur tube refroidissement environ 30 minutes avant le programme principal sera lancé.</li>
		<li>Placez une plaque d’essai sur le support motorisé de SBS de l’adhésif. Exécutez le film adhésif et vérifiez que le film est correctement appliqué. Répéter ce test deux fois plus que le film adhésif est prêt.</li>
		<li>Puis, ajoutez 20 L d’eau déionisée au conteneur principal du gestionnaire liquid. Débrancher les inserts de couplage du petit récipient (20 % d’éthanol solution de rinçage) et les inserts au conteneur principal.</li>
		<li>Entrez le nom d’écran approprié (tableau 1) sur l’écran tactile l’imprimante jet d’encre. Ensuite, ouvrez et fermez la porte du carrousel pour déclencher la rotation du carrousel. Ouvrir la porte lorsque la première pile se présente.</li>
		<li>Charger complètement la première pile avec 22 plaques de cristallisation, chacune avec revêtement de colonne 1 dehors. Charger complètement les deux cheminées de la même manière.</li>
		<li>Charger les 6 plaques restants dans les postes les plus élevés de la quatrième pile. Ensuite, fermez la porte du carrousel.</li>
		<li>Vérifier que le refroidisseur affiche 14 ° C. Doucement et à plusieurs reprises il faut inverser les kits de dépistage sélectionnée pendant 1 minute. Ensuite, ouvrez le panneau avant du gestionnaire liquid.</li>
		<li>Ouvrir les tubes et les placer dans le support de refroidissement selon la norme-cadre 96 puits (A1, A2, etc.). À placer chaque tube dans le porte-bébé, placer le couvercle sur un plateau dans la même disposition de 96 puits.</li>
		<li>Recouper le tube positions et faire en sorte que tous les tubes sont de niveau et se sont installés dans le porte-bébé. Ensuite, fermez le panneau avant.</li>
		<li>Dans la fenêtre de « Démarrage » du logiciel gestionnaire liquide, sélectionnez « Run maintenance » et ouvrez le programme rinçage. Exécutez le programme afin d’éliminer l’éthanol de 20 % du système et pour laver les surfaces extérieures des conseils de distribution de liquides.</li>
		<li>Lorsque le rinçage est terminé, cliquez sur « Annuler » pour revenir au « Démarrage ». Sélectionnez « Exécuter un processus existant » et cliquez sur « Démarrer votre sélection ». Ouvrez le programme « MRC kit distribution ». Renseignez '18' pour « Instances » dans la configuration de l’écran et lancez le programme.</li>
		<li>Surveiller le système comme les quatre premières plaques sont étiquetés, remplis et scellés.</li>
		<li>Une fois que toutes les 72 plaques ont été élaborés et placés dans le carrousel, placez-vous dans les inserts de couplage du conteneur principal le petit récipient. Exécutez le programme « Start up flush » (voir étape 1.1.10).</li>
		<li>Éteindre le refroidisseur et jeter le vide des tubes de trousse de dépistage. Retirez soigneusement les 72 plaques préparées au carrousel. Jeter les plaques remplies de manière incorrecte ou mal scellés. Stocker les plaques prêtes à l’emploi à 10 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Système 2 : mise en place des gouttelettes de cristallisation (protéine de nL 100 + 100 nL condition) d’un seul échantillon dans 20 plaques LMB
	<ol>
<li>Tout d’abord, veiller à ce que les robots du système sont sur le distributeur nanolitre est initialisé avec son logiciel ouvert et gestionnaire de méthode du gestionnaire liquide est ouvert. Allumez le transporteur microtube-refroidissement environ 15 minutes avant le programme principal sera lancé.</li>
		<li>Placez une plaque d’essai sur le support motorisé de SBS de l’adhésif. Exécuter le film adhésif et vérifier que la plaque est bien scellée. Tester le film adhésif trois fois.</li>
		<li>Ensuite, exécutez le distributeur nanolitres pour définir 100-nL gouttes de solution d’essai dans une coupelle. Vérifier au microscope que les gouttelettes sont correctement définies. Fermez le logiciel de distributeur nanolitre et retirer le bloc de porte-bande depuis le pont.</li>
		<li>Ensuite, insérer dans le support de plaque personnalisée (voir Résultats représentant: cristallisation dispositifs mis au point à la LMB) la plaque de la LMB avec la plus grande quantité relative des réactifs instables dans ses conditions (tableau 1). Retirer la pellicule adhésive de la plaque.</li>
		<li>Ouvrir le panneau avant du gestionnaire liquide et placer la plaque non scellée sur le pont, à l’arrière du premier transporteur coulissant (glissement de transporteurs peut être retiré pour faciliter l’accès).</li>
		<li>Couvrir la plaque avec un couvercle en aluminium SBS. Régler le couvercle vers le coin arrière gauche du transporteur en appliquant une légère pression jusqu'à l’angle opposé du couvercle.</li>
		<li>Desceller, charger dans les transporteurs coulissants et recouvrir les 19 plaques restants de la même façon, travaillant de plus à des conditions moins volatiles. Une fois que le transporteur microtube-refroidissement est à 4 ° C, comme indiqué par une lumière verte, enlevez le couvercle.</li>
		<li>Coupez le couvercle d’un microtube contenant (au moins) 440 µL de l’échantillon de protéine (tableau 2). S’assurer que l’échantillon a sans mousse au-dessus du ménisque, comme cela n’interférera pas avec le système de détection de liquide. Placer le tube dans la Position 1 du transporteur microtube-refroidissement.</li>
		<li>Posez une plaque PCR sur le pont de gestionnaire liquide devant le transporteur adaptateur plaque de terrassement. Ensuite, fermez le panneau avant.</li>
		<li>Après avoir chargé le pont, faire en sorte que le pont de distributeur nanolitre est clair du bloc porte-bande et que les transporteurs à l’arrière les piles d’extrémité 50 µL sont claires des couvercles en aluminium SBS.</li>
		<li>Dans l’interface de « Gestion de la méthode » gestionnaire liquide, sélectionnez « Setup plaques ». Surveiller l’initialisation des deux systèmes, puis renseignez les paramètres d’exécution. Suivez les indications de l’interface de gestion de la méthode (invites, figures et un système de gestion de pointe aide à la préparation).</li>
		<li>Vérifiez que tous les requis de composants sont prêts et puis démarrez le processus.</li>
		<li>Surveiller le système comme le distributeur nanolitres définit les gouttes dans la première plaque et le film adhésif joints par la suite la plaque.</li>
		<li>Une fois que toutes les plaques de 20 ont été élaborés avec des gouttelettes de cristallisation et automatiquement renvoyées aux transporteurs coulissants, ouvrir le panneau avant et retirer délicatement les plaques. Vérifiez que les plaques soient correctement scellés avant leur stockage de cristallisation.</li>
		<li>Nettoyer les couvercles SBS avec une solution d’éthanol à 20 % avant les empilant sur le côté gauche du gestionnaire de stockage liquid. Jeter la plaque PCR et microtube.</li>
		<li>Désactiver le support de refroidissement microtube et essuyer la condensation. Laissez une serviette en papier sur le dessus de la surface plus froide d’absorber plus de condensation. Ensuite, replacez le couvercle du transporteur et refermer le panneau avant.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. optimisation des conditions
<ol><li>
Axée sur la seringue de liquide gestionnaire : produisant deux dégradés linéaires des concentrations dans les réservoirs d’une plaque de cristallisation (la méthode des 4 coins).
	<ol>
<li>Tout d’abord, assurez-vous que le gestionnaire liquid est activé et initialisé avec son logiciel ouvert.</li>
		<li>Sous le « dégradé » onglet : Ouvrez le programme requis, sélectionnez le type de plaque de cristallisation et le volume final dans les réservoirs (tableau 3). Le paramètre avancé pour « max vol shot » devrait être ramené de 6 000 à 3 000 lors de l’utilisation de solutions contenant [isopropanol] > 10 % v/v et MPD] > 20 % v / v
</li>
		<li>Préparer les seringues. Placez un piston dans chaque seringue (bout pointu vers le bas) et insérez le dos des seringues dans les rainures désignés sous la tête du robot. Tordre une seringue dans le sens horaire pour le bloquer en position (le programme va commencer qu’avec toutes les seringues nécessaires bien fixés).</li>
		<li>Préparer les auges. Retirez le cadre en acier inoxydable et insérer les auges. 4 positions de gauche correspondent aux 4 coins A, B, C, D. commutateur sur « SET UP » onglet qui affiche les volumes des solutions requises dans chaque seringue (le tableau 3, 0,5 volume mort de mL a été ajouté à l’affiche des volumes). Verser les solutions d’angle dans leurs creux respectifs et replacez le cadre sur le pont (l’armature maintient en position avec 2 petits aimants positionnés à l’avant du pont). Une autre manière de procéder à cette étape consiste à verser les solutions dans les auges, lorsqu’ils sont déjà placés sur le pont.
</li>
		<li>Placer la plaque de cristallisation sur le support motorisé de la SBS.</li>
		<li>Cliquez sur « Aspirer » et d’attendre pour cette étape à compléter (lorsque les pistons s’est arrêté sur le chemin vers le haut).</li>
		<li>Basculez vers l’onglet « RUN » et exécuter le programme.</li>
		<li>Une fois le programme terminé, retournez à l’onglet configurer, puis cliquez sur « Supprimer » : le système supprime les seringues de solutions de restes et puis soulève les pistons tout le chemin. « Purger » peut être demandé au lieu de « Supprimer » ; ceci laissera les pistons à la position de fond, prête à aspirer plus de solutions avec les mêmes seringues.
</li>
		<li>Enlever les seringues en tournant dans le sens anti-horaire.</li>
		<li>Jeter les seringues et les creux dans la benne appropriée (ou rincez-les à l’eau désionisée et puis solution à 20 % v/v d’éthanol pour les réutiliser).</li>
		<li>Sceller la plaque et placez-la sur la table de mixage de microplaque pendant 3 min à 1000 tr/min ou 10 min quand des solutions hautement visqueuses sont mixées. La plaque est prête pour la mise en place des gouttelettes de cristallisation sur la distributeur nanolitre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Additif 1 (mise en place des gouttelettes de cristallisation dans une plaque à 96 puits cristallisation pré-remplie avec écran additive) de protocole de dépistage
	<ol>
<li>Tout d’abord, préparer l’État où les concentrations initiales des réactifs a augmenté de 10 % (min. vol. 15 mL lors du transfert de la condition d’un conteneur sur l’écran d’additif avec le gestionnaire de liquid).</li>
		<li>Assurez-vous que le gestionnaire liquid est prêt à fonctionner. Ouvrez le programme « Écran Ajouter aux additifs » pour une seule plaque (entrez le volume dans les réservoirs : 'µL 72 »). Invite, figures et une astuce-gestion système (conseils de 12 x 1 000 µL requis) aide à veiller à ce que le robot est prêt à fonctionner selon les sélections.
</li>
		<li>Récupérer l’écran additive de l’incubateur de-20 ° C et retirer immédiatement son sceau d’en aluminium (utilisez le support de plaque), puis placer la plaque sur le pont du gestionnaire liquid. Le programme fonctionne selon un schéma de portrait (la plaque est placée avec l’A1-angle situé à l’avant gauche du transporteur). Aussi placer aussi le conteneur rempli la condition. Exécutez le programme.</li>
		<li>Une fois les réservoirs de la plaque ont été pourvus, le placer sur un agitateur de microplaque et exécuter le programme. Rincer le récipient de condition avec désionisée éthanol eau et 20 % pour la réutilisation.</li>
		<li>
Mettre en place les gouttelettes sur la distributeur nanolitre. Tout d’abord, desceller la plaque de cristallisation (utilisez le support de plaque). Puis, placez la plaque et la protéine de 8 puits bande en première position du bloc porte-bande. L’onglet « Configuration » sur le logiciel de commande affiche les positions réelles de chaque composant sur le pont. Chargez chaque puits de la bande avec l’échantillon de protéine selon la taille des gouttes nécessaire (tableau 4). Exécuter le programme pour préparer les gouttelettes.
</li>
		<li>Une fois le programme terminé, retirez la plaque du pont et scellez-la immédiatement (utiliser le film adhésif, ruban adhésif large de 3 pouces). Jetez la bandelette dans l’emplacement approprié.</li>
		<li>Évaluer la taille, la forme et le centrage des gouttelettes sous le microscope avant stockage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Additif dépistage protocole 2 (mise en place des gouttelettes de cristallisation dans une plaque de 96 puits cristallisation avec un écran additif réutilisable)
	<ol>
<li>Tout d’abord, préparer l’écran additif : laisser la plaque de culture cellulaires congelés de 96 puits correspondant à décongeler à température ambiante pendant 40 min. Puis, centrifuger l’écran additif à 1 000 x g pendant 2 min.</li>
		<li>Préparer la condition (min. vol. 15 mL lors du transfert de la condition d’un conteneur sur l’écran d’additif avec le gestionnaire de liquid).</li>
		<li>Remplir les réservoirs d’une plaque 96 puits cristallisation avec la condition. Sur le liquide-gestionnaire, procéder de la même manière que le protocole 1, étape 2.2.2, mais entrez '80 µL » pour le volume dans les réservoirs.</li>
		<li>Mettre en place les gouttelettes sur la distributeur nanolitre avec 3 composantes sur le pont (la plaque contenant l’additif écran, ainsi que la plaque de cristallisation et de la bande de 8 puits protéine en première position du bloc porte-bande, tableau 4).</li>
		<li>Sceller la plaque de culture cellulaire contenant l’écran avec une feuille d’aluminium et placez-le dans l’incubateur de-20 ° C.</li>
		<li>Évaluer la taille, la forme et le centrage des gouttelettes sous le microscope avant stockage.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Nous déclare par les présentes un intérêt commercial contradictoire puisque LifeArc commercialise les éléments suivants : le 96 et 48-puits MRC assiettes, le joint suspendu MRC, les écrans de cristallisation MORPHEUS, Pi, ANGSTROM et LMB.

1 - préparation et utilisation des dépistages initiaux stockés en plaques
Trousses de dépistage doit être mélangé avant d’être distribués en plaques car légère séparation de phase ou de précipitations se produit dans quelques tubes pendant le stockage. Quand un écran est composé de deux kits (tubes 2 x 48), le premier tube du second kit est placé dans emplacement E1 du transporteur refroidissement. Quand un écran est composé de 4 kits (4 x 24 tubes), le premier tube du second kit est placé dans emplacement C1, le premier tube du troisième kit est placé dans l’emplacement E1 et le premier tube du quatrième kit est placé dans l’emplacement G1. Tout en insérant des tubes dans leur entreprise de refroidissement, les couvercles sont placés sur un plateau suite à la mise en page standard 96 puits paysage. Car bien numéros sont indiqués sur le dessus des couvercles par les fabricants, cela permet de recouper si tous les tubes ont été placés dans le bon ordre. Cela permet également de remplacer les couvercles correctes sur les tubes lors du remplissage d’un nombre réduit de plaques.
Nous stockons les plaques pré-rempli à 10 ° C, un compromis pour éviter la congélation et stockage à 4 ° C qui peut causer une détérioration des conditions et des problèmes avec étanchéité. Plaques sont stockées pendant plusieurs mois avec normalement sans condensation visible sur la face intérieure du joint. C’est moins vrai pour les plaques de LMB05, LMB06, LMB09 et LMB10, car ceux-ci contiennent des conditions avec des concentrations relativement élevées de réactifs instables (tableau 1). Petite quantité de condensation sur la face interne du joint réduit étanchéité et peut engendrer une contamination croisée entre les loges tandis qu’apposés les plaques. Pour aider à prévenir la condensation pendant le refroidissement initial, plaques peuvent être transférées d’abord au carrousel dans un pique-nique isotherme glacière qui est stocké dans une chambre froide de 4 ° C durant la nuit. Le refroidissement très lent réduit le développement des gradients de température dans les puits scellés et donc réduit la condensation globale15. En outre, une fois que les plaques sont stockées dans un incubateur à 10 ° C, un couvercle de polystyrène SBS personnalisé interne est placé sur la plaque en haut de chaque pile (non illustré).
L’ensemble de nos assiettes remplies au préalable peut être utilisé comme un grand écran initial contre un échantillon de protéines solubles dans l’eau, roman. Par ailleurs, moins de plaques peuvent être sélectionnés pour répondre aux besoins spécifiques. Par exemple, LMB15 et LMB19 sont des écrans formulées spécialement pour les protéines de membrane échantillons26,27, ou LMB20 est un écran formulé avec des atomes lourds pour faciliter l’élimination expérimentale de la diffraction données28 (voir aussi : <a href="https://www.youtube.com/watch?v=Gpb4SypWnQY&t=11s">Formulation des protéines MORPHEUS cristallisation écrans</a>).
2. mise en place des gouttelettes de cristallisation
Lorsque vous utilisez le système 2, kits avec des quantités importantes de réactifs instables de dépistage doit être traitée en premier. Cela évite la condensation sur le caoutchouc des couvercles SBS, qui pourrait affecter la manipulation du couvercle et plaque d’étanchéité. Un couvercle SBS a un peu d’espace libre lorsque sur le dessus d’une plaque, c’est pourquoi ils doivent être alignés au départ (voir le protocole, étape 1.2.6). Les volumes morts de protéine dans les puits de la plaque de la PCR sont relativement généreux (0,8 µL, voir la légende du tableau 2). Notez que tout aussi généreux volumes morts sont employés lorsque vous utilisez le distributeur nanolitres individuellement avec les protéines en bandes de 8 puits (tableau 4). Petits volumes morts peut fonctionner, cependant certains échantillons respectent les conseils, étalonnage d’un robot peut devenir légèrement inexacte, la salle peut être plus chaude que d’habitude, etc.. Toutes mènent à des pertes d’échantillon couvertes par les généreux volumes morts afin de consolider l’approche.
Développements récents a permis plus loin la miniaturisation des expériences et par conséquent le volume d’échantillon requis pour le dépistage des conditions de cristallisation peut être significativement réduit en intégrant la technologie correspondante29,30 . Cependant, certains aspects de la miniaturisation de plus besoin d’un examen minutieux, tels que l’évaporation des gouttelettes31 et la manipulation des microcristaux32.
Enfin, la centrifugation de la plaque (2 000 tr/min, 1 min) pourrait être intégrée comme une étape de routine lorsque vous configurez des gouttelettes de cristallisation (en sphériques supérieure-puits). Taille et leur forme de gouttelettes résultant de la centrifugation plus cohérente peuvent réduire la reproductibilité questions33,34. Sûrement, gouttes centrés facilitera l’évaluation ultérieure des expériences à l’aide d’un microscope car la distance focale nécessaire sera similaire dans l’ensemble de la plaque entière.
3. les avantages de la méthode 4-coin
L’avantage plus important de la méthode 4-coin réside dans sa simplicité, ce qui minimise les erreurs et facilite les protocoles automatisés simples. Par exemple, les solutions de 4 angle seront toujours placées sur le pont d’un gestionnaire liquid suivant la même présentation. Aussi, tous les programmes sont basés sur des rapports fixes entre les solutions (Figure 3). Manuel de préparation des solutions 4 coin est préféré au traitement automatisé des solutions à des concentrations élevées qui peuvent être fortement visqueuses. Il est alors possible sur la plupart des types de gestionnaires de liquides avec des exigences minimales pour l’optimisation des classes liquides d’aspiration/distribution relativement rapide et précise. Néanmoins, certaines solutions d’angle est peut-être encore trop visqueuses pour un robot fonctionnant avec un liquide-système de fonctionner efficacement. C’est pourquoi nous avons opté pour un gestionnaire liquid fonctionnant avec déplacement positif (Figure 3 b).
Outre les 2 dégradés linéaires, des opérations de concentration, un troisième volet (c.-à-d., un ensemble de tampons/additifs) peut être testé à une concentration constante d’une manière pratique. Pour ce faire, un volume relativement important d’un ensemble de solutions d’angle à une concentration appropriée, à l’exclusion de la composante de faire varier, on prépare tout d’abord. Solutions courantes, y compris ce composant est ensuite rajouté pour ajuster les concentrations finales. Par exemple, 50 mL d’un ensemble de 4 solutions d’angle sont préparés à des concentrations supérieures à 10 % celles initialement. Cette série de base est ensuite divisée en 5 sous-ensembles de 4. Enfin, 10 % en volume des solutions tampon pH différent est ajouté à chaque sous-ensemble.
4. les formats et types d’écrans additifs
Les écrans sont normalement stockés à-20 ° C (Figure 4), car ils ne sont pas utilisés régulièrement et contiennent des composés volatiles/unstable. L’utilisation d’un écran additif congelé stocké dans un bloc de puits profonds (1 mL dans les puits) doit être planifiée dès le début parce qu’il faudra de 12 à 24 heures pour toutes les solutions additives décongeler complètement à température ambiante. Aussi, une multitude d’utilisateurs partagent le même écran additif, pouvant causer des problèmes avec la contamination croisée. Enfin, la hauteur des blocs de puits profonds qui les rend impropres pour la plupart des distributeurs de nanolitre. Comme une solution pratique pour contourner ces problèmes, l’écran doit être transférée du puits profond bloc à profil bas plaques (Figure 4).
Des écrans additifs incluent une grande variété de réactifs simples (avec des concentrations unique) ont toujours été très populaire35,36. Toutefois, autres types d’écrans additifs ont été développés qui intègrent les mélanges d’additifs37 ou un nombre réduit d’additifs unique à différentes concentrations,38. Enfin, une approche complémentaire est d’étudier l’effet des additifs sur les échantillons avant cristallisation39,40.
5. autres considérations
Bonnes pratiques : La plupart des écrans contiennent des substances dangereuses ou toxiques même et donc protection individuelle adéquats doit être employée pendant les protocoles. Également, pièces des robots mobiles peuvent entraîner des blessures, surtout lorsque vous essayez d’intervenir manuellement alors qu’un programme s’exécute (bien que la plupart des robots ont système/bouton d’arrêt d’urgence). À cause des complexités techniques impliquées, régulières vérifiant des robots, des écrans et des programmes avec caractérisait auparavant échantillons testés sont importants pour des niveaux élevés soutenus de reproductibilité.
Débit : À titre indicatif, entre 4 000 à 8 000 LMB tôles sont produites chaque année avec le système 1 (et par la suite employées par les utilisateurs pour le dépistage initial). Il n’est pas adapté au stock une grande quantité de plaques pré-rempli à 10 ° C lorsque le chiffre d’affaires escompté est beaucoup plus faible, comme après 4-5 mois, certaines conditions commencera à se détériorer et s’évaporer. Différentes approches aux protocoles d’automatisation ont été appliquées pour les laboratoires de petites à moyennes,41.
Stockage et évaluer les expériences : Après avoir préparé les gouttelettes, plaques sont stockés sur des étagères de bas-vibration dans une chambre à 4 ou 18 ° C et température étroitement contrôlée (+/-écart maximal de 0,5 ° C). Des expériences sont évaluées à l’aide de microscopes de source de lumière froide. Divers systèmes d’imagerie automatisées sont disponibles dans le commerce, mais on devrait considérer soigneusement tous les aspects : la vitesse requise pour analyser une plaque sera suffisante pour un débit élevé ? Objets autres que les cristaux n’interférera avec autofocus ? La qualité qui en résulte des images sera suffisante pour spot très petits cristaux (surtout sur le pourtour des gouttelettes) ? 42 , 43 , 44
Comparaison des conditions de cristallisation : Après enquêtes prudents quant à la nature des cristaux obtenus au départ, on peut analyser les tendances et les similitudes dans l’ensemble des conditions à l’aide de la <a href="http://fms-3.lmb.internal/screens2/search.html">base de données LMB écran</a> ou la C6 <a href="http://c6.csiro.au/">Webtool</a>45.

Cristallographie aux rayons x est largement appliquée pour faire progresser notre compréhension des mécanismes biologiques et la maladie au niveau atomique et d’aider par la suite des approches rationnelles de drogue découverte1. Pour ce faire, purifié et échantillons macromoléculaires (2 à 50 mg/mL) concentré de protéines, ADN, ARN, autres ligands et leurs complexes sont testés pour leur propension à former commandé des grilles tridimensionnelles par cristallisation2,3 ,4. Lorsque des cristaux de haute qualité sont obtenus qui diffracter des rayons x, la structure cristalline peut être résolue à près de résolution atomique5,6. Fondamentalement, les conditions de cristalliser un nouvel échantillon ne peuvent être prédit et le rendement des cristaux de haute qualité est généralement très faible. Une raison est que plusieurs échantillons d’intérêt ont des propriétés biochimiques difficiles, qui les rendent instables à l’échelle de temps correspondante pour la cristallisation (généralement quelques jours). Enfin, le processus est aggravé par le temps nécessaire pour produire des échantillons et des variantes de l’échantillon et d’optimiser leur purification et cristallisation7,8.
Une condition de cristallisation est une solution avec un précipitant qui réduit la solubilité de l’échantillon, et conditions contiennent souvent aussi des tampons et additifs. Des centaines de ces réactifs sont bien adaptés pour modifier les paramètres de l’expériences de cristallisation, comme ils l’ont faible propension à interférer avec l’intégrité des échantillons (tels que des protéines ou des acides nucléiques qui se déroulent). Alors qu’il n’est pas possible de tester des millions de combinaisons de réactifs de cristallisation,,10 - plusieurs à plusieurs kits de dépistage - formulés avec diverses stratégies9essais est possible avec essais miniaturisés et protocoles automatisés. Dans cette perspective, la technique plus favorable est probablement diffusion de la vapeur avec des gouttelettes de nL 100-200 assis sur un petit puits au-dessus d’un réservoir contenant l’état de cristallisation (25-250 µL), mis en œuvre dans la cristallisation spécialisées plaques11 , 12. l’échantillon de protéine et l’État sont souvent combinés dans un rapport 1:1 pour un volume total de 200 nL lorsque vous configurez les gouttelettes dans les puits supérieur. La cristallisation de protéines nanolitres robotique peut être implémentée avec des techniques alternatives et plaques telles que le pétrole sous lot13 et la Phase cubique lipidiques14 (la dernière étant appliquée spécifiquement à des protéines membranaires qui sont très peu solubles dans l’eau).
<a href="http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/JYL/WWWrobots/robot.html">L’installation de cristallisation à la MRC-LMB</a> a débuté dans les années 2000 et un résumé au début de nos protocoles automatisés a été présenté en 200515. Une introduction historique à la cristallisation de protéines a été présentée et aussi un aperçu des avantages de robotique nanolitres approche (puis une nouvelle approche à l’expérimentation systématique). Depuis macromoléculaire cristallisation est essentiellement un processus stochastique avec peu ou pas utile information préalable, qui emploient une grande variété de conditions initiales (adaptées), augmenter le rendement de qualité diffraction cristaux16. En outre, un avantage souvent négligée d’un grand écran initial est de réduire considérablement le besoin d’optimisation des échantillons et des cristaux dans de nombreux cas. Bien sûr, on peut toujours avoir besoin de procéder à l’optimisation de certaines conditions initiales plus tard. En général, la concentration des réactifs et le pH sont ensuite systématiquement étudié. Plus réactifs peuvent également être introduits dans l’ou les conditions optimisée de plus modifier paramètres de cristallisation. Certes, on devrait essayer de cristallisation auprès d’un échantillon fraîchement préparé, c’est pourquoi les protocoles correspondants doivent être simples et disponibles n’importe quel moment.
Ici, deux entièrement automatisée des systèmes conçus à la MRC-LMB (circuits 1 et 2) et les protocoles correspondants sont décrits en détail. L’application principale de ces deux systèmes est initiale de dépistage par la diffusion de la vapeur en séance les plaques de cristallisation de goutte. Système 1 intègre un gestionnaire de liquid, un carrousel automatisé aux plaques de stock, une imprimante jet d’encre pour l’étiquetage de la plaque et un film adhésif adhésive. Sur le système 1, 72 plaques à 96 puits sont remplis avec les kits de dépistage disponibles dans le commerce (80 µL de condition transférée au réservoir d’un volume de 10 mL dans des éprouvettes de départ), étiquetés et scellées. Les plaques sont ensuite stockés dans un incubateur à 10 ° C où ils sont accessibles aux utilisateurs à tout moment (comme initiales écrans appelés « Plaques LMB »).
Système 2 intègre un gestionnaire de liquid, un distributeur nanolitre et un film adhésif adhésive. Sur le système 2, assis de gouttelettes (100-1 000 nL) pour les expériences de diffusion de vapeur sont produites en combinant les conditions et l’échantillon dans les haut-puits de 20 plaques de 48 ou 96 puits pré-remplis avec conditions. Cela signifie que 1 920 conditions de présélection sont mis à l’essai lors de l’utilisation de 20 plaques LMB sur le système 2.
Robots sont également utilisés individuellement pour l’optimisation de certaines affections, et les protocoles semi-automatisé correspondantes sont également décrites. La méthode 4-coin17 est employé couramment pour produire des écrans de l’optimisation. Le protocole correspondant nécessite tout d’abord la préparation manuelle de 4 solutions (« A, B, C et D »). Deux gradients linéaires des concentrations (pour les deux agents principaux de la cristallisation) sont ensuite automatiquement générées directement dans les réservoirs d’une plaque de cristallisation. Pour ce faire, un gestionnaire de liquid axée sur la seringue distribue les solutions de 4 angle à différentes proportions.
Afin d’optimiser une condition, on peut employer écrans additifs potentiellement améliorer les propriétés du résultant cristaux18. Il existe deux approches pour le dépistage de l’additif : un protocole commençant par additifs dispensés dans les réservoirs des plaques de cristallisation avant de configurer les gouttelettes (protocole 1) et un autre protocole où l’écran additif est dispensé directement sur les gouttelettes (protocole 2).
Autres développements utiles qui ont été lancés dans la MRC-LMB pour faciliter la cristallisation macromoléculaire automatisée, sont également présentés. Essentiellement, les plaques de cristallisation et périphériques associés, tels qu’un empilable société de Biomolecular Screening (SBS) couvercle qui minimise évaporation des conditions lorsque vous utilisez le système 2.
Par souci de brièveté, on suppose que les utilisateurs sont familiers avec les fonctions de base et l’entretien de distributeur nanolitre, l’imprimante jet d’encre et le film adhésif adhésive. Sauf indication contraire, les plaques sur le pont des robots sont positionnés tel que le puits A1 (« A1-coin ») est vers l’arrière à gauche d’un support de plaque.

<table><tbody><tr><td>Robots</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freedom EVO&reg ;</td><td>Tecan</td><td>n/a</td><td>Manipulateur de liquides (Système 1). Aspiration/Distribution basée sur le liquide du système. Intègre un carrousel automatisé. Logiciel de contrôle EVOware plus v.2.4.12.0.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Microlab&reg ; STAR&commerce ;</td><td>Hamilton</td><td>n/a</td><td>Manipulateur de liquides (système 2). Aspiration/Distribution basée sur le déplacement positif (CO-RE&trade ; technologie). Logiciel de contrôle Hamilton STAR v.4.3.5.4785 avec interface de gestion de méthode.</td></tr><tr><td>Moustique&reg ;</td><td>TTP Labtech</td><td>n/a</td><td>Distributeur de nanolitres à base de microseringues utilisé pour la mise en place de gouttelettes (système 2 et autonome), plateau à 3 positions. Logiciel de contrôle v.3.11.0.1422.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Libellule&reg ;</td>Manipulateur de liquide à base de seringue <td>TTP Labtech</td><td>n/a</td><td>utilisé pour produire des tamis d’optimisation (méthode aux 4 coins). Logiciel de contrôle v.1.2.1.10196.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Scelleuse de plaques adhésives</td><td>Brandel</td><td>n/a</td><td>Intégrée aux systèmes 1 et 2 (également utilisée comme robot autonome).</td></tr><tr><td>Imprimante à jet d’encre 9232</td><td>Markem-Imaje</td><td>n/a</td><td>Intégrée au système 1. Interface à écran tactile.</td></tr><tr><td><Écrans de cristallisation >forts</forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crystal Screen&trade ; 1</td> kit de cristallisation <td>Hampton Research</td><td>HR2-110</td><td>(tubes à essai, 10mL par condition) utilisé dans LMB01</td></tr><tr><td>Crystal Screen 2&trade ;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-112</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10mL par condition) utilisé dans LMB01</td></tr><tr><td>Wizard&trade ; Classic 1</td><td>Rigaku</td><td>1009530</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10mL par condition) utilisé dans LMB02</td></tr><tr><td>Wizard&trade ; Kit de</td> cristallisation Classic 2 <td>Rigaku</td><td>1009531</td><td>(tubes à essai, 10mL par condition) utilisé dans LMB02</td></tr><tr><td>Grid Screen&trade ; Sulfate d’ammonium</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-211</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10 ml par condition) utilisé dans LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen&trade ; PEG/LiCl</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-217</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10 ml par condition) utilisé dans LMB03</td></tr><tr><td>Quick Screen & trade ;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-221</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10 ml par condition) utilisé dans LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen&trade ; Chlorure de sodium</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-219</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10 ml par condition) utilisé dans LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen&trade ; PEG 6000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-213</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10 ml par condition) utilisé dans LMB04</td></tr><tr><td>Grid Screen&trade ; MPD</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-215</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10mL par condition) utilisé dans LMB04</td></tr><tr><td>MemFac&trade ;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-114</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10mL par condition) utilisé dans LMB04</td></tr><tr><td>PEG/Ion&trade ;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-126</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10mL par condition) utilisé dans LMB05</td></tr><tr><td>Natrix&trade ;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-116</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10mL par condition) utilisé dans LMB05</td></tr><tr><td>Crystal Screen Lite&trade ;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-128</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10 ml par condition) utilisé dans LMB06</td></tr><tr><td>Custom Lite screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>n/a</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10 ml par condition) utilisé dans LMB06</td></tr><tr><td>Wizard&trade ; Cryo 1</td><td>Rigaku</td><td>1009536</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10mL par condition) utilisé dans LMB07</td></tr><tr><td>Wizard&trade ; Cryo 2</td><td>Rigaku</td><td>1009537</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10mL par condition) utilisé dans LMB07</td></tr><tr><td>JBS1</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-101L</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10mL par condition) utilisé dans LMB08</td></tr><tr><td>JBS2</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-102L</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10mL par condition) utilisé dans LMB08</td></tr><tr><td>JBS3</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-103L</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10mL par condition) utilisé dans LMB08</td></tr><tr><td>JBS4</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-104L</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10mL par condition) utilisé dans LMB08</td></tr><tr><td>JBS5</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-105L</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10mL par condition) utilisé dans LMB09</td></tr><tr><td>JBS6</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-106L</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10mL par condition) utilisé dans LMB09</td></tr><tr><td>JBS7</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-107L</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10mL par condition) utilisé dans LMB09</td></tr><tr><td>JBS8</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-108L</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10mL par condition) utilisé dans LMB09</td></tr><tr><td>JBS9</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-109L</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10mL par condition) utilisé dans LMB10</td></tr><tr><td>JBS10</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-110L</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10mL par condition) utilisé dans LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade ; Écran 1 pH 4.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10 ml par condition) utilisé dans LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade ; Écran 1 pH 5,5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10 ml par condition) utilisé dans LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade ; Écran 1 pH 6,5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10 ml par condition) utilisé dans LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade ; Écran 1 pH 7,5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10 ml par condition) utilisé dans LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade ; Écran 1 pH 8.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10mL par condition) utilisé dans LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade ; Écran 2 pH 4.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10 ml par condition) utilisé dans LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade ; Écran 2 pH 5,5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10 ml par condition) utilisé dans LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade ; Écran 2 pH 6,5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10 ml par condition) utilisé dans LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade ; Écran 2 pH 7,5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10 ml par condition) utilisé dans LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade ; Ecran 2 pH 8.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10mL par condition) utilisé dans LMB12</td></tr><tr><td>Index&trade ;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10mL par condition) utilisé dans LMB13</td></tr><tr><td>SaltRX&trade ; 1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-107</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10mL par condition) utilisé dans LMB14</td></tr><tr><td>SaltRX&trade ; 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-109</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10mL par condition) utilisé dans LMB14</td></tr><tr><td>MemStar&trade ;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-21</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10mL par condition) utilisé dans LMB15</td></tr><tr><td>MemSys&trade ;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-25</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10 ml par condition) utilisé dans LMB15</td></tr><tr><td>JCSG-plus&trade ; Suite</td><td>Qiagen</td><td>130720</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10mL par condition) utilisé dans LMB16</td></tr><tr><td>MORPHEUS&reg ; screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-46</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10mL par condition) utilisé dans LMB17</td></tr><tr><td>Pi minimal</td><td>screen JenaBioScience</td><td>CS-127</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10mL par condition) utilisé dans LMB18</td></tr><tr><td>Pi-PEG screen</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-128</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10 ml par condition) utilisé dans LMB19</td></tr><tr><td>MORPHEUS&reg ; II screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-91</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10 ml par condition) utilisé dans LMB20</td></tr><tr><td>LMB cristallisation crible et commerce ;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-98</td><td>Kit de cristallisation (tubes à essai, 10 ml par condition) utilisé dans LMB21</td></tr><tr><td>Cribles additifs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-138</td><td>Congelé dans un bloc de puits profonds de 96 puits (1 mL par puits).</td></tr><tr><td>Tamis additif MORPHEUS&reg ;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-93-500</td><td>Congelé dans un bloc de puits profonds de 96 puits (500 &micro ; L par puits).</td></tr><tr><td>ANGSTROM crible additif & commerce ; &nbsp ;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-100</td><td>Congelé dans un bloc de puits profonds de 96 puits (1 mL par puits).</td></tr><tr><td>Tamis additif MORPHEUS&reg ;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-93</td><td>Congelé en culture cellulaire à 96 puits Plaque Costar&reg ; avec puits en forme de V (100 &micro ; L par puits).</td></tr><tr><td>ANGSTROM crible additif & commerce ; &nbsp ;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-100-FX</td><td>Congelé en culture cellulaire à 96 puits Plaque Costar&reg ; avec puits en forme de V (100 & micro ; L par puits).</td></tr><tr><td>Crible d’additifs HIPPOCRATES</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>n/a 48</td><td>additifs uniques (composés médicamenteux trouvés dans MORPHEUS&reg ; III).</td></tr><tr><td><fort>Autres consommables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well MRC 2-drop</td><td>plate Swissci</td><td>MRC 96T-UVP</td><td>Sitting-drop, plaque de diffusion de vapeur. Volume recommandé du réservoir : 80&nbsp ; &micro ;L. Gamme de volumes utiles de gouttelettes : 10-1000 nL. Transmissible aux UV.</td></tr><tr><td>Plaque MRC à 1 goutte à 48 puits&nbsp ; (« Plaque MAXI »)</td><td>Swissci</td><td>MMX01-UVP&nbsp ;</td><td>Sitting-drop, plaque de diffusion de vapeur pour la mise à l’échelle/l’optimisation. Volume recommandé du réservoir : 200&nbsp ; &micro ;L. Gamme de volumes utiles de gouttelettes : 0,1-10 &micro ;L. Transmissible aux UV.</td></tr><tr><td>Joint d’étanchéité MRC</td><td>Swissci</td><td>n/a</td><td>Drop-drop, compatible avec les deux plaques de diffusion de vapeur MRC (MRC 96T-UVP et MMX01-UVP ). Transmissible aux UV et aux rayons X.</td></tr><tr><td>Ruban d’étanchéité adhésif</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-50</td><td>3 pouces de large Duck&reg ; HD Clear&trade ; pour soudeuse et soudure manuelle.</td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium adhésive</td><td>Beckman Coulter</td><td>538619</td><td>Utilisée pour refermer les tamis d’additifs.</td></tr><tr><td>Cartouche d’encre</td><td>Markem-Imaje</td><td>9651</td><td>System 1 (imprimante à jet d’encre).</td></tr><tr><td>Cartouche de solvant</td><td>Markem-Imaje</td><td>8652</td><td>Système 1 (imprimante à jet d’encre).</td></tr><tr><td>50 et micro ; L conseils&nbsp ;</td><td>Hamilton</td><td>235947</td><td>System 2 (STAR&trade ; manipulateur de liquides). Boîte de 6 sets avec 1920 x CO-RE&trade ; Pointes dans les piles jetables.</td></tr><tr><td>Récipient à réactifs</td><td>Hamilton</td><td>194052</td><td>Utilisé pour distribuer une condition dans une ou plusieurs plaques lors de protocoles de criblage d’additifs.</td></tr><tr><td>plaque PCR</td><td>Thermo Scientific&commerce ;</td><td>AB-2150</td><td>Système 2 (contient la protéine à transférer au Mosquito&reg ;). Abgene Diamond ultra, 384 puits en forme de V.</td></tr><tr><td>microseringues</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03020</td><td>Bobine de 26 000 microseringues pour le distributeur de nanolitres Mosquito&reg ; (espacement de 9 mm).</td></tr><tr><td>bloc porte-bandelettes</td><td>TTP Labtech</td><td>3019-05013</td><td>Dispositif SSB pour les bandelettes Mosquito&reg ;, alias 'Porte-réactif à 4 voies'.</td></tr><tr><td>2 et micro ; L Bande à 8 puits</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03110</td><td>Contient des protéines sur le pont du Mosquito&reg ;. Boîte de 40 bandelettes, max. vol. en puits est de 3,2 & micro ;L.</td></tr><tr><td>5 et micro ; L Bande 8 puits</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03100</td><td>Contient des protéines sur le pont du Mosquito&reg ;. Boîte de 40 bandelettes, max. vol. en puits est de 7,5 &micro ;L.</td></tr><tr><td>Seringues de 5 mL</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-07100</td><td>Corps de seringue et piston pour le manipulateur de liquides Dragonfly&reg ;. Paquet de 100.</td></tr><tr><td>Auges/Réservoirs</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-07103</td><td>Contient des solutions mères sur le pont du Dragonfly&reg ;. Paquet de 50.</td></tr><tr><td>Agitateur orbital</td><td>CamLab Limited</td><td>n/a</td><td>Variomag&reg ; pour des conditions de mélange dans une seule plaque (0-2000 tr/min).</td></tr><tr><td>Mélangeur de microplaques</td><td>TTP Labtech</td><td>3121-01015</td><td>MxOne. Condition de mélange dans une seule plaque avec 96 broches vibrantes.</td></tr></tbody></table>

automatisée des protocoles de cristallisation macromoléculaire au laboratoire de biologie moléculaire mrc

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

Lorsque des cristaux de haute qualité sont obtenus qui diffracter des rayons x, la structure cristalline peut être résolue à près de résolution atomique. Les conditions de cristallisation des protéines, ADN, ARN, ainsi que leurs complexes ne peuvent toutefois pas être prédite. Utilisant une large variété de conditions est un moyen d’augmenter le rendement des cristaux par diffraction de qualité. Deux systèmes entièrement automatisés ont été développés à la MRC laboratoire de biologie moléculaire (Cambridge, Angleterre, MRC-LMB) qui facilitent le dépistage cristallisation de 1 920 conditions initiales par diffusion de la vapeur en gouttelettes nanolitre. Semi-automatisé protocoles ont également été développés pour optimiser les conditions en changeant les concentrations des réactifs, le pH, ou en introduisant des additifs potentiellement améliorent les propriétés des cristaux qui en résulte. Tous les protocoles correspondants seront décrites en détail et discute brièvement. Pris ensemble, ils permettent la cristallisation macromoléculaire pratique et très efficace dans une installation multi-utilisateurs, tout en donnant aux utilisateurs un contrôle sur les paramètres clés de leurs expériences.

Systèmes automatisés et protocoles pour l’établissement systématique d’un grand nombre d’écrans et des gouttelettes de cristallisation nanolitres pour expériences de diffusion de vapeur sont décrites et discutées.

Automatisée des protocoles de cristallisation macromoléculaire au laboratoire de biologie moléculaire MRC

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

L'objectif général de cette procédure est de produire des cristaux de haute qualité à partir de conditions initiales de criblage de cristallisation. Les cristaux peuvent être utilisés pour étudier les structures de protéines, d'ADN, d'ARN et de leurs complexes. L'étude des structures macromoléculaires est devenue de plus en plus difficile.Et le fait de fournir une grande variété de conditions initiales augmente le rendement de cristaux utiles, tout en réduisant le besoin d'optimisation de l'échantillon et des cristaux. Les deux systèmes entièrement automatisés, le LMB, facilitent la préparation de jusqu'à 1 920 expériences de diffusion de vapeur en gouttelettes de nanolitre. Par souci de concision, on suppose que les utilisateurs sont déjà familiers avec les fonctions de base et l'entretien du distributeur de nanolitres, de l'imprimante jet d'encre et du scelleur de plaques adhésif.Avant d'effectuer la procédure, assurez-vous que les robots du système sont initialisés et que leur logiciel de contrôle est ouvert. Allumez le refroidisseur du support de refroidissement des tubes environ 30 minutes avant le démarrage du programme principal. Placez une plaque témoin sur le support SBS motorisé du scelleur de plaques.Faites fonctionner le scelleur de plaques et vérifiez que le film est correctement appliqué. Répétez ce test deux fois de plus pour vous assurer que le distributeur automatique de liquides est prêt. Ensuite, ajoutez 20 litres d'eau déionisée au récipient principal du distributeur de liquides.Déconnectez les inserts de raccordement du récipient plus petit contenant la solution de rinçage à 20 % d'éthanol, puis reliez les inserts au récipient principal. Saisissez le nom d'écran approprié sur l'écran tactile de l'imprimante jet d'encre. Ensuite, ouvrez et refermez la porte du plateau tournant pour déclencher sa rotation.Ouvrir la porte lorsque le premier bloc apparaît. Charger complètement le premier bloc avec 22 plaques de cristallisation, chacune ayant la colonne un tournée vers l'extérieur. Charger complètement les deux blocs suivants de la même manière.Chargez les six plaques restantes dans les positions les plus hautes du quatrième étage, puis fermez la porte du carrousel. Vérifiez que l'affichage du refroidisseur indique 14 degrés Celsius. Inversez doucement et répétitivement les trousses de dépistage sélectionnées pendant une minute.Ensuite, ouvrez le panneau avant du distributeur de liquides. Ouvrez les tubes et placez-les dans le support de refroidissement selon la disposition standard en plaque de 96 puits. Après avoir placé chaque tube dans le support, posez son couvercle sur le plateau selon la même disposition en 96 puits.Lors de l'utilisation du système 1, les étiquettes des fils sont placées sur le plateau selon la disposition en 96 puits afin de permettre une vérification croisée que les tubes sont correctement rangés. Vérifiez les positions des tubes, puis assurez-vous que tous les tubes sont bien à plat et bien enfoncés dans le support. Ensuite, fermez le panneau avant.Dans la fenêtre de démarrage du logiciel du distributeur de liquides, sélectionnez Exécuter la maintenance et ouvrez le programme de rinçage. Exécutez le programme pour rincer l'éthanol à 20 % du système et pour laver les parties extérieures des embouts de distribution de liquide. Une fois le rinçage terminé, cliquez sur Annuler pour revenir à l'écran de démarrage.Sélectionnez Exécuter un processus existant, puis cliquez sur Démarrer votre sélection. Ouvrez le programme de distribution du kit MRC. Saisissez 18" pour les Instances dans l'écran de configuration et exécutez le programme. Surveillez le système pendant que les quatre premières plaques sont étiquetées, remplies et scellées.Ne laissez pas le système sans surveillance jusqu'à ce que la préparation des quatre premières plaques soit terminée. Une fois que les 72 plaques ont été préparées et replacées dans le carrousel, remplacez les raccords de couplage du conteneur d'eau déionisée par celui du conteneur d'éthanol à 20 %. Exécutez le programme de rinçage de démarrage en utilisant le même procédé qu'auparavant.Éteignez le réfrigérateur et jetez les tubes vides du kit de criblage. Retirez soigneusement les 72 plaques préparées du plateau tournant. Jetez les plaques incorrectement remplies ou mal scellées.Conserver les plaques prêtes à l'emploi à 10 degrés Celsius. Vérifiez d'abord que les robots du système sont allumés, que le distributeur de nanolitres est initialisé avec son logiciel ouvert, et que le gestionnaire de méthodes du manipulateur de liquides est ouvert. Allumez le support de refroidissement pour microtubes environ 15 minutes avant le démarrage du programme principal.Placer une plaque de test sur le support SBS motorisé du scelleur de plaques. Faire fonctionner le scelleur et vérifier que la plaque est correctement scellée. Tester le scelleur de plaques trois fois.Ensuite, faites fonctionner le distributeur de nanolitres pour déposer des gouttelettes de 100 nanolitres de solution d'essai dans une plaque de test. On voit ici une microphotographie en lumière visible d'une gouttelette de 100 nanolitres produite par le distributeur de nanolitres, avec la solution d'essai préparée à l'aide d'un colorant rouge. Fermez le logiciel du distributeur de nanolitres et retirez le bloc support de bande de la platine.Ensuite, placez dans un support de plaque sur mesure une plaque de cristallisation pré-remplie de 96 puits contenant la plus forte quantité relative de réactifs volatils dans ses conditions. Retirez le film adhésif de la plaque. Ouvrez le panneau avant du distributeur automatique et placez la plaque non scellée sur la platine à l'arrière du premier chariot coulissant.Couvrez la plaque avec un couvercle en aluminium SBS. Positionnez le couvercle vers le coin arrière gauche du support en appliquant une pression douce sur le coin opposé du couvercle. Lorsque vous utilisez le système 2, les trousses de criblage contenant des quantités importantes de réactifs volatils doivent être traitées en premier.Cela évite la formation de condensation sur les broches SBS, ce qui pourrait affecter la manipulation automatisée des broches ou la fermeture des plaques. Ouvrez, chargez les plaques dans les supports coulissants et recouvrez les 19 plaques restantes de la même manière, en travaillant des conditions les plus volatiles aux moins volatiles. Une fois que le support de refroidissement des microtubes atteint 4 degrés Celsius, indiqué par un voyant vert, retirez son couvercle.Couper le couvercle d'un microtube contenant au moins 440 microlitres d'un échantillon protéique. S'assurer que l'échantillon ne présente pas d'écume au-dessus du ménisque, car cela perturberait le système de détection du liquide. Placer le tube à la position 1 du support de refroidissement pour microtubes.Placez une plaque PCR sur le plateau du manipulateur liquide devant le support de l'adaptateur de déplacement de plaque. Fermez ensuite le panneau avant. Dans l'interface de gestion des méthodes du manipulateur liquide, sélectionnez Configurer les plaques.Surveillez l'initialisation des deux systèmes et renseignez les paramètres de l'expérience, notamment le type de plaque et le nombre de gouttes pour chaque condition, la taille des gouttes, la position de la première plaque à traiter, ainsi que le nombre de plaques. Cliquez sur Non lorsque vous êtes invité à savoir si vous souhaitez une aide pour charger la station. Une fois vérifié qu'aucun support de pointes n'est vide, cliquez sur OK. Après avoir vérifié qu'il y a suffisamment de pointes pour l'expérience, cliquez sur OK. Si nécessaire, mettez à jour le système de gestion des pointes, puis cliquez sur OK. Assurez-vous que la station du distributeur nanolitre est dégagée du bloc support de bandes et que le support est bien à l'arrière des piles de pointes de 50 microlitres, lesquelles doivent être dégagées des couvercles SBS en aluminium.Vérifiez minutieusement que tous les autres composants requis sont prêts, puis lancez le processus. Surveillez le système pendant que le distributeur de nanolitres dépose les gouttes sur la première plaque, puis que le scelleur de plaques scelle celle-ci. Ne laissez pas le système sans surveillance jusqu'à ce que la préparation de la première plaque soit terminée.Une fois que les 20 plaques ont été préparées avec les gouttelettes de cristallisation et sont automatiquement revenues sur les supports coulissants, ouvrez le panneau avant et retirez délicatement les plaques. Vérifiez que les plaques sont correctement scellées avant de les entreposer pour la cristallisation. Nettoyez les couvercles SBS avec la solution d'éthanol à 20 % avant de les empiler sur le côté gauche du distributeur automatique pour le stockage.Jetez la plaque PCR et le microtube. Éteignez le support de refroidissement pour microtubes et essuyez la condensation. Laissez une serviette en papier sur la surface froide pour absorber toute condensation ultérieure.Ensuite, remplacez le couvercle du support et fermez le panneau avant. OmpF et MreB ont été initialement criblés à l'aide de ces protocoles entièrement automatisés. Des cristaux d'OmpF de qualité suffisante pour la diffraction des rayons X ont été trouvés dans le puits A4 de la plaque LMB 7.Des cristaux de qualité pour la diffraction de MreB ont été trouvés dans le puits D12 de la plaque LMB 20. Le stockage des plaques préalimentées à 10 degrés Celsius constitue un compromis permettant d'éviter le gel et le stockage à 4 degrés, qui pourrait entraîner une détérioration des conditions de cristallisation ainsi que des problèmes liés à la condensation. Conservées de cette manière, les plaques peuvent être utilisées dans un délai de quatre à cinq mois.Entre 4 000 et 8 000 plaques LMB sont produites chaque année avec le système 1 et sont ensuite utilisées pour le criblage initial. Les protocoles doivent être optimisés différemment lorsque le rendement attendu est nettement plus faible. L'ensemble de nos plaques préalables au carburant est généralement utilisé comme un grand criblage initial pour un échantillon nouveau.Cependant, un plus petit nombre de plaques peut être sélectionné en fonction d'exigences d'échantillonnage plus spécifiques. Après la préparation des gouttelettes, les plaques sont stockées sur des étagères à faible vibration avec une température strictement contrôlée à 4 ou 18 degrés Celsius. Les expériences sont évaluées à l'aide de microscopes équipés d'une source lumineuse à défilement.Après avoir soigneusement étudié la nature des cristaux, les caractéristiques et similitudes entre différentes conditions peuvent être analysées à l'aide d'outils en ligne tels que les bases de données LMB ou C6 Screen. Une optimisation ultérieure des conditions de cristallisation peut toutefois être nécessaire. D'autres protocoles automatisés, incluant les méthodes à quatre coins et le criblage d'additifs, sont décrits dans notre manuscrit.

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La structure 3-D d'une molécule donne une compréhension unique de la façon dont les fonctions molécule. La principale méthode de détermination de la structure au quasi-atomique résolution est cristallographie aux rayons X. Ici, nous montrons les méthodes actuelles pour l'obtention de trois dimensions des cristaux de toute macromolécule donnée qui conviennent pour la détermination de structure par cristallographie aux rayons X.

Cristallisation des protéines pour la cristallographie aux rayons X

Ici est décrit une approche robotique à haut débit cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidiques pour une utilisation dans la détermination de la structure macromoléculaire à l'aide cristallographie aux rayons X. Trois robots capables de gérer la protéine visqueuse et collante chargé de mésophase partie intégrante de la méthode sont présentés.

Utilisation d&#39;un robot pour haut-débit cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidiques

Nous décrivons ici une méthode générale pour le dépistage aléatoire de la matrice de microseed. Cette technique est illustrée à augmenter de manière significative le taux de dépistage des expériences de cristallisation de protéines de succès, de réduire le besoin pour l'optimisation, et de fournir un approvisionnement fiable de cristaux pour la collecte des données et expériences ligand-trempage.

Améliorer le taux de réussite de cristallisation de protéines par hasard Microseed Matrice dépistage

Nous décrivons ici comment utiliser le contrôle automatisé et les possibilités de collecte de données disponibles à certains faisceaux de rayonnement synchrotron. Scientifiques envoyer des échantillons de cryocooled le synchrotron et les propriétés de diffraction sont examinées, les ensembles de données sont collectées et traitées et, si possible, une solution de la structure est réalisée — tout cela sans intervention humaine.

Caractérisation entièrement autonome et collecte de données auprès des cristaux des macromolécules biologiques

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Un porte-échantillon tout-en-un pour la cristallographie macromoléculaire de rayon X avec la diffusion minimale de fond

Les études structurelles des biomacromolecules par cristallographie nécessitent des cristaux de haute qualité. Ici, nous démontrons un protocole qui peut être utilisé par OptiCrys (un instrument entièrement automatisé développé dans notre laboratoire) et / ou boutons de microdialyse pour la croissance de gros cristaux de haute qualité basée sur la connaissance du diagramme de phase de cristallisation.

Optimisation de la croissance cristalline pour la cristallographie macromoléculaire neutronique

Le rapport signal/bruit des données est l’une des considérations les plus importantes lors de la réalisation de mesures de diffraction des rayons X à partir de microcristaux. La ligne de faisceau VMXm fournit un environnement à faible bruit et un microfaisme pour de telles expériences. Ici, nous décrivons les méthodes de préparation des échantillons pour le montage et le refroidissement des microcristaux pour VMXm et d’autres lignes de faisceau de cristallographie macromoléculaire microfocus.

Un pipeline de préparation d’échantillons pour les microcristaux à la ligne de faisceau VMXm

Nous décrivons ici comment utiliser les pipelines automatisés de cristallographie macromoléculaire pour l’analyse rapide du complexe ligand-protéine et le criblage de fragments à grande échelle basés sur la technologie CrystalDirect du laboratoire HTX à EMBL Grenoble.

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Ce protocole détaille le criblage de cristallisation à haut débit, allant de la préparation de 1 536 microplaques de dosage à la fin d’une fenêtre expérimentale de 6 semaines. Des détails sont inclus sur la configuration de l’échantillon, l’imagerie obtenue et la façon dont les utilisateurs peuvent effectuer des analyses à l’aide d’une interface utilisateur graphique activée par l’intelligence artificielle pour identifier rapidement et efficacement les conditions de cristallisation...

Criblage à haut débit pour obtenir des résultats cristallins pour la cristallographie des protéines

Nous présentons un protocole pour la cristallisation des protéines à l’aide de l’installation de cristallisation du complexe de recherche à Harwell et la collecte ultérieure de données cristallographiques aux rayons X in situ à partir de cristaux à l’intérieur des plaques sur la ligne de faisceau VMXi (Versatile Macromolecular Crystallography in situ ) de Diamond. Nous décrivons les exigences en matière d’échantillons, les protocoles de cristallisation et les directives de collecte de données.

Cristallisation et collecte in situ de données à température ambiante à l’aide de l’installation de cristallisation de Harwell et de la ligne de faisceau VMXi, source de lumière au diamant

Découvrez les protocoles automatisés de cristallisation macromoléculaire pour la biologie structurale. Ces méthodes permettent de préparer jusqu'à 1 920 expériences de diffusion de vapeur en gouttelettes nanolitriques avec une intervention manuelle minimale.

Automatisée des protocoles de cristallisation macromoléculaire au laboratoire de biologie moléculaire MRC

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