Automatisée des protocoles de cristallisation macromoléculaire au laboratoire de biologie moléculaire MRC

L’objectif global de cette procédure est de produire des cristaux de haute qualité à partir des conditions initiales de criblage de cristallisation. Les cristaux peuvent être utilisés pour étudier les structures des protéines, de l’ADN, de l’ARN et de leurs complexes. Quelque chose dans les structures macromoléculaires est devenu de plus en plus difficile.

Et la fourniture d’une grande variété de conditions initiales augmente le rendement des cristaux utiles, tout en réduisant le besoin d’optimisation des échantillons et des cristaux. Les deux systèmes entièrement automatisés, le LMB, facilitent la préparation de jusqu’à 1 920 expériences de diffusion de vapeur dans des gouttelettes de nanolitres. Par souci de brièveté, on suppose que les utilisateurs connaissent déjà les fonctions de base et l’entretien du distributeur de nanolitres, de l’imprimante à jet d’encre et de la scelleuse de plaques adhésives.

Avant d’effectuer la procédure, assurez-vous que les robots du système sont initialisés et que leur logiciel de contrôle est ouvert. Allumez le refroidisseur du support de refroidissement du tube, environ 30 minutes avant le démarrage du programme principal. Placez une plaque d’essai sur le support SBS motorisé de la scelleuse de plaques.

Faites fonctionner la scelleuse de plaques et vérifiez que le film est correctement appliqué. Répétez ce test deux fois de plus pour vérifier que la scelleuse de plaques est prête. Ajoutez ensuite 20 litres d’eau déminéralisée dans le récipient principal du manipulateur de liquides.

Débranchez les inserts d’accouplement du plus petit récipient de solution de rinçage à 20 % d’éthanol et connectez les inserts au récipient principal. Entrez le nom d’écran approprié sur l’écran tactile de l’imprimante à jet d’encre. Ouvrez et fermez ensuite la porte du carrousel pour déclencher la rotation du carrousel.

Ouvrez la porte lorsque la première pile se présente. Chargez complètement la première pile avec 22 plaques de cristallisation, chacune avec une colonne tournée vers l’extérieur. Chargez complètement les deux piles suivantes de la même manière.

Chargez les six plaques restantes dans les positions les plus hautes de la quatrième pile, puis fermez la porte du carrousel. Vérifiez que l’affichage du refroidisseur indique 14 degrés Celsius. Retournez doucement et à plusieurs reprises les kits de dépistage sélectionnés pendant une minute.

Ensuite, ouvrez le panneau avant du manipulateur de liquides. Ouvrez les tubes et placez-les dans le support de refroidissement dans la disposition standard à 96 puits. Après avoir placé chaque tube dans le support, placez son couvercle sur le plateau dans la même disposition à 96 puits.

Lors de l’utilisation du système 1, les fils d’étiquettes sont placés sur le plateau dans la disposition à 96 puits pour permettre la vérification croisée que les tubes sont correctement disposés. Vérifiez les positions des tubes, puis assurez-vous que tous les tubes sont de niveau et bien installés dans le support. Fermez ensuite le panneau avant.

Dans la fenêtre de démarrage du logiciel de traitement des liquides, sélectionnez Exécuter la maintenance et ouvrez le programme de vidage. Exécutez le programme pour rincer les 20 % d’éthanol du système et pour laver l’extérieur des pointes de distribution de liquide. Une fois le vidage terminé, cliquez sur Annuler pour revenir au démarrage.

Sélectionnez Exécuter un processus existant et cliquez sur Démarrer votre sélection. Ouvrez le programme de distribution de kits MRC. Remplissez 18"for Instances dans l’écran de configuration et exécutez le programme, Surveillez le système pendant que les quatre premières plaques sont étiquetées, remplies et scellées.

Ne laissez pas le système sans surveillance tant que la préparation des quatre premières plaques n’est pas terminée. Une fois que les 72 plaques ont été préparées et remises dans le carrousel, basculez les inserts d’accouplement du récipient d’eau déminéralisée au récipient à 20 % d’éthanol. Exécutez le programme de vidage de démarrage en utilisant le même processus que précédemment.

Éteignez le refroidisseur et jetez les tubes vides du kit de criblage. Retirez délicatement les 72 assiettes préparées du carrousel. Jetez les plaques mal remplies ou mal scellées.

Conservez les plaques prêtes à l’emploi à 10 degrés Celsius. Assurez-vous d’abord que les robots du système sont allumés, que le distributeur de nanolitres est initialisé avec son logiciel ouvert et que le gestionnaire de méthodes du manipulateur de liquides est ouvert. Allumez le support de refroidissement des microtubes environ 15 minutes avant le démarrage du programme principal.

Placez une plaque d’essai sur le support SBS motorisé de la scelleuse de plaques. Faites fonctionner la scelleuse de plaques et vérifiez que la plaque est correctement scellée. Testez la scelleuse de plaques trois fois.

Ensuite, faites fonctionner le distributeur de nanolitres pour placer 100 gouttelettes de nanolitres de solution d’essai dans une plaque d’essai. Voici une micrographie optique d’une gouttelette de 100 nanolitres, produite par le distributeur de nanolitres, avec la solution de test à base de colorant rouge. Fermez le logiciel du distributeur de nanolitres et retirez le bloc porte-bande du plateau.

Ensuite, dans un porte-plaque conçu sur mesure, une plaque de cristallisation préremplie à 96 puits avec la quantité relative la plus élevée de réactifs volatils dans ses conditions. Retirez le film adhésif de la plaque. Ouvrez le panneau avant du manipulateur de liquides et placez la plaque non scellée sur le pont à l’arrière du premier support coulissant.

Couvrez la plaque avec un couvercle en aluminium SBS. Placez le couvercle vers le coin arrière gauche du support en appliquant une légère pression sur le coin opposé du couvercle. Lors de l’utilisation du système 2, les kits de dépistage contenant des quantités importantes de réactifs volatils doivent être traités en premier.

Cela permet d’éviter la formation de condensation sur les fils SBS, ce qui pourrait entraîner une manipulation automatisée des fils ou l’étanchéité des plaques. Descellez, chargez dans les supports coulissants et couvrez les 19 plaques restantes de la même manière, en travaillant des conditions les plus volatiles aux moins volatiles. Une fois que le support de refroidissement des microtubes est à 4 degrés Celsius, comme indiqué par un voyant vert, retirez son couvercle.

Coupez le couvercle d’un microtube contenant au moins 440 microlitres d’un échantillon de protéines. Assurez-vous que l’échantillon n’a pas de mousse au-dessus du ménisque, car cela interférerait avec le système de détection de liquide. Placez le tube en position 1 du support de refroidissement des microtubes.

Placez une plaque PCR sur le pont du manipulateur de liquides, devant le support de l’adaptateur mobile. Fermez ensuite le panneau avant. Dans l’interface de gestion de la méthode de traitement des liquides, sélectionnez Plaques de configuration.

Surveillez l’initialisation des deux systèmes et renseignez les paramètres de traitement, y compris le type de plaque et le nombre de gouttes pour chaque condition, la taille des gouttes, la position de la première plaque à traiter et le nombre de plaques. Cliquez sur Non lorsque vous êtes invité à demander de l’aide pour charger le deck. Une fois que vous avez vérifié qu’il n’y a pas de paniers de pointes vides, cliquez sur OK. Une fois que vous avez vérifié qu’il y a suffisamment d’astuces pour l’exécution, cliquez sur OK. Si nécessaire, mettez à jour le système de gestion des pointes et cliquez sur OK. Assurez-vous que le plateau du distributeur de nanolitres est dégagé du bloc de support de bandelettes, et que le support se trouve à l’arrière des piles d’embouts de 50 microlitres, à l’écart des couvercles SBS en aluminium.

Vérifiez que tous les autres composants requis sont prêts, puis lancez le processus. Surveillez le système pendant que le distributeur de nanolitres fixe les gouttes dans la première plaque, et que la scelleuse de plaques scelle ensuite la plaque. Ne laissez pas le système sans surveillance tant que la préparation de la première plaque n’est pas terminée.

Une fois que les 20 plaques ont été préparées avec des gouttelettes de cristallisation et qu’elles retournent automatiquement dans les supports coulissants, ouvrez le panneau avant et retirez délicatement les plaques. Vérifiez que les plaques sont correctement scellées avant de les stocker pour la cristallisation. Nettoyez les couvercles SBS avec la solution d’éthanol à 20 % avant de les empiler sur le côté gauche du manipulateur de liquide pour le stockage.

Jetez la plaque PCR et le microtube. Éteignez le support de refroidissement des microtubes et essuyez la condensation. Laissez une serviette en papier sur la surface plus froide pour absorber davantage de condensation.

Replacez ensuite le couvercle du support et fermez le panneau avant. OmpF et MreB ont d’abord été sélectionnés à l’aide de ces protocoles entièrement automatisés. Des cristaux OmpF de qualité suffisante pour la diffraction des rayons X ont été trouvés dans le puits A4 de la plaque LMB 7.

Des cristaux de qualité diffraction de MreB ont été trouvés dans le puits D12 de la plaque LMB 20. Le stockage des plaques de pré-combustible à 10 degrés Celsius est un compromis pour éviter le gel et le stockage à 4 degrés, ce qui peut entraîner une détérioration des conditions de cristallisation et des problèmes liés à la condensation. Lorsqu’elles sont entreposées de cette façon, les plaques peuvent être utilisées dans un délai de quatre à cinq mois.

Entre 4 et 8 000 plaques LMB sont produites chaque année avec le système 1 et sont ensuite utilisées pour le criblage initial. Les protocoles doivent être optimisés différemment lorsque le chiffre d’affaires attendu est beaucoup plus faible. L’ensemble de nos plaques de pré-carburant est normalement utilisé comme grand écran initial pour un nouvel échantillon.

Cependant, moins de plaques peuvent être sélectionnées pour des exigences d’échantillon très spécifiques. Après la préparation des gouttelettes, les plaques sont stockées sur des étagères à faibles vibrations avec une température étroitement contrôlée à 4 ou 18 degrés Celsius. Les expériences sont évaluées à l’aide de microscopes à source lumineuse à rouleau.

Après avoir soigneusement étudié la nature des cristaux, les traits et les similitudes entre les conditions peuvent être analysés à l’aide d’outils en ligne tels que les bases de données LMB ou C6 Screen. Une optimisation ultérieure des conditions de cristallisation peut encore être nécessaire. D’autres protocoles automatisés, avec les méthodes à 4 coins et le criblage additif, sont décrits dans notre manuscrit.