Name: Microcristallographie des cristaux de protéines et Dans Cellulo Diffraction (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Découvrez la microcristallographie des protéines in vivo dans des cellules vivantes. Cette méthode simplifie la production et l'analyse des microcristaux sans purification complexe, facilitant l'accès à la cristallographie aux rayons X.

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Les auteurs souhaitent remercier Chan-Sien Lay pour avoir fourni des images de microcristaux purifiés, Daniel Eriksson et Tom Caradoc-Davies pour le soutien de la ligne MX2 du Synchrotron australien, et Kathryn Flanagan et Andrew Fryga de l&#39;installation FlowCore à l&#39;Université Monash pour leur Aide inestimable.

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<li>Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-crystallography+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Micro-crystallography comes of age.</a> Curr Opin Struct Biol. 22 (5), 602-612 (2012).</li>
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<li>Coulibaly, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atomic+structure+of+baculovirus+polyhedra+reveals+the+independent+emergence+of+infectious+crystals+in+DNA+and+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The atomic structure of baculovirus polyhedra reveals the independent emergence of infectious crystals in DNA and RNA viruses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22205-22210 (2009).</li>
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<li>Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+Cryo-cooling+Crystals+of+Membrane+Proteins+Grown+in+Lipidic+Mesophases+for+Structure+Determination+by+Macromolecular+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li>
<li>Roedig, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+micro-patterned+silicon+chip+as+sample+holder+for+macromolecular+crystallography+experiments+with+minimal+background+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering.</a> Sci Rep. 5, 10451(2015).</li>
<li>Koopmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+crystallization+opens+new+routes+in+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology.</a> Nature Methods. 9 (3), 259-262 (2012).</li>
<li>Gallat, F. -X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+crystallography+at+X-ray+free-electron+lasers%3A+the+next+generation+of+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Phil+Trans+R+Soc+B%22%5BJournal%5D)">In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology.</a> Phil Trans R Soc B. 369 (1647), 20130497(2014).</li>
<li>Duszenko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+crystallization+in+combination+with+highly+brilliant+radiation+sources+offers+novel+opportunities+for+the+structural+analysis+of+post-translationally+modified+eukaryotic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst.+F%22%5BJournal%5D)">In vivo protein crystallization in combination with highly brilliant radiation sources offers novel opportunities for the structural analysis of post-translationally modified eukaryotic proteins.</a> Acta Cryst. F. 71 (8), 929-937 (2015).</li>
<li>Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+cellulo+structure+determination+of+a+novel+cypovirus+polyhedrin%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin.</a> Acta Cryst D. 70 (5), 1435-1441 (2014).</li>
<li>Sawaya, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+crystal+structure+obtained+at+2.9+%C3%85+resolution+from+injecting+bacterial+cells+into+an+X-ray+free-electron+laser+beam%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protein crystal structure obtained at 2.9 Å resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (35), 12769-12774 (2014).</li>
<li>Tsutsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Diffraction-Quality+Protein+Crystal+Processed+as+an+Autophagic+Cargo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A Diffraction-Quality Protein Crystal Processed as an Autophagic Cargo.</a> Mol Cell. 58 (1), 186-193 (2015).</li>
<li>Boudes, M., Garriga, D., Fryga, A., Caradoc-Davies, T., Coulibaly, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pipeline+for+structure+determination+of+in+vivo-grown+crystals+using+in+cellulo+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">A pipeline for structure determination of in vivo-grown crystals using in cellulo diffraction.</a> Acta Cryst D. 72, 576-585 (2016).</li>
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<li>Hasegawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+crystallization+of+human+IgG+in+the+endoplasmic+reticulum+of+engineered+Chinese+hamster+ovary+%28CHO%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo crystallization of human IgG in the endoplasmic reticulum of engineered Chinese hamster ovary (CHO) cells.</a> J Biol Chem. 286 (22), 19917-19931 (2011).</li>
<li>Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Delivery+of+Protein+Microcrystals+in+Lipidic+Cubic+Phase+for+Serial+Femtosecond+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography.</a> J Vis Exp. (115), e54463(2016).</li>
<li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MeshAndCollect%3A+an+automated+multi-crystal+data-collection+workflow+for+synchrotron+macromolecular+crystallography+beamlines%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst.+D%22%5BJournal%5D)">MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines.</a> Acta Cryst. D. 71, 2328-2343 (2015).</li>
<li>Fan, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcineurin+crystals+formed+using+the+baculovirus+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Micros+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system.</a> Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).</li>
<li>Nass, K. <a target="_blank" href="NULL">Investigation of protein structure determination using X-ray free-electron lasers</a>. , Hamburg University. PhD dissertation (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Ce protocole fournit deux approches pour analyser les microcristaux dans le but de faciliter l&#39;analyse de très petits cristaux qui auraient été négligés par le passé. Mesures critiques pour la purification du microcristal Le protocole présenté a été optimisé en utilisant la polyhédrine Bombyx mori CPV1 exprimée dans les cellules Sf9 en tant que système modèle. Cependant, les microcristaux in vivo présentent une grande variabilité dans la...

L&#39;utilisation de la cristallographie aux rayons X pour la détermination des structures à haute résolution des macromolécules biologiques a connu une progression constante au cours des deux dernières décennies. L&#39;adoption croissante de la cristallographie par rayons X par des chercheurs non experts illustre la démocratisation de cette approche dans de nombreux domaines des sciences de la vie 1 . Historiquement, les cristaux ayant des dimensions inférieures à ~ 10 μm ont été considérés comme difficiles, sinon inutilisables, pour la détermination de la structure. La disponibilité croissante de rayons microfocus dédiés sur les sources de rayonnement synchrotron à l&#39;échelle mondiale et les progrès technologiques, tels que le développement d&#39;outils pour manipuler les microcristaux, ont éliminé une grande partie de ces barrières qui empêchaient l&#39;utilisation étendue de la microcristallographie aux rayons X. Les progrès de la microcrystallographie en série X 2 , 3 et la diffraction micro-électronique 4 haNous avons montré que l&#39;utilisation de micro et nanocristaux pour la détermination de la structure n&#39;est pas seulement possible mais aussi parfois préférable à l&#39;utilisation de gros cristaux 5 , 6 , 7 . Ces progrès ont d&#39;abord été appliqués à l&#39;étude des peptides 8 et des cristaux naturels produits par les virus des insectes 9 , 10 . Ils sont maintenant utilisés pour une gamme variée de macromolécules biologiques, y compris les systèmes les plus difficiles tels que les protéines membranaires et les grands complexes 11 . Pour faciliter l&#39;analyse de ces microcristaux, ils ont été analysés dans le méso , en particulier les protéines membranaires 12 et dans les puces microfluidiques 13 . La disponibilité de ces nouvelles méthodes de microcristallographie a soulevé la possibilité d&#39;utiliser enCristallisation vivante comme nouvelle voie pour la biologie structurale 14 , 15 , 16 offrant une alternative à la cristallogénèse classique in vitro . Malheureusement, même lorsque des cristaux in vivo peuvent être produits, plusieurs obstacles demeurent tels que la dégradation ou la perte de ligands lors de la purification des cellules, la difficulté de manipulation et de visualisation des cristaux à la ligne du synchrotron et des expériences fastidieuses de diffraction des rayons X. Comme une alternative, les cristaux ont également été analysés directement dans la cellule sans aucune étape de purification 17 , 18 , 19 . Une analyse comparative suggère que, dans les approches cellulo , peut être plus efficace que l&#39;analyse des cristaux purifiés et produire des données de résolution supérieure 20 . Ce protocole est enOnt tendance à aider les chercheurs nouveaux à la microcristallisation des protéines. Il fournit des méthodologies axées sur la préparation et la manipulation des échantillons pour les expériences de diffraction des rayons X à une ligne de rayonnement synchrotron. Deux options sont proposées en utilisant des cristaux isolés pour la microcristallographie classique ou des cellules contenant des cristaux triés par cytométrie de flux pour l&#39;analyse cellulo ( Figure 1 ).

<table><tbody><tr><td>Sf9 cells</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SF900-SFM milieu pour insectes</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 L flacon de culture cellulaire</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubateur à secousses pour la culture cellulaire d’insectes</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubes coniques</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse avec godets pivotants pour 50 mL tubes</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator équipé d’une sonde de 19 mm</td><td>MSE Soniprep 150&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lames de verre</td><td>Hampton Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hémacytomètre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iodure de propidium</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Trieur de cellules d’influx&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hampton Les tamis à atomes lourds</td><td>Hampton Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromesh</td><td>Mitigen</td><td></td><td>700/25 mesh offrent une plus grande surface. Des maillages indexés peuvent être achetés pour des études systématiques.</td></tr><tr><td>Mèche en papier</td><td>Mitigen</td><td></td><td>La taille de la mèche en papier peut être modifiée pour un écoulement optimal. Cela dépendra en grande partie de la nature des cristaux et du cryoprotecteur utilisés.</td></tr><tr><td>Éthylène glycol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MX2 ligne de faisceau microfocale</td><td>Synchrotron</td><td></td> australien <td>Une liste des lignes de faisceau microfocales disponibles se trouve dans Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793&ndash ; 1806, doi :10.1071/CH14455.</td></tr></tbody></table>

microcristallographie des cristaux de protéines et<em&gt; dans cellulo</em&gt; diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

L&#39;avènement de lignes de feu de microfocus de haute qualité dans de nombreuses installations synchrotron a permis l&#39;analyse de routine de cristaux inférieurs à 10 μm dans leur plus grande dimension, ce qui représentait un défi. Nous présentons deux flux de travail alternatifs pour la détermination de la structure des microcristaux protéiques par cristallographie aux rayons X avec un accent particulier sur les cristaux cultivés in vivo . Les microcristaux sont soit extraits de cellules par sonication et purifiés par centrifugation différentielle, soit analysés en cellulo après triage cellulaire par cytométrie en flux de cellules contenant des cristaux. Facultativement, les cristaux purifiés ou les cellules contenant des cristaux sont trempés dans des solutions d&#39;atomes lourds pour le phasage expérimental. Ces échantillons sont ensuite préparés pour des expériences de diffraction de manière similaire par application sur un support micromesh et refroidissement instantané dans de l&#39;azote liquide. Nous décrivons brièvement et comparons les expériences de diffraction en série de microcristaux isolés et de cristaux-Contenant des cellules à l&#39;aide d&#39;une ligne de rayonnement synchrotron microfocus pour produire des jeux de données appropriés pour la mise au point, la construction de modèles et le raffinement. Ces flux de travail sont illustrés par des cristaux de la polyhédrine Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) produits par l&#39;infection de cellules d&#39;insectes avec un baculovirus recombinant. Dans cette étude de cas, l&#39;analyse cellulo est plus efficace que l&#39;analyse des cristaux purifiés et donne une structure en ~ 8 jours de l&#39;expression au raffinement.

Un aperçu des deux méthodes alternatives pour la détermination de la structure à l&#39;aide de microcristaux in vivo est présenté ( figure 1 ). Les polyèdres peuvent être facilement purifiés par sonication et centrifugation. En raison de leur densité, ils forment une couche au bas du tube sous une couche de débris qui peut être enlevée par pipettage ( Figure 3a et 3b ). L&#39;échantillon est en...

Un protocole est présenté pour la cristallographie aux rayons X en utilisant des microcristaux protéiques. Deux exemples analysant les microcristaux végétaux in vivo après purification ou en cellulo sont comparés.

Microcristallographie des cristaux de protéines et<em&gt; Dans Cellulo</em&gt; Diffraction

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

L'objectif général de ce protocole est de présenter les méthodologies de cristallographie aux rayons X appliquées aux microcristaux, en particulier à ceux produits dans des cellules, considérés comme des cristaux in vivo. Le principal avantage de cette approche réside dans le fait qu'elle offre un processus simple et efficace pour produire, détecter et analyser les microcristaux. Cette méthode vise à faciliter l'utilisation des microcristaux en exploitant des cristaux cultivés à l'intérieur de cellules vivantes, éliminant ainsi la nécessité d'un processus complexe de purification et d'essais de sédation par Aprocox.Dans cette vidéo, nous allons nous concentrer sur la préparation et la manipulation simples pour des expériences de déviation de rayons X sur une ligne de lumière synchrotron. Nous montrons les étapes qui diffèrent le plus de la cristallographie classique. Dans cette démonstration, nous utiliserons des cristaux de la protéine du polyèdre vital cultivés avec succès, mais la méthode peut également être appliquée à des protéines formant des cristaux dans des cellules bactériennes, insectes, mammaliennes ou de levure.Incubez d'abord 30 millilitres de cellules Sf9 surexprimant la protéine de polyèdre du cypovirus pendant trois jours à 27 degrés Celsius sur une plateforme rotative. Transférez 500 microlitres de culture de cellules Sf9 dans un tube de microcentrifugeuse à l’aide d’une pipette sérologique stérile, en veillant à maintenir la stérilité de la culture principale en utilisant une cabine de sécurité biologique de classe II et en suivant les techniques aseptiques standard. Prélevez cinq microlitres de cellules à partir du tube de microcentrifugeuse et déposez-les sur une lame de verre.Ensuite, inclinez délicatement une lame de couverture en verre au-dessus de l'échantillon en posant un bord sur la goutte, puis abaissez soigneusement la lame sur le liquide, en évitant la formation de bulles d'air. Ensuite, observez la lame au microscope inversé. Examinez attentivement les cellules, en commençant par un grossissement de 200x et en augmentant au grossissement maximal lors de la détection d'un cristal éventuel.Recherchez des bords nets et des changements de réfractivité. Si des cristaux sont identifiés, examinez la culture quotidiennement pour surveiller la croissance des cristaux en répétant les étapes précédentes. Pour les cellules Sf9, récoltez-les en transférant la culture dans un tube d'ultracentrifugation.Placer le tube sur de la glace et passer à l'étape suivante dès que possible. Pour l'isolement des cellules contenant des cristaux, prélever par pipette quatre millilitres de cellules Sf9 infectées dans un tube adapté à l'analyse par cytométrie en flux. Préparer un deuxième tube contenant un nombre équivalent de cellules Sf9 provenant d'une culture non infectée (témoin).Ensuite, ajoutez de l'iodure de propidium aux deux échantillons pour obtenir une concentration finale de un microgramme par millilitre, juste avant l'analyse en cytométrie en flux. Appliquez maintenant les cellules de l'échantillon témoin à un cytomètre en flux standard capable de trier les cellules selon la FSC et la SSC. Analysez au moins 20 000 événements.Après avoir exclu les cellules mortes, les agrégats cellulaires et les débris de l'analyse, générer le graphique de la DSC par rapport à la SSC. Ensuite, analyser au moins 20 000 événements de l'échantillon contenant des cristaux. Comparer le graphique de la DSC par rapport à la SSC avec le témoin et rechercher l'apparition d'une population distincte correspondant aux cellules contenant des cristaux.Définir les fenêtres autour de la population cellulaire contenant des cristaux, qui apparaît généralement à une SSC ou une FSC plus élevée. À l’aide de ce ciblage, trier environ 150 000 à 200 000 cellules contenant des cristaux dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre prérempli avec 50 microlitres de tampon PBS. Observer les échantillons triés par microscopie optique comme décrit précédemment afin de confirmer quelle population est associée aux cellules contenant des cristaux.À ce stade, les cellules peuvent être incubées avec des solutions d'atomes lourds si un phasage expérimental est nécessaire. Cette approche suit le criblage de divers composés et des durées d'incubation, comme décrit dans le texte et dans d'autres revues. Préparez les outils pour le montage de l'échantillon en fixant d'abord une micro-grille montée sur une épingle à l'extrémité d'une baguette magnétique.Placer la baguette sur le côté dans l'entaille d'un flotteur de dialyse. Ensuite, prendre une mèche en papier avec une paire de pinces et les verrouiller. Vérifier soigneusement que le montage est complet avant de poursuivre.Maintenant, mélangez les cellules avec un volume égal de solution de bleu de trypan à 0,4 % pour obtenir une concentration finale de 0,2 %. Après avoir resuspendu les cellules, pipetez 0,5 microlitre des cellules triées sur la micro-maille. Après avoir laissé les cellules se déposer sur la surface de la micro-maille, retirez la majeure partie du liquide excédentaire en tamponnant avec une mèche en papier. Si la micro-maille n'est pas suffisamment tamponnée, les cellules se trouveront à des profondeurs différentes dans le liquide excédentaire, ce qui compliquera leur alignement par rapport au faisceau de rayons X au synchrotron.En outre, l'excès de liquide augmentera la diffusion parasite des rayons X. Si le maillage microscopique est trop essuyé, le liquide sera complètement éliminé et l'échantillon ne sera plus retenu dans les ouvertures de la grille. Avec un essuyage optimal, seule une fine couche de liquide demeure sur le maillage microscopique, protégeant l'échantillon et le forçant à pénétrer dans les ouvertures de la grille.Certains cristaux nécessiteront l'utilisation d'un cryoprotecteur. Ce n'est pas nécessaire dans notre cas, mais la procédure serait la même que pour l'application de l'échantillon, puis le séchage. Veillez à ce qu'il ne reste qu'une fine couche de liquide.Refroidissez immédiatement le quadrillage microscopique dans l'azote liquide et transférez-le vers un porte-échantillon robotisé pour son transport vers une ligne de faisceau microfocalisée de synchrotron. En raison de la petite taille des cristaux in vivo, collectez une fraction des données sur une ligne de faisceau de cristallographie microfocalisée. Commencez par monter le quadrillage microscopique sur le goniomètre.Maintenant, commencez par centrer le treillis microscopique sur le trajet du faisceau en utilisant les orientations vue de face et vue de côté. Avec le treillis microscopique en position face, affinez l'alignement en superposant le centre de l'une des voies horizontales du treillis. Acquérez les données le long de cette voie horizontale en effectuant uniquement de légers réajustements de l'alignement.Une fois que tous les cristaux de la piste ont été testés, passez à la piste suivante et répétez la procédure d'alignement. Veillez à identifier clairement les pistes déjà traitées afin de ne manquer aucun cristal ni d'irradier deux fois le même, en utilisant le changement de couleur du bleu de trypan comme guide. Une vue d'ensemble de deux méthodes de détermination de structure à l'aide de microcristaux in vivo est présentée.La rang&eacute;e sup&eacute;rieure d&eacute;crit l'approche classique impliquant la purification de cristaux &agrave; partir de cellules, tandis que la rang&eacute;e inf&eacute;rieure montre l'approche de cristallographie in cellulo qui conserve les cristaux &agrave; l'int&eacute;rieur des cellules h&ocirc;tes pendant la collecte des donn&eacute;es. Pour l'approche in cellulo, le profil de cytom&eacute;trie en flux des cellules non infect&eacute;es est compar&eacute; &agrave; celui des cellules contenant des cristaux, et cette comparaison sert &agrave; d&eacute;terminer quelle population cellulaire doit &ecirc;tre s&eacute;lectionn&eacute;e afin de trier les cellules contenant des cristaux &agrave; part des autres cellules. Dans cet exemple, les cellules contenant des poly&egrave;dres pr&eacute;sentent une diffusion lat&eacute;rale plus &eacute;lev&eacute;e que les cellules non infect&eacute;es.Les cellules colorées au bleu de trypan peuvent être facilement visualisées à l’aide de caméras disponibles sur la plupart des lignes de lumière de synchrotron. Bien que les cristaux purifiés soient difficiles à identifier et à aligner avec le faisceau de rayons X en raison de leur petite taille, il est préférable, lors de l’acquisition des données, de procéder selon un motif en grille afin de minimiser les procédures de centrage et d’éviter d’exposer deux fois la même cellule ou le même cristal, ou d’omettre certaines cellules ou cristaux. Une fois maîtrisé, ce protocole complet prend environ une demi-journée, de la récolte des cellules contenant les cristaux jusqu’à la collecte des données.Cette procédure est compatible avec les traitements par atomes lourds destinés au phasage expérimental. Dans le cas du polyèdre, la structure normale a été obtenue en huit jours à compter du début de l'expression protéique. N'oubliez pas que le travail avec l'azote liquide peut être extrêmement dangereux et que des précautions contre l'asphyxie et les brûlures doivent être prises.

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