Le préconditionnement hypoxique des cellules progénitrices dérivées de la moelle en tant que source pour la génération de cellules Schwann mûres

L’objectif global de cette technique de culture cellulaire est d’enrichir les progéniteurs neuraux de la moelle osseuse afin de faciliter leur différenciation en cellules de Schwann fonctionnelles. Cette méthode répond à un problème clé en matière de cellules souches et de médecine régénérative : comment utiliser une source limitée de neuroprogéniteurs pour générer de la glie afin d’aider à la repousse axonale post-traumatique et à la remyélinisation. L’un des avantages de cette technique est l’utilisation d’un conditionnement de culture efficace pour faciliter l’expansion des cellules neurales à partir des cellules stromales de la moelle osseuse en vue de leur utilisation dans la thérapie cellulaire autologues.

Après deux jours de culture, prélever 75 % du milieu épuisé et des cellules non adhérentes et rincer les cellules adhérentes avec trois lavages PBS de 10 millimètres. Après le troisième lavage, remplacez le PBS par 10 millilitres de milieu de croissance des cellules stomales à moelle, ou CSM, et retournez la culture dans l’incubateur. Les colonies visibles devraient apparaître au sixième ou au septième jour.

Le 10e jour, lavez la culture dans du PBS frais et détachez les cellules avec 1,5 millilitre de réactif de dissociation cellulaire enzymatique recombinante. Après cinq minutes à 37 degrés Celsius, ajoutez trois millilitres de milieu de croissance MSC pour neutraliser la réaction et recueillir les cellules détachées par centrifugation. Remettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de milieu de croissance MSC frais et ensemencez les cellules à une densité de quatre fois 10 à quatre cellules par centimètre carré dans une nouvelle plaque de culture tissulaire de 10 centimètres.

Les cellules devraient atteindre 80 à 90 % de confluence dans les deux jours suivant le passage. Pour le préconditionnement hypoxique, relâchez d’abord la bague de serrage et nettoyez les pièces exposées avec de l’éthanol à 70 %. Démontez ensuite la chambre d’hypoxie en composants et placez-les dans une hotte à flux laminaire pour une stérilisation sous lumière UV pendant 15 minutes.

Ensuite, lavez une culture MSC confluente de 80 à 90 % avec 10 millilitres de PBS comme nous venons de le démontrer et traitez les cultures avec un milieu de croissance MSC frais complété par 25 millimolaires d’hepes. Placez la culture traitée dans la chambre d’hypoxie remontée et serrez la pince annulaire. Scellez les extrémités de raccordement de la chambre pour éviter toute fuite de gaz et injectez un mélange de gaz composé de 99 % d’azote et de 1 % d’oxygène dans la chambre à un débit de 10 litres par minute.

Après cinq minutes, placez la chambre dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 16 heures. Le lendemain matin, détachez les cellules comme nous venons de le démontrer et récupérez-les par centrifugation. Remettez la pastille en suspension dans un milieu progéniteur neural et ensemencez six fois 10 à la troisième cellule par centimètre carré sur des plaques à 6 puits à faible fixation pour leur culture à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant 12 jours.

De grandes sphères de cellules non adhérentes doivent être observées au sixième ou au septième jour. Avec plus de neurosphères apparentes dans les cultures conditionnées par l’hypoxie que celles sous normoxie aux jours 10 à 12. Le 12e jour, utilisez une pipette de 10 millilitres pour transférer les neurosphères dans un tube conique de 15 millilitres et recueillez les neurosphères par centrifugation.

Remettez les sphères en suspension dans DMEM/F12 et plaquez cinq à 10 neurosphères par centimètre carré sur des plaques de poly-D-lysine laminine enrobées de 6 puits dans 1,5 millilitre de milieu d’induction gliale par puits. Maintenez la culture cellulaire sphérique pendant au moins sept jours, en rafraîchissant le milieu tous les trois jours. Pour récolter les ganglions de la racine dorsale, transférez le premier embryon dans une boîte de culture de 10 centimètres contenant du PBS à température ambiante sous un microscope à dissection en position couchée et insérez une micro-pince de dissection de chaque côté de la moelle épinière.

À l’aide d’une dissection émoussée, séparez la moelle épinière des tissus mous environnants à l’aide d’une pince pour exciser la moelle épinière le long de l’ouverture du cou et du talon de la queue. Retirez les tissus mous résiduels de la moelle épinière libérée jusqu’à ce qu’il ne reste que la moelle épinière, les racines nerveuses et le ganglion de la racine dorsale attaché. Détachez les ganglions de la racine dorsale de leurs racines nerveuses de connexion.

Ensuite, utilisez un stylo à pipette équipé d’une pointe de pipette d’un millilitre pour transférer jusqu’à 100 ganglions de la racine dorsale dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre de PBS. Recueillir les ganglions par centrifugation et remettre les pastilles en suspension dans 200 microlitres de réactif de dissociation cellulaire enzymatique recombinant par tube. Après 10 minutes à 37 degrés Celsius, centrifugez à nouveau les ganglions de la racine dorsale à l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres pour triturer doucement les granules dans le milieu de maintenance des neurones du ganglion de la racine dorsale.

Ensemencez les cellules ganglionnaires de la racine dorsale à cinq fois 10 à la troisième cellules par centimètre carré sur des plaques à 6 puits enrobées de poly-D-lysine laminine dans 1,5 millilitre de milieu de maintenance des neurones du ganglion de la racine dorsale par puits. Après deux jours de culture à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2, lavez les cellules et renvoyez les cultures de cellules neuronales dans l’incubateur dans un milieu de purification de neurones du ganglion de la racine dorsale frais pendant deux jours supplémentaires. Après trois à quatre cycles d’entretien et de purification, les cultures de cellules ganglionnaires de la racine dorsale devraient être positives pour le marqueur neuronal Tuj-1 et négatives pour le marqueur des cellules gliales S100 bêta.

Le septième jour de la culture cellulaire de type cellule de Schwann, rincez les cellules dans du PBS suivi d’une dissociation avec 0,5 millilitre de réactif de dissociation cellulaire enzymatique recombinant par puits à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans un milieu de co-culture et ensemencez les cellules de type cellule de Schwann dans la culture de neurones ganglionnaires de la racine dorsale purifiée à une fois 10 à la troisième cellule par centimètre carré pendant 14 jours de co-culture à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Les CSM saines présentent une morphologie effilée en contraste avec l’apparence quadrangulaire des CSM qui ont été maintenues pendant un grand nombre de passages et ont perdu leur multipuissance.

Les colonies de CSM élargies devraient démontrer l’expression de marqueurs de CSM, l’absence de marqueurs de cellules souches hématopoïétiques et la capacité de différenciation en lignées adipogènes, ostéogéniques et chondrogéniques. Les cultures saines de CSM qui ont été soumises à un préconditionnement hypoxique présentent des neurosphères plus grandes en nombre et en taille. La pureté du réseau neuronal du ganglion de la racine dorsale peut être confirmée par l’expression du marqueur neuronal Tuj-1 et l’absence concomitante du marqueur de cellules de Schwann S100.

Après 14 jours de co-culture avec des neurones ganglionnaires de la racine dorsale, les cellules de type cellules de Schwann acquièrent les caractéristiques et les propriétés fonctionnelles des cellules de Schwann matures engagées dans le destin. Une fois maîtrisée, la sous-population de progéniteurs neuraux peut être élargie dans les BMSC humaines ou rénales en 10 jours si la technique d’expansion cellulaire est exécutée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de confirmer que l’échantillon BMSC est doté de neuroprogéniteurs positifs à la nésine et que les progéniteurs hématopoïétiques CD45 positifs ont tous été retirés.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de vous procurer des BMSC, d’enrichir pour la sous-population de progéniteurs neuraux et de diriger la différenciation des progéniteurs neuraux en cellules de Schwann engagées par le destin pour l’utilisation dans l’amélioration de la repousse axonale post-traumatique et de la remyélinisation. À la suite de cette procédure, des cellules gliales myélinisantes, telles que des cellules de Schwann matures, peuvent être dérivées pour leur utilisation dans le développement de thérapies pour les lésions démyélinisantes et les maladies du système nerveux périphérique et central.