Microcristallographie des cristaux de protéines et

L'objectif général de ce protocole est de présenter les méthodologies de cristallographie aux rayons X appliquées aux microcristaux, en particulier à ceux produits dans des cellules, considérés comme des cristaux in vivo. Le principal avantage de cette approche réside dans le fait qu'elle offre un processus simple et efficace pour produire, détecter et analyser les microcristaux. Cette méthode vise à faciliter l'utilisation des microcristaux en exploitant des cristaux cultivés à l'intérieur de cellules vivantes, éliminant ainsi la nécessité d'un processus complexe de purification et d'essais de sédation par Aprocox.

Dans cette vidéo, nous allons nous concentrer sur la préparation et la manipulation simples pour des expériences de déviation de rayons X sur une ligne de lumière synchrotron. Nous montrons les étapes qui diffèrent le plus de la cristallographie classique. Dans cette démonstration, nous utiliserons des cristaux de la protéine du polyèdre vital cultivés avec succès, mais la méthode peut également être appliquée à des protéines formant des cristaux dans des cellules bactériennes, insectes, mammaliennes ou de levure.

Incubez d'abord 30 millilitres de cellules Sf9 surexprimant la protéine de polyèdre du cypovirus pendant trois jours à 27 degrés Celsius sur une plateforme rotative. Transférez 500 microlitres de culture de cellules Sf9 dans un tube de microcentrifugeuse à l’aide d’une pipette sérologique stérile, en veillant à maintenir la stérilité de la culture principale en utilisant une cabine de sécurité biologique de classe II et en suivant les techniques aseptiques standard. Prélevez cinq microlitres de cellules à partir du tube de microcentrifugeuse et déposez-les sur une lame de verre.

Ensuite, inclinez délicatement une lame de couverture en verre au-dessus de l'échantillon en posant un bord sur la goutte, puis abaissez soigneusement la lame sur le liquide, en évitant la formation de bulles d'air. Ensuite, observez la lame au microscope inversé. Examinez attentivement les cellules, en commençant par un grossissement de 200x et en augmentant au grossissement maximal lors de la détection d'un cristal éventuel.

Recherchez des bords nets et des changements de réfractivité. Si des cristaux sont identifiés, examinez la culture quotidiennement pour surveiller la croissance des cristaux en répétant les étapes précédentes. Pour les cellules Sf9, récoltez-les en transférant la culture dans un tube d'ultracentrifugation.

Placer le tube sur de la glace et passer à l'étape suivante dès que possible. Pour l'isolement des cellules contenant des cristaux, prélever par pipette quatre millilitres de cellules Sf9 infectées dans un tube adapté à l'analyse par cytométrie en flux. Préparer un deuxième tube contenant un nombre équivalent de cellules Sf9 provenant d'une culture non infectée (témoin).

Ensuite, ajoutez de l'iodure de propidium aux deux échantillons pour obtenir une concentration finale de un microgramme par millilitre, juste avant l'analyse en cytométrie en flux. Appliquez maintenant les cellules de l'échantillon témoin à un cytomètre en flux standard capable de trier les cellules selon la FSC et la SSC. Analysez au moins 20 000 événements.

Après avoir exclu les cellules mortes, les agrégats cellulaires et les débris de l'analyse, générer le graphique de la DSC par rapport à la SSC. Ensuite, analyser au moins 20 000 événements de l'échantillon contenant des cristaux. Comparer le graphique de la DSC par rapport à la SSC avec le témoin et rechercher l'apparition d'une population distincte correspondant aux cellules contenant des cristaux.

Définir les fenêtres autour de la population cellulaire contenant des cristaux, qui apparaît généralement à une SSC ou une FSC plus élevée. À l’aide de ce ciblage, trier environ 150 000 à 200 000 cellules contenant des cristaux dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre prérempli avec 50 microlitres de tampon PBS. Observer les échantillons triés par microscopie optique comme décrit précédemment afin de confirmer quelle population est associée aux cellules contenant des cristaux.

À ce stade, les cellules peuvent être incubées avec des solutions d'atomes lourds si un phasage expérimental est nécessaire. Cette approche suit le criblage de divers composés et des durées d'incubation, comme décrit dans le texte et dans d'autres revues. Préparez les outils pour le montage de l'échantillon en fixant d'abord une micro-grille montée sur une épingle à l'extrémité d'une baguette magnétique.

Placer la baguette sur le côté dans l'entaille d'un flotteur de dialyse. Ensuite, prendre une mèche en papier avec une paire de pinces et les verrouiller. Vérifier soigneusement que le montage est complet avant de poursuivre.

Maintenant, mélangez les cellules avec un volume égal de solution de bleu de trypan à 0,4 % pour obtenir une concentration finale de 0,2 %. Après avoir resuspendu les cellules, pipetez 0,5 microlitre des cellules triées sur la micro-maille. Après avoir laissé les cellules se déposer sur la surface de la micro-maille, retirez la majeure partie du liquide excédentaire en tamponnant avec une mèche en papier. Si la micro-maille n'est pas suffisamment tamponnée, les cellules se trouveront à des profondeurs différentes dans le liquide excédentaire, ce qui compliquera leur alignement par rapport au faisceau de rayons X au synchrotron.

En outre, l'excès de liquide augmentera la diffusion parasite des rayons X. Si le maillage microscopique est trop essuyé, le liquide sera complètement éliminé et l'échantillon ne sera plus retenu dans les ouvertures de la grille. Avec un essuyage optimal, seule une fine couche de liquide demeure sur le maillage microscopique, protégeant l'échantillon et le forçant à pénétrer dans les ouvertures de la grille.

Certains cristaux nécessiteront l'utilisation d'un cryoprotecteur. Ce n'est pas nécessaire dans notre cas, mais la procédure serait la même que pour l'application de l'échantillon, puis le séchage. Veillez à ce qu'il ne reste qu'une fine couche de liquide.

Refroidissez immédiatement le quadrillage microscopique dans l'azote liquide et transférez-le vers un porte-échantillon robotisé pour son transport vers une ligne de faisceau microfocalisée de synchrotron. En raison de la petite taille des cristaux in vivo, collectez une fraction des données sur une ligne de faisceau de cristallographie microfocalisée. Commencez par monter le quadrillage microscopique sur le goniomètre.

Maintenant, commencez par centrer le treillis microscopique sur le trajet du faisceau en utilisant les orientations vue de face et vue de côté. Avec le treillis microscopique en position face, affinez l'alignement en superposant le centre de l'une des voies horizontales du treillis. Acquérez les données le long de cette voie horizontale en effectuant uniquement de légers réajustements de l'alignement.

Une fois que tous les cristaux de la piste ont été testés, passez à la piste suivante et répétez la procédure d'alignement. Veillez à identifier clairement les pistes déjà traitées afin de ne manquer aucun cristal ni d'irradier deux fois le même, en utilisant le changement de couleur du bleu de trypan comme guide. Une vue d'ensemble de deux méthodes de détermination de structure à l'aide de microcristaux in vivo est présentée.

La rangée supérieure décrit l'approche classique impliquant la purification de cristaux à partir de cellules, tandis que la rangée inférieure montre l'approche de cristallographie in cellulo qui conserve les cristaux à l'intérieur des cellules hôtes pendant la collecte des données. Pour l'approche in cellulo, le profil de cytométrie en flux des cellules non infectées est comparé à celui des cellules contenant des cristaux, et cette comparaison sert à déterminer quelle population cellulaire doit être sélectionnée afin de trier les cellules contenant des cristaux à part des autres cellules. Dans cet exemple, les cellules contenant des polyèdres présentent une diffusion latérale plus élevée que les cellules non infectées.

Les cellules colorées au bleu de trypan peuvent être facilement visualisées à l’aide de caméras disponibles sur la plupart des lignes de lumière de synchrotron. Bien que les cristaux purifiés soient difficiles à identifier et à aligner avec le faisceau de rayons X en raison de leur petite taille, il est préférable, lors de l’acquisition des données, de procéder selon un motif en grille afin de minimiser les procédures de centrage et d’éviter d’exposer deux fois la même cellule ou le même cristal, ou d’omettre certaines cellules ou cristaux. Une fois maîtrisé, ce protocole complet prend environ une demi-journée, de la récolte des cellules contenant les cristaux jusqu’à la collecte des données.

Cette procédure est compatible avec les traitements par atomes lourds destinés au phasage expérimental. Dans le cas du polyèdre, la structure normale a été obtenue en huit jours à compter du début de l'expression protéique. N'oubliez pas que le travail avec l'azote liquide peut être extrêmement dangereux et que des précautions contre l'asphyxie et les brûlures doivent être prises.