Name: Utilisation d’immunomarquage pour analyser des Microtubules stables et dynamiques naissants dans l’embryon de poisson zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Découvrez les méthodes d'immunomarquage pour analyser les microtubules stables et dynamiques dans le cerveau en développement de Danio rerio. Cette technique optimise la détection et la quantification in situ des populations de microtubules.

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La microscopie confocale a été achetée avec des fonds de l’US National Science Foundation (NSF), subvention #DBI-0722569. La recherche a été financée par le U.S. National instituts de santé/National Institute of General Medical Sciences (NIH/NIGM) grant #GM085290 et le département américain de la défense (DOD) subvention #W81XWH-16-1-0466 décerné à Mr Brewster. E. Vital a été financée par une subvention de UMBC du Howard Hughes Medical Institute à travers le niveau préuniversitaire et programme d’enseignement de premier cycle sciences, subvention #52008090. S.P. Brown a été pris en charge par un département américain de l’éducation GAANN Fellowship, une bourse d’études supérieures Meyerhoff financé par subvention de NIH/NIGM, #GM055036 et un assistanat de recherche financé par le DOD américain grant #W81XWH-16-1-0466.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Actuellement, il existe de nombreuses méthodes d’imagerie dynamique de MT dans le développement précoce de poisson-zèbre, allant de l’imagerie live de molécules marqués à immunomarquage de fixe tissu11,12,13,14. Bien que MTs dans une seule cellule peuvent exister dans les États stables ou dynamiques, épithélialisation est un processus dans lequel les MTs sont stabilisés progressivement au fil d...

Les microtubules (MTs) sont des polymères de α - et β-tubuline qui s’assemble en protofilaments linéaire, dont plusieurs se combinent pour former un tube creux1,2. MTs sont des structures polarisées, avec l’essor de plus fins et croissance lente moins les extrémités qui sont ancrées à centrosome ou autres organisation des microtubules center (MTOC)3. De novo Formation de MT est initiée par nucléation à l’anneau γ-tubuline complexe (γ-TURC), qui fournit un modèle pour les MT Assemblée4. Dans une cellule donnée, deux populations de MTs se distinguées ce tour-ci au fil à des vitesses différentes. Dynamiques MTs explorent leur environnement cellulaire par la commutation entre les phases de croissance et de rétrécissement dans un processus appelé instabilité dynamique5. Contrairement aux MTs dynamiques, stables MTs sont non productrices et ont une demi-vie plus longue que la dynamique MTs6.

Des décennies de recherche en biologie cellulaire a fourni une sophistiqué panoplie d’outils pour étudier la fonction et la structure de la MT et a donné lieu à un vaste corpus de connaissances sur ces éléments du cytosquelette. Par exemple, MTs jouent un rôle central dans l’établissement et le maintien de la polarité cellulaire, qui est attribuable non seulement à leur polarité intrinsèque, mais aussi à la distribution subcellulaire différentielle des stable versus dynamique MTs7, 8. en revanche, beaucoup moins est entendu sur l’architecture de MT et de fonctionner dans des environnements de (3-d) en trois dimensions plus complexes, tels que les embryons de vertébrés, en partie en raison de relever le défi de l’imagerie du cytosquelette MT à haute résolution. Malgré cette limitation, la récente génération de GFP-transgénique exprimant les lignes que MTs de l’étiquette ou une expression transitoire de marqueurs de MT fluorescent-étiquetées a augmenté notre compréhension des changements dynamiques qui subissent une MTs et leur cellulaire et rôle de développement de l’embryon de poisson zèbre. L’ensemble du réseau MT peut être photographié sur des lignées transgéniques dans laquelle tubuline est soit directement marqué9 ou tubuline polymères sont indirectement étiquetés à l’aide de protéines associées à la MT Doublecortin-like-kinase (Dclk) ou Ensconsin (EMTB)10, 11. Autres lignes (et constructions) ont été générées qui permet d’évaluer des polarité intrinsèque MT par marquage spécifiquement MT plus fins ou ancrées à un centrosome moins les extrémités11,12,13, 14. la puissance de ces outils réside dans la possibilité d’étudier la dynamique de la MT en direct, les organismes de développement. Ces études ont révélé, par exemple, la distribution spatiale et dynamique de MTs dans les populations de cellules spécifiques, l’orientation du mitotique broches en tissus subissant la morphogenèse (indicateur du plan de division cellulaire), la polarité du polymère MT en ce qui concerne les processus tels que l’élongation cellulaire et de la migration et les taux de croissance MT déterminé par comète vitesse9,13,15. La limitation de ces outils est qu’ils ne sont pas facilement discriminatoires entre les populations stables et dynamiques de MT.

Puisant dans la littérature de biologie cellulaire riche, méthodes d’immunomarquage à l’image des MTs stables et dynamiques dans l’embryon de poisson zèbre sont décrites ici, qui sont complémentaires à l’usage des lignées transgéniques. La généralisation de ces méthodes d’immunomarquage dans le poisson-zèbre a été quelque peu gênée par la difficulté à préserver l’intégrité de la MT au cours de la procédure de fixation. 1 Protocole décrit une méthode optimisée d’immunomarquage total, dynamique, et MTs stables dans les sections du développement postérieur de poisson-zèbre efficaces. En outre, une méthode simple utilisant commercialement logiciels disponibles sont décrite afin de quantifier ces populations de MT. MTs stables sont distinguent des MTs dynamiques basés sur plusieurs modifications post-traductionnelles de α-tubuline, tels que l’acétylation et détyrosination, qui s’accumulent sur les MTs stables au fil du temps16,17. Chez l’embryon de poisson zèbre, acétylation apparaît au MTs ciliaires et axonales alors pas stable interphase MTs18, limiter l’utilité de ce marqueur à un sous-ensemble de MTs stabilisées. En revanche, détyrosination semble se produire sur toutes les MTs stables dans l' embryon de poisson zèbre18. Cette modification post-traductionnelle expose l’acide glutamique carboxy-terminale de le α-tubuline (tubuline détyrosinée)18 et peut être détectée à l’aide d’anti-Glu-tubuline19. Bien que détyrosination se produit préférentiellement sur MTs stables, des preuves expérimentales indiquent que cette modification post-traductionnelle est un résultat de, plutôt qu’une cause de, MT stabilité16. La population de MT réciproque, composée de MTs dynamiques, se distingue à l’aide d’un anticorps, anti-Tyr-tubuline, qui reconnaît spécifiquement la forme tyrosinée de tubuline α19. Après l’immunomarquage avec ces marqueurs et imagerie confocale, l’analyse quantitative des MTs (longueur, nombre et abondance relative) est possible dans des régions définies du tube neural en voie de développement. Une méthode simplifiée est fournie ici pour réaliser cette analyse à l’aide de logiciels de traitement d’images 3D. Cette méthode peut être appliquée pour répondre aux questions au sujet de la morphogénèse et la création ou la maturation des cellules polarité20. En effet, l’élaboration de tableaux polarisées de MTs stables accompagne de nombreuses manifestations du développement, y compris les photorécepteurs morphogenèse21, épithélialisation des cellules dans le développement du tube neural18 et axon formation8.

Protocole n° 2 décrit une adaptation in vivo d’une épreuve de biologie cellulaire pour analyser des MTs au cours de leur Assemblée phase (/ l’ancrage de la nucléation et croissance)22,23. Naissantes MTs sont nucléés à centrosome et par la suite fixés au subdistal appendices de la mère centriole23. On décrit une méthode pour analyser naissant MT repousse après la dépolymérisation. Ce protocole fournit des détails sur le traitement de la nocodazole pour dépolymériser MTs, la procédure de lavage des drogues et la période de récupération après le traitement. MT repousse est contrôlée à intervalles régulierslavage post s par immunomarquage avec des marqueurs pour MTs totales (anti-β-tubuline) aux côtés de marqueurs pour le centrosome (anti-γ-tubuline) et noyau (4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)), selon les procédures décrites dans le protocole 1. L’étape de dépolymérisation MT du présent protocole est essentielle car elle permet d’évaluation de la croissance de MT de novo plutôt qu’extension de MTs préexistants. Cette technique est donc distincte des autres procédures publiées pour mesurer les taux de croissance de MT (en absence de dépolymérisation) à l’aide d’un marqueur plus comme l’ailier liaison protéine 3 fondue à la protéine fluorescente verte (GFP-EB3), comme illustré dans la Tran et al., 11de 2012. En outre, ce test est particulièrement utile pour analyser les embryons défectueux en Assemblée de novo MT, tels que les mutants de NEDD1 rapportées antérieurement, dans lequel le recrutement de la γ-tubuline à centrosome est entravé, ayant pour résultat incomplet la formation du tube neural et défauts neuronale24.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td></td><td></td><td>Utilisé pour traiter les pétridis.&nbsp ; &nbsp ; Préparez 1 % d’agarose en chauffant une solution de&nbsp ; 1 gramme d’agarose par 100 ml de milieu embryonnaire 1X dans un micro-ondes jusqu’à polymérisation.</td></tr><tr><td>Kpipes</td><td>Sigma</td><td>P7643</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot ; 2H2O</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Bioanalytiques américains</td><td>AB01424</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670-500G</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP1605</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x</td><td>American Bioanalyticals</td><td>AB02025</td><td></td></tr><tr><td>Montage anti-décoloration moyen</td><td>Invitrogen</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Souris anti-&bêta ;-tubuline</td><td>Etudes développementales Hybridoma Bank</td><td>E7</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Lapin anti-&gamma ;-tubuline</td><td>Genetex</td><td>GTX113286</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Lapin anti-&alpha ;-tubuline</td><td>Genetex</td><td>GTX108784</td><td>1/1000*</td></tr><tr><td>Lapin anti-détyrosinée-tubuline</td><td>Millipore</td><td>AB3201</td><td>1/200-1/1000*&nbsp ; Titrer l’anticorps lors de la première utilisation du nouveau lot.</td></tr><tr><td>Lapin anti-tyrosiné-tubuline</td><td>Millipore</td><td>ABT171</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Souris anti-centrine</td><td>Millipore</td><td>04-1624</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Chèvre 488 anti-lapin</td><td>Thermofisher</td><td>A11008</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Chèvre 594 anti-lapin</td><td>Thermofisher</td><td>A11012</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Chèvre 594 anti-souris</td><td>Thermofisher</td><td>A11005</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Chèvre 488 anti-souris</td><td>Thermofisher</td><td>A11001</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Vibratome Vibratome</td><td></td><td>1500</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>555227F</td><td></td></tr><tr><td>100 mm boîte de Pétri</td><td>Cell treat</td><td>229693</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Boîte de Pétri</td><td>Cell</td><td>treat 229638</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tube de faucon</td><td>Fisher</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Maille de nylon tissée 70 um</td><td>Amazon.com</td><td>B0043D1SZG&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Pipette en verre</td><td>Fisher</td><td>NC-999363-9</td><td></td></tr><tr><td>Mastic d’aquarium</td><td>Amazon.com, par MarineLand</td><td>Silicone Sealer 1 oz (Tube)&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Support d’anneau</td><td>Fisher</td><td>14-675BO</td><td></td></tr><tr><td>Tube en PTFE Microbore, 0.022"ID</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-06417-21</td><td></td></tr><tr><td>Pâte à modeler</td><td>Amazon.com</td><td>Sargent Art 22-4000</td><td>N’importe quelle pâte à modeler non toxique à base de cire ou d’huile suffira</td></tr><tr><td>Clamp</td><td>Fisher</td><td>02-215-466</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 60ml</td><td>Fisher</td><td>14-820-11</td><td></td></tr><tr><td>Milieu embryonnaire (E3)</td><td></td><td></td><td>34,8 g NaCl 1,6 g KCl 5,8 g CaCl2&middot ; 2H2O 9,78 g MgCl2&middot ; 6H2O Pour préparer un bouillon 60X, dissolvez les ingrédients dans H2O, jusqu’à un volume final de 2 L. Ajustez le pH à 7,2 avec du NaOH. Autoclave. Pour préparer 1X medium, diluer 16,5 mL de la pâte 60X à 1 L.</td></tr><tr>Solution <td></td><td></td><td>bloquante</td><td>50 ml TBS-NP-40 2,5 ml sérum de chèvre normal 1 g BSA 625 &micro ; l Triton-X</td></tr><tr><td>TBS-NP-40 (pH 7,6)</td><td></td><td></td><td>155 mM NaCl 10 mM Tris HCl 0,1 % NP-40</td></tr><tr><td>2x MAB (pH 6,4)</td><td></td><td></td><td>160 mM KPIPES 10 mM EGTA 2 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Logiciel commercial de traitement d’images 3D</td><td>PerkinElmer</td><td>Volocity (V 6.2)</td><td></td></tr><tr><td>Chauffage par blocs secs&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>12621-108</td><td>Utilisé comme plaque chauffante pour faire fondre l’agarose dans le Protocole 1.</td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>Leica</td><td>MZ12</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>Moule d’enrobage plat</td><td>emsdiasum.com</td><td>BEEM 70904-01</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de traitement d’images du domaine public</td><td>NIH</td><td>ImageJ (V 1.5)</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">* Le succès varie selon le numéro de lot</td></tr></tbody></table>

utilisation d’immunomarquage pour analyser des microtubules stables et dynamiques naissants dans l’embryon de poisson zèbre

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Les microtubules (MTs) sont des structures dynamiques et fragiles qui sont difficiles à image in vivo, en particulier chez les embryons de vertébrés. Immunomarquage méthodes sont décrites ici pour analyser des populations distinctes de MTs dans le développement du tube neural de l’embryon de poisson zèbre. Alors que l’accent est mis sur les tissus nerveux, cette méthodologie est largement applicable à d’autres tissus. Les procédures sont optimisés pour les dès le début à mi-somitogenèse-stade embryons (1 somite à 12 somites), cependant ils peuvent être adaptés à un éventail d’autres stades avec des ajustements relativement mineurs. Le premier protocole fournit une méthode pour évaluer la distribution spatiale des MTs stables et dynamiques et d’effectuer une analyse quantitative de ces populations avec logiciel de traitement d’image. Cette approche vient compléter les outils existants à la dynamique des microtubules image et de la distribution en temps réel, en utilise des lignées transgéniques ou expression transitoire de constructions étiquetées. En effet, ces outils sont très utiles, mais ils ne distinguent pas facilement MTs dynamiques et stables. La capacité de l’image et d’analyser ces populations distinctes de microtubules a des implications importantes pour la compréhension des mécanismes qui sous-tendent la polarisation de la cellule et la morphogenèse. Le deuxième protocole décrit une technique pour analyser spécifiquement les MTs naissantes. Ceci est accompli en capturant les propriétés de croissance de novo de MTs au fil du temps, suite à la dépolymérisation des microtubules avec la nocodazole de drogue et une période de récupération après le lavage de la drogue. Cette technique n’a pas encore été appliquée à l’étude des MTs chez les embryons de poisson-zèbre, mais est un test utile pour étudier la fonction in vivo des protéines impliquées dans l’assemblage des microtubules.

Analyse des MTs stables et dynamiques à l’aide d’immunomarquage Dans le Protocole N° 1, la répartition des sous-populations MT au cours de début (neural quille) et stades avancés (tige neurales) du développement du tube neural se révèle, à l’aide de Glu-tubuline et Tyr-tubuline comme marqueurs pour MTs stables et dynamiques, respectivement. Dynamiques MTs prédominent dans le cerveau postérieur au stade de la quille neuronal (4-5 somites) (<strong class...

Immunomarquage des méthodes pour analyser des populations distinctes des microtubules dans le cerveau en développement du poisson zèbre sont décrites ici, qui sont largement applicables à d’autres tissus. Le premier protocole décrit une méthode optimisée d’immunomarquage des microtubules stables et dynamiques. Le deuxième protocole fournit une méthode pour l’image et de quantifier les microtubules naissants spécifiquement.

Utilisation d’immunomarquage pour analyser des Microtubules stables et dynamiques naissants dans l’embryon de poisson zèbre

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

L'objectif général de ces procédures de marquage est d'imaginer et de quantifier les microtubules stables, dynamiques et naissants dans l'embryon de poisson zèbre en développement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie du développement, comme la manière dont les microtubules contribuent à l'établissement de la polarité cellulaire. Le principal avantage de cette technique est qu'elle optimise la détection et la quantification in situ de populations distinctes de microtubules.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés en raison des contraintes liées au maintien de l'intégrité des microtubules. Après avoir déchloré les embryons de poisson zèbre étalonnés conformément au protocole décrit, transférez-les dans des tubes de centrifugation de 1,5 mL en éliminant autant que possible le milieu. Ajoutez un millilitre de PFA à 4 % dans un tampon de polymérisation des microtubules ou MAB, afin de fixer les embryons à 28,5 °C pendant cinq minutes.Ensuite, utilisez une pipette pour aspirer le fixateur et le remplacer par un millilitre de fixateur frais. Incubez les échantillons sur un agitateur rotatif à température ambiante pendant trois heures. Aspirez le fixateur et ajoutez un millilitre de tampon TBS NP-40.Agiter doucement les embryons sur un agitateur rotatif pendant cinq minutes. Répéter le lavage deux fois supplémentaires. Ensuite, après avoir remplacé le tampon par un millilitre de TBS NP-40 frais, conserver les embryons à quatre degrés Celsius pendant un maximum de sept jours.Après avoir retiré le vitellus et inclus les embryons dans de l'agarose selon le protocole décrit, placez la boîte de sectionnement remplie de TBS NP-40, puis utilisez un vibratome pour obtenir des sections de 40 micromètres selon l'axe le plus long des embryons inclus dans l'agarose. À l’aide de pinces fines, transférez les sections d’intérêt dans 500 microlitres de TBS NP-40 placés dans une plaque de 24 puits. Éliminez le tampon, puis ajoutez 500 microlitres de solution de blocage.Agiter ensuite les sections à température ambiante pendant au moins une heure. Remplacer la solution de blocage par 300 microlitres d'anticorps primaires dilués dans le tampon de blocage et incuber les échantillons sur un agitateur à quatre degrés Celsius pendant 36 à 72 heures. Utiliser 600 microlitres de TBS NP-40 pour laver les échantillons deux fois.Les placer sur un agitateur à température ambiante pendant 30 minutes chacune. Ajouter 300 microlitres d'anticorps secondaires marqués par un fluorophore, dilués dans du tampon de blocage, sur les sections et les incuber à l'abri de la lumière sur un agitateur à quatre degrés Celsius pendant 16 à 24 heures. Laver ensuite les échantillons deux fois comme vient d'être montré.Ensuite, ajoutez 500 microlitres de solution de DAPI aux embryons et incubez-les à température ambiante pendant 30 minutes. Puis, utilisez du TBS NP-40 pour laver les échantillons trois fois à température ambiante pendant cinq minutes. Après les lavages, déposez une goutte de milieu de montage contenant un agent anti-décoloration au centre d'une lame exempte de poussière.Utilisez des pinces fines pour transférer les sections sur la goutte de milieu de montage. Ensuite, placez une lame couvre-objet sans poussière par-dessus l'échantillon. Conservez les lames enveloppées dans du papier d'aluminium, dans un endroit sec, sombre et frais jusqu'à l'acquisition des images.En utilisant les détails décrits dans le protocole écrit, acquérez des images confocales en coupes Z avec les réglages de canaux adaptés aux fluorochromes des anticorps secondaires sélectionnés, puis enregistrez les fichiers d'images. À l’aide d’un logiciel d’analyse 3D tel qu’ImageJ, ouvrez une copie du fichier de données. Créez une image fusionnée en superposant les canaux d’intérêt en sélectionnant image, couleur, fusionner les canaux.Sélectionnez les canaux 594 nanomètres, 488 nanomètres et DAPI pour leur attribuer respectivement les couleurs fausses rouge, verte et bleue. Cochez, créez un composite et sélectionnez, puis cliquez sur OK. Visualisez la pile z fusionnée comme une image 2D unique en effectuant une projection d'intensité maximale de la pile z à l'aide de images, pile, projection z.Entrez les positions de départ et d'arrivée des plans z internes optimaux comme coupe de départ et coupe d'arrêt respectivement. Sélectionnez l'intensité maximale comme type de projection, puis cliquez sur OK. Dans le logiciel d'analyse 3D, sélectionnez « créer une bibliothèque » et attribuez un nom descriptif à la bibliothèque d'images.Cliquez, créez et faites glisser les fichiers d'image brute dans la bibliothèque. Ensuite, sélectionnez un fichier à analyser. Puis, dans le menu Affichage, choisissez la mise au point étendue pour afficher l'image fusionnée des canaux dans la fenêtre principale.Sélectionnez l'outil de région d'intérêt (ROI) à main levée et délimitez la zone à analyser. Sélectionnez l'onglet actions, puis recadrer à la sélection afin de rogner l'image. Ensuite, enregistrez le fichier image recadré sous un nouveau nom.Ensuite, cliquez sur l'onglet mesures pour créer le protocole de filtration des objets spécifiques relatifs à l'analyse en 3D. Faites ensuite glisser l'outil « trouver des objets » vers la fenêtre du protocole et renommez le premier protocole « DAPI ». Sélectionnez le canal de la bêta-tubuline dans le menu déroulant.Ensuite, faites glisser les paramètres suivants vers le protocole de la bêta-tubuline et placez-les sous « trouver les objets » dans l'ordre suivant : remplir les trous et les objets, séparer les objets en contact, exclure les objets par taille et exclure ceux qui ne touchent pas les régions d'intérêt (ROIs). Sélectionnez maintenant « mesurer » en bas de chaque protocole.Ensuite, pour tous les canaux sauf DAPI, sélectionnez la mesure de l'intensité et du volume ainsi que la longueur squelettique pour toutes les étiquettes de tubuline. Dessinez une région d'intérêt (ROI) autour de la zone à mesurer. Sous l'onglet résumé, observez les mesures une fois que le logiciel a traité la région.Ensuite, copiez les données et enregistrez-les dans un tableur utilisable comme indiqué ici. Pour construire un appareil à écoulement multipuits, utilisez un gabarit ou une scie à ruban pour diviser longitudinalement un tube à centrifuger de 50 millilitres en deux moitiés. À partir d'une maille en nylon de 70 micromètres, découpez sept demi-cercles ayant un rayon de trois centimètres et ajustez-les pour qu'ils s'insèrent fermement dans une moitié du tube à centrifuger fendu.À l’aide d’un scellant en silicone sûr pour aquarium, fixer les demi-cercles à l’intérieur du tube à centrifuger parallèlement aux graduations de 10 millilitres. Après avoir laissé l’appareil sécher pendant deux jours, le rincer en le faisant tremper dans un bécher d’eau pendant deux à trois heures. Garnir l’extrémité supérieure filetée du tube à centrifuger découpé avec de l’argile à modeler, de sorte que la hauteur du liquide retenu dans le dispositif de filtration atteigne un quart de pouce de profondeur.Préparez l'appareil de lavage en retirant le piston d'une seringue de 50 millilitres et en insérant 30 centimètres de tube fin dans l'embout. Enfoncez le tube aussi loin que possible et utilisez de la pâte à modeler pour sceller le raccord. À l'aide du milieu pour embryons, humidifiez préalablement la maille afin de permettre au liquide de s'écouler à travers tout le dispositif en circulation continue.Inclinez l'appareil sur de la glace de manière à ce que le liquide pénètre dans tous les compartiments, tout en s'écoulant par l'avant où se trouve le rebord en argile. Suspendez l'appareil de lavage à un support sur trépied, au-dessus du dispositif d'écoulement, et placez le tout sur de la glice. Refroidissez 200 millilitres de milieu pour embryon sur de la glace, puis versez-en suffisamment dans l'appareil de lavage pour éliminer toutes les bulles d'air et obtenir un débit d'écoulement d'environ sept millilitres par minute.Réglez le débit en modifiant la hauteur de la seringue. Après avoir désinfecté les embryons et préparé la nocodazole selon le protocole décrit, utilisez 10 millilitres de solution working de nocodazole froide pour remplacer le milieu des embryons du groupe traité à la nocodazole. Placez les boîtes de Pétri sur de la glace pendant une durée appropriée selon le stade de développement.Ensuite, à l’aide d’une pipette en verre de un millilitre dont l’embout a été poli à la flamme, transférer les embryons vers l’appareil à écoulement continu en utilisant des compartiments séparés pour chaque groupe expérimental. Commencer le lavage du nocodazole en versant du milieu pour embryons préalablement refroidi sur glace dans la partie supérieure de la seringue de 50 millilitres. Laisser les microtubules se régénérer après 20 minutes de lavage à température ambiante, en utilisant une pipette en verre de un millilitre dont l’embout a été poli à la flamme pour transférer les embryons vers des boîtes de Pétri en verre contenant du milieu pour embryons tiède.Dès que les embryons sont transférés, déclenchez un chronomètre. Enfin, fixez les embryons témoins et de lavage après une, cinq et dix minutes en pipetant environ 10 embryons dans un tube de centrifugation de 1,5 millilitre rempli d’un millilitre de fixateur MAB à 4 % de PFA, puis fixez les échantillons comme indiqué précédemment dans cette vidéo. Utilisez la glu-tubuline et la tyr-tubuline comme marqueurs des microtubules stables et dynamiques.On observe que les microtubules dynamiques prédominent dans le cerveau postérieur au stade de plaque neurale. Lorsque la plaque évolue en tube neural, stade caractérisé par une épithélialisation accrue, un nombre qualitativement moindre de microtubules est immunoréactif avec l'anticorps anti-tyr-tubuline, en particulier dans le tube neural ventral. En revanche, la glu-tubuline est dispersée et ponctuelle dans toute la plaque neurale, mais elle est enrichie dans le tube neural ventral le long du trajet des microtubules.Les têtes de flèches indiquent des faisceaux ou structures microtubulaires spécifiques où le marquage est accru. Le traitement à la nocodazole dépolymérise les microtubules, entraînant un marquage diffus. Lorsque les microtubules repoussent, ils s'étendent à partir du centrosome.Cependant, cela peut ne pas être évident sur un seul plan en raison de leurs trajectoires non planaires. Néanmoins, certains logiciels d'analyse d'images sont capables de mesurer des longueurs en 3D, permettant ainsi d'évaluer la croissance des microtubules après le lavage du nocodazole. La longueur moyenne des microtubules semble augmenter au fil du temps après le lavage du nocodazole dans toutes les régions du tube neural analysées.Une fois l'analyse des données terminée à l'aide du logiciel d'analyse d'images 3D et après contrôle de qualité, des informations utiles peuvent être extraites des données brutes, telles que la longueur moyenne des microtubules totaux et des microtubules stables, ainsi que le rapport entre microtubules stables et microtubules totaux. Une fois maîtrisée, cette technique ne prend pas plus d'une semaine du début à la fin. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de collecter et de traiter les échantillons dans les délais appropriés, car les microtubules se dépolymérisent facilement.Cette procédure peut également être appliquée à l'analyse de mutants. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment capturer des populations distinctes de microtubules dans l'embryon intact.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

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L&#39;étiquetage et l&#39;imagerie des cellules dans le cerveau postérieur Zebrafish

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en cours d&#39;analyse<em&gt; In Vivo</em&gt; Migration cellulaire en utilisant Transplantations cellulaires et imagerie time-lapse en Zebrafish Embryons

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