Name: Une nouvelle technique de transplantation de graisse mammaire mammaire pour visualiser la génération de vaisseaux de cellules souches endothéliales vasculaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Découvrez une technique de transplantation du coussin adipeux mammaire pour évaluer la prolifération et le potentiel de formation vasculaire des cellules souches endothéliales vasculaires in vivo.

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Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (31530045 et 31371500 à YAZ, 31401245 à QCY), le Ministère de la Science et de la Technologie de Chine (2014CB964800), l&#39;Académie chinoise des sciences (XDB19000000 à YAZ) et les Chinois Société de biologie cellulaire (Early Career Fellowship to QCY).

Les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité de soins et d&#39;utilisation des animaux de l&#39;Institut de biochimie et de biologie cellulaire de Shanghai, l&#39;Académie chinoise des sciences, selon le protocole approuvé SIBCB-NAF-15-002-S335-003. 1. Isolation des VESC de la glandes mammaires de la souris <ol><li> Récolte de mammifères mammaires et digestion des tissus. <ol><li> Utilisez 8 souris moines vierges matures d&#39; Actin-GFP d&#39; une semaine, avec des poids compris entre 20 et 25 g, en tant que donneurs de tissus. Remarque: Les cellules provenant du donneur peuvent être facilement suivies par l&#39;expression GFP. </li><li> Préparer un milieu de base de digestion des tissus constitué de 5% de sérum bovin fœtal (FBS), 1% de stylo / streptococèses et 25 mM d&#39;HEPES dans RPMI1640. Filtrer le mélange à travers un filtre de 0,22 μm pour stériliser et préchauffer à 37 ° C dans un bain d&#39;eau. </li><li> Sacrifiez les souris dans une chambre à CO 2 . Dissectionnez la quatrième paire de glandes mammaires inguinales en faisant d&#39;abord une peau verticale iNcision à la ligne médiane inférieure de l&#39;abdomen à l&#39;aide d&#39;un scalpel (ou ciseaux chirurgicaux). Épluchez doucement la peau d&#39;un côté pour exposer la glande mammaire inguinale à l&#39;aide d&#39;une pince. Obtenir les quatre glandes mammaires inguinales des deux côtés et les couper en morceaux fins dans une boîte de Petri de 6 cm à l&#39;aide de ciseaux. <ol><li> Mesurer le poids total du tissu émincé et le placer dans un tube de 50 mL. Remarque: Assurez-vous que le morceau de tissu résultant est inférieur à 1 mm 3 de taille pour chaque pièce. Un rendement typique est d&#39;environ 5 000 VESC par animal. </li></ol></li><li> Préparer le milieu de base de la digestion dans un tube de centrifugation coiffée de 50 ml au volume de 10 mL par 1 g de moelleux de tissu. Ajouter la collagénase de type 3 à la concentration de 300 unités par 10 ml de milieu de base de digestion pour constituer le tampon de digestion. Mélanger uniformément et l&#39;ajouter au mouchoir. </li><li> Placer horizontalement le tube de centrifugation de 50 ml sur une plate-forme basculante et régler la vitesse à 100 tr / min et la température à 37 ° C. AgiterLe tissu mammaire pendant 2 h. Vérifiez et secouez manuellement le tube toutes les 20 minutes pour assurer une bonne digestion. Note: Le but de la digestion des tissus avant FACS est de préparer une solution monocellulaire à partir de tissus solides. Par conséquent, à la fin de la digestion, le contenu doit être une solution épaisse sans morceaux de tissus visibles. </li></ol></li><li> Préparation de solution monocellulaire. <ol><li> Après la digestion, compléter le tube de centrifugation de 50 ml avec du PBS pré-réchauffé et stérile et inverser le tube pour le mélanger uniformément. Centrifuger le tube à 200 xg pendant 5 minutes pour obtenir une pastille cellulaire. </li><li> Retirer le surnageant et faire basculer le fond du tube pour desserrer la pastille cellulaire. Ajouter 3 ml de tampon de lyses de globules rouges (voir la Table des matières) et incuber dans un capuchon de culture tissulaire à température ambiante (RT) pendant 5 minutes pour éliminer les globules rouges. </li><li> Ajouter 10 ml de PBS stérile et inverser le tube pour le mélanger uniformément. Centrifuger le contenu tissulaire à 200 xg pendant 5 min et le disqueLe surnageant. Ajouter 3 ml de trypsine préchauffée à 0,05% et stocker le tube à 37 ° C pendant 5 min pour digérer davantage le tissu restant. </li><li> Ajouter 3 mL de IMDM préchauffé puis ajouter 100 μL de solution de DNase I (0,25 mg de DNase I diluée dans 1 ml de PBS). Rangez le tube à 37 ° C pour séparer les filaments d&#39;ADN. Passer le mélange de tissus à travers une crépine cellulaire de 70 μm pour obtenir la solution cellulaire. Rincer le filtre deux fois avec 2 ml de PBS + 5% de FBS pour neutraliser la digestion enzymatique. </li><li> Centrifuger le mélange cellulaire à 200 xg pendant 5 minutes pour granuler les cellules. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de PBS + 5% de FBS pour colorer les anticorps. </li></ol></li><li> Isolation Procr + VESC basée sur FACS. <ol><li> Soumettre le mélange cellulaire obtenu à partir du tissu mammaire donneur à la coloration d&#39;anticorps suivant les protocoles de routine publiés 8 . Note: Les anticorps suivants ont été utilisés: anti-sourisLignée de sang-FITC, CD31 anti-souris (PECAM1) -PECY7, anti-souris CD105-APC (tous utilisés à une concentration de 1 μg / mL), anti-souris CD201 (Procr) -biotine (utilisée à une concentration de 2,5 Μg / mL) et la streptavidine-v450 (utilisée à une concentration de 0,5 μg / mL). <ol><li> Après la coloration des anticorps, compléter les cellules avec PBS + 5% de FBS, puis centrifuger à 200 g pendant 5 min. Jeter le surnageant et resuspendre les cellules avec 1 ml de PBS + 5% de FBS. Filtrer par une passoire de cellule de 40 μm. Placez-le sur glace jusqu&#39;à ce que le tri FACS. </li></ol></li><li> Procédez pour effectuer un triage basé sur FACS pour isoler Procr + VESCs. <ol><li> Analyser l&#39;échantillon non coloré et chaque contrôle de couleur unique pour déterminer la tension pour chaque couleur. Calculez les paramètres de compensation pour éviter l&#39;auto-fluorescence ou la coloration d&#39;arrière-plan. Configurez le modèle pour le gating et le tri approprié pour les populations de cellules souhaitées. </li><li> Pour établir la hiérarchie du triage FACS, d&#39;abord éliminer les débris deTous les événements, puis jeter les doublets ou les cloches de cellules adhésives en déclenchant avec une largeur. Déposer des cellules de lignée de sang, puis utiliser CD31 + et CD105 + pour définir les populations endothéliales. Note: Les cellules Procr + ont été isolées de CD31 + CD105 + EC par rapport à un contrôle FMO. Un graphique représentatif de l&#39;analyse FACS est représenté à la figure 1 . Une population VESC isolée FACS devrait être suspendue dans IMDM + 50% FBS et stockée sur de la glace jusqu&#39;à un traitement ultérieur. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. In Vivo VESC Ensemble de formation de navire en utilisant le tampon de graisse mammaire <ol><li> Préparer les EC primaires pour la transplantation. <ol><li> Remplir les cellules triées FACS avec 10 mL de PBS + 5% de FBS, puis centrifuger à 200 xg pendant 5 minutes pour régler les cellules vers le bas. </li><li> Aspirer soigneusement le liquide, compter le numéro de cellule à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre et ré-endiguer le culot cellulaire avec un mélange de matrice de membrane basique (consiUne piqûre de 50% de matrice de membrane de sous-sol et de PBS avec 20% de FBS, complétée avec 100 ng / mL de rmVEGF et 60 U / mL d&#39;héparine) pour atteindre une concentration de 15 000 cellules / 15 μL. Remarque: Le mélange matriciel de la membrane basale doit toujours être conservé sur de la glace. </li><li> Diluer en série les cellules triées et comptées pour atteindre les concentrations d&#39;entrée requises dans un microtube de 1,5 mL, en veillant à ce que les volumes d&#39;injection finaux ne dépassent pas 15 μL au total. Ajoutez 0,1% de bleu trypan à chaque tube pour une meilleure visualisation du contenu pendant la transplantation. Pipeter soigneusement pour mélanger. Rangez les tubes sur glace jusqu&#39;à leur utilisation. Note: Une génération réussie des navires pourrait être réalisée avec un minimum de 100 VESC. </li></ol></li><li> Transplanter les EC primaires sur la graisse mammaire. <ol><li> Désinfectez les instruments chirurgicaux et la tablette. Si vous utilisez les mêmes instruments sur plusieurs animaux, un stérilisateur à perles peut être utilisé pour la désinfection. </li><li> Anesthésier 3-week-old BALB / c nude microE en utilisant le protocole anesthésique recommandé par le vétérinaire de votre établissement et l&#39;IACUC. Placez chaque souris en position couchée, avec son dos sur la table d&#39;opération. Immobiliser ses membres en utilisant du ruban adhésif. </li><li> Trempez un coton-tige en solution antiseptique à base d&#39;iode. Essuyez complètement toute la zone de l&#39;abdomen de la souris pour stériliser la surface de la peau avant la chirurgie. </li><li> Tenez et soulevez la peau de l&#39;abdomen de la souris avec une pince. Utilisez un scalpel chirurgical pour faire une petite incision verticale de 1 cm. Faites deux coupes d&#39;environ 0,5 à 1 cm de longueur, chacune vers la patte arrière, pour obtenir une incision à l&#39;envers et en forme de Y. <ol><li> Utilisez une pince et un coton-tige pour séparer doucement la peau de l&#39;abdomen et épinglez la peau de coté pour exposer les glandes mammaires inguinales. Placez la souris sous un stéréoscope et réglez le grossissement sur 2.0X. Assurez-vous d&#39;ajuster la mise au point de sorte que le tampon gras mammaire puisse être clairement vu et utilisé. </li></ol></li><li> Placez un besoin de 27G 1/2 &quot;E sur la glace pour pré-refroidir. Préparez une seringue de 1 mL avec un mélange de matrice de membrane basique à l&#39;avance pour éliminer les éventuelles bulles d&#39;air piégées dans la région de fixation de l&#39;aiguille. Pipetter 15 μL de solution mélangée sur le capuchon du tube à microcentrifugeuse, puis aspirer le volume entier dans la seringue amorcée. </li><li> Tenez le coussinet gras mammaire devant le ganglion inguinal, utilisez une pince fine et soulevez-le légèrement pour une injection facile. Insérer délicatement environ 1/4 de l&#39;aiguille de la seringue dans le tampon gras. <ol><li> Relâchez la pince à épiler de la façade pour la serrer et stabilisez l&#39;aiguille de la seringue. Injecter la solution lentement pour éviter une fuite de liquide. Tenez pendant quelques secondes pour vous assurer que le mélange cellulaire est solidifié pour minimiser les fuites lors de l&#39;extraction de l&#39;aiguille. </li></ol></li><li> Fermez le volet de la peau avec des sutures absorbables. Suture le volet de la peau en utilisant une suture de monofilament non réactive de taille 5-0 et fermez les plaies avec des noeuds de style chirurgien, chaque noeud approximatifÀ 0,3 cm d&#39;intervalle. Sinon, fermez la peau avec des agrafes enroulées. </li><li> Placez les souris activées dans une cage séparée pour récupérer. Placez une lampe de chauffage sur la cage pour éviter que les souris anesthésiées ne souffrent d&#39;hypothermie. Placez du papier doux et du coton au fond de la cage pour garder les souris chaudes après la chirurgie. <ol><li> Respectez attentivement les souris jusqu&#39;à ce que tous les récipients soient complètement éveillés. Pour les prochains jours, appliquer des analgésiques post-chirurgicaux de manière préventive à tous les animaux ou selon les directives du vétérinaire de l&#39;établissement. Appliquer des antibiotiques selon le protocole animal approuvé si une infection de la plaie survient. Si la plaie chirurgicale a été fermée avec des agrafes enroulées, retirer les attaches de la plaie 10 jours après la chirurgie, lorsque la plaie a complètement fermé. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Préparation des tissus à montage intégral pour l&#39;observation microscopique <ol><li> Récolte de tissus <ol><li> Après 2 à 4 semaines après l&#39;implantation, anesthésier le récepteur BALB / cDes souris nues avec une injection intrapéritonéale d&#39;agent anesthésiant de 2,5% à une dose de 0,12 ml par 20 g de poids corporel, comme à l&#39;étape 2.2.2. Note: La croissance positive des vaisseaux peut être détectée 2 à 4 semaines après la transplantation cellulaire. </li><li> Étiquetez la circulation systémique du destinataire avec une injection de la queue-veine du colorant isolectin-647 à une dose de 50 μg / 25 g de poids corporel, remis en suspension dans 50 μL de PBS stérile. Permettre une période de repos de 5 à 10 min. Sacrifiez les souris en utilisant du CO 2 . </li><li> Dissectionner la zone du tissu mammaire où les cellules ont été injectées initialement après l&#39;étape 2.2.4; Utiliser des ciseaux chirurgicaux. À l&#39;aide d&#39;une lame chirurgicale, coupez le tissu dans environ 3 à 3 mm 3 cubes dans une boîte de Petri de 6 cm. </li></ol></li><li> La digestion des tissus et la préparation pour la coloration des anticorps. <ol><li> Découper les morceaux de tissu dans un tube de centrifugation de 15 ml rempli de 10 ml de milieu de base de digestion préalablement réchauffé (étape 1.1.2) complété par une collagénase III(300 U par 10 ml). </li><li> Placer le tube de centrifugation de 15 mL horizontalement sur une plate-forme basculante avec une vitesse réglée à 100 tr / min et la température réglée à 37 ° C pendant environ 1 heure pour desserrer la structure tissulaire et éliminer les tissus adipocytaires excessifs. Note: Les adipocytes ont tendance à produire une auto fluorescence qui pourrait entraîner un fond fluorescent bruyant. À la fin de la digestion, les morceaux de tissu doivent avoir une apparence douce et trouble. La période de digestion optimale dépend de la taille des morceaux de morceaux hachés et devrait donc être ajustée en conséquence pour obtenir les meilleurs résultats. Étant donné que la vascularisation du tissu a déjà été marquée avec de l&#39;isolectine marquée par fluorescence, toutes les procédures suivantes doivent être effectuées contre la lumière. </li><li> Laver les morceaux de tissu avec du PBS à la température ambiante pendant 10 minutes. Fixez le tissu total en plaçant soigneusement les pièces dans une boîte de Petri de 6 cm à moitié remplie avec 4% de PFA (pH 7,2 à 7,4) pour préserver la fluorescence. Placer la boîte de PetriSur une plate-forme basculante et agiter doucement le tissu pendant 30 min à la température ambiante. Note: Le PFA est cancérogène et doit être manipulé avec précaution. </li><li> Retirez le PFA restant et lavez le tissu fixe trois fois avec un tampon de lavage complet (0,1% d&#39;interpolation dans PBS), avec un intervalle de 10 minutes entre chaque lavage. </li></ol></li><li> Coloration intégrée des anticorps tissulaires. <ol><li> Diluer l&#39;anticorps primaire dans un tampon de coloration d&#39;anticorps dans un tube de centrifugation de 2 mL. Incuber le tissu avec un anticorps primaire pendant une nuit à 4 ° C. Note: On utilise comme anticorps primaires le rat anti-CD31 (concentration: 10 μg / mL) ou la protéine anti-VE-Cadherine (CD144 / Cdh5: 2,5 μg / mL). Les CD31 et les VE-Cadherin sont des marqueurs de surface cellulaire utilisés pour reconnaître l&#39;endothélium. Un tampon de coloration 5x anticorps est préparé avec de l&#39;acide maléique 500 mM, pH 7,5; NaCl 750 mM; Et 0,5% (v / v) d&#39;interpolation dissous dans PBS. Ajouter uniquement un volume sérique approprié (5%) lors de la préparation d&#39;une nouvelle solution de travail 1x9 . </li><li> Retirez le tampon de coloration d&#39;anticorps et lavez le tissu de montage complet trois fois avec un tampon de lavage, avec un intervalle de 10 minutes. Incuber le tissu avec un anticorps secondaire (voir la Table des matières ) plus DAPI à la RT pendant 4 h sur une plate-forme basculante ou pendant une nuit à 4 ° C. Note: utiliser DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole) à une concentration finale de 5 μg / mL pour visualiser les noyaux. </li><li> Laver le tissu total avec un tampon de lavage 3 fois pendant 10 minutes chacun. Incuber les morceaux de tissu dans 80% de glycerol ou 80% de saccharose pendant une nuit pour déshydrater le tissu pour une meilleure conservation. </li><li> Placez les morceaux de tissu individuels sur une glissière en verre et retirez le tampon de déshydratation excessif. Couvrir le tissu avec un support de support, poser une lamelle et serrer doucement le tissu pour le régler. </li><li> Effectuer une acquisition d&#39;image microscopique confocal. Pour les glandes mammaires intégrales, acquérir des images à l&#39;aide d&#39;un objectif 40X avec NA = 1.3 oil objectiVe. Acquérir les balayages des tuiles Z à une résolution de section optique de 1 024 x 1 024 et une séparation des couches de 1,0 à 1,2 μm. Remarque: Pour capturer le signal lumineux de fluorescence correct, le diviseur de faisceau de filtre doit être réglé sur triple dichroïque (TD) 488/553/638, avec le réglage de gain au PMT Gain 600-800. Les sources d&#39;excitation / émission suivantes doivent être utilisées: mGFP, avec maxima d&#39;excitation / émission de 488/509 nm; MTomato avec maxima d&#39;excitation / émission de 532/588 nm; Alexa-647, avec maxima d&#39;excitation / émission de 594/665; Et DAPI, avec maxima d&#39;excitation / émission de 350/470. </li></ol></li></ol> 4. Traçage linéaire à l&#39;aide d&#39;un modèle de souris génétiquement modifié <ol><li> Détectez Procr + VESC à l&#39;aide du modèle de la souris. <ol><li> Utilisez la souche de traction Traver Procr CreERT2-IRES-tdTomato / + (appelée Procr CreERT2 ). Remarque: Dans ce modèle de souris, une cassette Creert2-IRES-tdTomato Procr 11 . <ol><li> Les souris Cross Procr CreERT2 avec la souche rapportrice Rosa26 mTtomatomGFP (appelée R26 mTmG ) pour repérer le sort des Procr + EC in endogènes in vivo 11 . Identifiez toutes les Procr + EC endogènes étiquetées et leurs descendants en utilisant une expression GFP. </li></ol></li><li> Administrer la solution de tamoxifène 11 (10 mg de tamoxifène dissous dans 1 mL d&#39;huile d&#39;arachide + 10% d&#39;éthanol pour constituer une solution mère de 10 mg / mL) par voie intrapéritonéale à une dose de 4 mg / 25 g de poids corporel pendant le stade pubertaire (5 semaines Ancien) pour suivre le sort du développement de Procr + ECs. </li><li> Analyser l&#39;efficacité de formation de clones des cellules marquées par l&#39;immunocoloration totale après les étapes de préparation décrite à l&#39;étape 3. Obtenir des tampons gras de mammifères à partir de souris traitées à la fois à court terme (2 jours) et des délais prolongés (jusqu&#39;à 10 mois). Voir la figure 3 . </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont pas d&#39;intérêts financiers concurrents.

Les analyses d&#39;angiogenèse représentent une bonne approche expérimentale pour étudier la dynamique vasculaire. La vascularisation de la rétine de la souris, qui se développe par voie postnatale, s&#39;est avérée être un modèle attrayant pour étudier l&#39;angiogenèse 12 . Bien qu&#39;il soit relativement accessible, la manipulation réelle dans le lit vasculaire de la rétine est plutôt difficile. Jusqu&#39;à présent, la transplantation in vivo la mieux décrite a été le test du bouchon...

Au cours du développement et de l&#39;homéostasie, la croissance vasculaire et le remodelage se déroulent fidèlement en fonction de la croissance et de la réparation des organes. L&#39;angiogenèse décrit la génération de nouveaux vaisseaux à partir de vaisseaux sanguins préexistants et est considérée comme une force majeure en médiation de ces changements vasculaires dynamiques. Chaque vaisseau sanguin est doublé à l&#39;intérieur d&#39;une couche de cellules endothéliales (EC), et ils semblent être le fondement de l&#39;architecture des navires. Pendant longtemps, le mécanisme par lequel le pool de la CE est reconstitué pendant l&#39;homéostasie est resté incertain et des arguments ont été soulevés sur le fait que le renouvellement vasculaire est le résultat d&#39;une prolifération mature de la CE ou est la contribution des activités vasculaires des cellules souches / progénitrices. En raison de l&#39;absence de données physiologiques directes, l&#39;existence et l&#39;identité cellulaire des cellules souches endothéliales vasculaires (VESC) sont également restés controversés. L&#39;une des approches les plus communes utilisées pour vérifier le comportement des cellules souches est à travers le transplanTation de cellules souches putatives dans des souris destinataires. Cette méthode mesure le potentiel de la tige des cellules souches candidates in vivo. La transplantation a d&#39;abord été appliquée à l&#39;étude des cellules souches de la moelle osseuse 1 , ce qui a contribué à l&#39;établissement des caractéristiques hiérarchiques du système hématopoïétique 2 . Dans le champ endothélial, un bouchon de matrice de membrane basique ( p. Ex ., Matrigel) inséré sous la peau sous le flanc a été un test standard d&#39; angiogenèse in vivo utilisé pour traiter les capacités de formation des vaisseaux des CE transplantés. Plusieurs méthodes expérimentales, y compris la formation de colonies dans les systèmes de culture 3D et la transplantation, ont suggéré des populations potentielles de progéniteurs / VESC de la CE 3 , 4 , 5 , 6 . Cependant, comme les EC incorporés dans la matrice de la membrane du sous-sol sont relativement séparés deLe tissu environnant, cela ne fournit pas l&#39;environnement de niche optimal requis pour explorer pleinement le potentiel angiogénique des cellules transplantées. En conséquence, les vaisseaux formés à l&#39;intérieur du bouchon de matrice sont principalement de type capillaire et sont fonctionnellement non mesurables. La glande mammaire se développe par voie postnatale, la croissance la plus forte se produisant pendant la puberté et la grossesse. Au stade pubertaire, l&#39;épithélium mammaire subit une expansion rapide, pour occuper l&#39;ensemble des graisses mammaires, accompagné d&#39;un remodelage efficace des structures vasculaires environnantes. Ainsi, la glande mammaire offre un excellent modèle pour l&#39;étude de l&#39;angiogenèse. Il fournit de l&#39;espace, de la matrice et des stimuli angiogéniques riches à partir de l&#39;épithélium mammaire grandissant et constitue donc un site de greffage idéal pour évaluer le potentiel angiogénique des cellules exogènes. En outre, le tampon gras mammaire permet aux vaisseaux exogènes formés de s&#39;intégrer au système de circulation de l&#39;hôte, ce qui permet d&#39;ajouter fÉvaluation décentralisée et représentant un avantage sur la transplantation sous-cutanée. Bien que les essais de culture et de transplantation in vitro soient un moyen efficace d&#39;étudier les propriétés de régénération d&#39;une population cellulaire, on sait que de tels tests peuvent stimuler la plasticité lorsque les cellules sont retirées de leurs habitats indigènes et que des changements peuvent être induits lorsque les cellules sont déconnectées de Leur environnement physiologique 7 . Par conséquent, l&#39;obtention de preuves directes in vivo du devenir cellulaire est l&#39;approche clé pour faire avancer la compréhension actuelle du comportement des populations endothéliales. La cartographie du devenir génétique ( c.-à-d., Le traçage des lignées in vivo ) est impératif pour l&#39;identification des VESC et pour l&#39;étude de leurs propriétés dans le système du corps, car il peut révéler le comportement des cellules souches in vivo dans son contexte physiologique et la tige réelle peut être Évalué. Traits de lignageNg fournit une preuve directe de la persistance à long terme ( c. -à- d. L&#39; auto-renouvellement) des VESC candidats et leur capacité à produire des types de cellules pour le tissu d&#39;origine ( c&#39;est-à-dire la puissance de différenciation). Ce protocole décrit une nouvelle technique de transplantation de graisse mammaire et une méthode de traçage de lignée pour observer la capacité de génération de vaisseau des VESC. Ces techniques suppriment les faiblesses des tests actuellement disponibles et fournissent une nouvelle façon d&#39;évaluer de manière optimale les propriétés des cellules souches des VESC. Ces approches sont des outils efficaces qui peuvent être utilisés pour évaluer le comportement et les propriétés de formation des vaisseaux des populations endothéliales, ainsi que pour déterminer l&#39;altération de la puissance des cellules vasculaires dans un environnement pathologique.

<table><tbody><tr><td>0,05 % Trypsine-éthylène diamine Acide tétraacétique (EDTA) (1x)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>25300-062</td><td>0,05 % Trypsine</td></tr><tr><td>0,22 & micro ; m Unité de filtration</td><td>Merck Millipore Ltd.</td><td>SLGP033RB</td><td>0,22 et micro ; m Filtre</td></tr><tr><td>2-Méthylbutanol-2, ReagentPlus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24, 048-6</td><td>Alcool amylique tert</td></tr><tr><td>222, Tribrométhanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402-25g</td><td>222, Tribrométhanol</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>70 &micro ; m Crépine à cellules</td><td>BD FAL</td><td>352350</td><td>70 & micro ; m Lame de microscope à adhérence de filtre cellulaire</td></tr><tr><td></td><td>CITOGLAS</td><td>188105</td><td>Lames en verre</td></tr><tr><td>Anti-souris CD105 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-1051-82, clone MJ7/18</td><td>pour l’utilisation de l’analusis FACS à 1 & micro ; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-souris CD201 Biotine</td><td>eBioscience</td><td>13-2012-82</td><td>pour l’utilisation de l’analusis FACS à 2,5 & micro ; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-souris CD31 PE-Cyanine 7</td><td>eBioscience</td><td>25-0311-82, clone 390</td><td>pour l’utilisation de l’analusis FACS à 1 &micro ; g/mL</td></tr><tr><td>BD FACSJazz Trieur de cellules</td><td>BD Biosciences</td><td>655489</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Sérum bovin Albumine</td><td>Sigma</td><td>100190332</td><td></td></tr><tr><td>BSA Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Centrifugeuse</td></tr><tr><td>Collagénase de type 3</td><td>Worthington-Biochem</td><td>#LS004183</td><td>Collagenase III</td></tr><tr><td>Microscopie confocale</td><td>Leica</td><td>sp8</td><td>Confocale</td></tr><tr><td>Désoxyribonucléase I du pancréas bovin</td><td>Sigma</td><td>D2463-5VL</td><td>Dnase I</td></tr><tr><td>Âne anti-rat Cy3</td><td>Jackson ImmunResearch</td><td>712-165-150</td><td>Anticorps secondaire, utilisation à 0,5 & micro ; g/mL</td></tr><tr><td>Pince Dumont</td><td>WPI</td><td>500342</td><td>Froceps</td></tr><tr><td>Pince Dumont - Micro-Blunted Tips</td><td>FST</td><td>11253-20</td><td>Forceps</td></tr><tr><td>Fetal Bovin</td><td>Serum Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td>FBS</td></tr><tr><td>FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119</td><td>BioLegend</td><td>78022</td><td>Cocktail de lignage sanguin pour l’analyse FACS, utilisation à 25 &micro ; L par test</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma</td><td>G6279</td><td>Glycérol</td></tr><tr><td>Iscov Modifié Dulbecco’s Medium</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>12440-053</td><td>IMDM</td></tr><tr><td>Isolectine GS-IB4 de Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora&nbsp ; 647</td><td>Invitrogen</td><td>Z32450</td><td>Isolectin-647</td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp ; Matrice (facteur de croissance réduit)</td><td>BD</td><td>356231</td><td>Matrigel</td></tr><tr><td>Souche de souris (Actin-GFP)</td><td>Jax Laboratories</td><td>3773</td><td>Souche de souris Actin-GFP</td></tr><tr><td>(C57BL/6)</td><td>SLAC</td><td>C57BL/6</td><td>C57BL/6</td></tr><tr><td>Souche de souris&nbsp ; (BALB/c nu)</td><td>SLAC</td><td>BALB/c nude</td><td>Souris nues</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>PFA</td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>5140-122</td><td>Pen/Strep</td></tr><tr><td>Phosphate Saline (pH7.2) 1x</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>c20012500BT</td><td>PBS</td></tr><tr><td>PRIM1640</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>c11875500CP</td><td>PRIM1640</td></tr><tr><td>Réactif anti-décoloration ProLong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td>Medium</td></tr><tr><td>Rat anti CD144</td><td>BD Biosciences</td><td>550548</td><td>pour l’analyse de montage entier, anti-VE-Cadhérine / Cdh5 antibdy pour jonction étanche endothéliale, utilisation à 2,5 & micro ; g/mL</td></tr><tr><td>Rat anti CD31-biotine</td><td>BD Biosciences</td><td>553371</td><td>pour l’analusis complet, anticorps anti-CD31/PECAM1 pour la molécule d’adhésion de surface endothéliale, utilisation à 10 & micro ; g/mL</td></tr><tr><td>Tampon de lyse des globules rouges</td><td>Sigma</td><td>R7767-100ML</td><td>Tampon de lyse des globules rouges</td></tr><tr><td>Droit/Sharp-Blunt/10cm</td><td>FST</td><td>14028-10</td><td>Ciseaux fins</td></tr><tr><td>Streptavidin eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-4317-82</td><td>pour l’analyse FACS utilisation à 0,5 &micro ; g/mL</td></tr><tr><td>Tamoxifène</td><td>Sigma</td><td>101551374</td><td>TAM</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-250ML</td><td>TritonX</td></tr><tr><td>Soie tressée enduite de cire (taille 5-0 USP (1 métrique), 18 pouces (45 cm) NOIR sur aiguille C-1)</td><td>COVIDIEN</td><td>S1173</td><td>Suture&nbsp ;</td></tr><tr><td>Scaplels jetables stériles</td><td>Swann Morton</td><td>#10</td><td>Scalpel</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Yifeng Medical</td><td>20160101</td><td>Solution antiseptique</td></tr></tbody></table>

une nouvelle technique de transplantation de graisse mammaire mammaire pour visualiser la génération de vaisseaux de cellules souches endothéliales vasculaires

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Les cellules endothéliales (CE) sont les éléments fondamentaux de l&#39;architecture vasculaire et mesurent la croissance vasculaire et le remodelage pour assurer un développement adéquat des vaisseaux et une homéostasie. Cependant, les études sur la hiérarchie des lignées endothéliales restent difficiles à respecter en raison de l&#39;absence d&#39;outils pour accéder à leurs connaissances et d&#39;évaluer directement leur comportement in vivo . Pour remédier à cette lacune, un nouveau modèle de tissu pour étudier l&#39;angiogenèse à l&#39;aide du tampon gras mammaire a été développé. La glande mammaire se développe principalement dans les étapes postnatales, y compris la puberté et la grossesse, au cours desquelles une prolifération robuste de l&#39;épithélium s&#39;accompagne d&#39;un remodelage vasculaire étendu. Les tampons à graisse mammaire fournissent des stimuli spatiaux, matriciels et riches en angiogénie de l&#39;épithélium mammaire en croissance. En outre, les tampons à graisse mammaire sont situés à l&#39;extérieur de la cavité péritonéale, ce qui en fait un site de greffage facilement accessible pour évaluer le potentiel angiogénique des cellules exogènes. Ce travail décrit également une efficacitéNt approche de traçage en utilisant des souris rapporteurs fluorescentes pour étiqueter spécifiquement la population ciblée de cellules souches endothéliales vasculaires (VESC) in vivo . Cette méthode de traçage de lignage, associée à un microscopie de tissu entier, permet la visualisation directe des cellules ciblées et de leurs descendants, grâce auxquelles la capacité de prolifération peut être quantifiée et l&#39;engagement de différenciation peut être cartographié. En utilisant ces méthodes, une population de récepteurs de protéine Bipotent (Procr) exprimant des VESC a récemment été identifiée dans de multiples systèmes vasculaires. Procr + VESC, donnant naissance à la fois de nouvelles EC et des pericytes, contribuent activement à l&#39;angiogenèse au cours du développement, de l&#39;homéostasie et de la réparation des blessures. Dans l&#39;ensemble, ce manuscrit décrit une nouvelle transplantation de graisse mammaire et des techniques de traçage de lignage in vivo qui peuvent être utilisées pour évaluer les propriétés des cellules souches des VESC.

Isolation mammaire VESCs: Pour isoler la population endothéliale pour le dosage de transplantation consécutif, des glandes mammaires vierges de souris (8 semaines) ont été récoltées en tant que matériau donneur. Les cellules endothéliales ont été isolées en utilisant une technique de tri cellulaire à base d&#39;anticorps. Des graphiques représentatifs de l&#39;analyse FACS de la population VESC dans les EC de glande mammaire C57B...

Ce travail démontre une approche novatrice pour évaluer la prolifération, la différenciation et le potentiel de formation des vaisseaux des cellules souches endothéliales vasculaires (VESC) par une transplantation de graisse mammaire, suivie d&#39;une préparation tissulaire complète pour l&#39;observation microscopique. Une stratégie de traçage de lignage pour étudier le comportement des VESC in vivo est également présentée.

Une nouvelle technique de transplantation de graisse mammaire mammaire pour visualiser la génération de vaisseaux de cellules souches endothéliales vasculaires

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

L'objectif général de cette expérience est d'évaluer la prolifération, la différenciation et le potentiel de formation de vaisseaux des cellules souches endothéliales vasculaires au moyen d'une technique de transplantation dans le bourrelet adipeux mammaire, suivie d'une préparation en montage complet du tissu pour l'observation microscopique. Cette méthode offre un nouveau moyen d'évaluer de façon optimale les propriétés de souche des cellules souches endothéliales vasculaires in vivo. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que, pendant la puberté, la glande mammaire fournit un environnement angiogénique idéal pour la formation et l'intégration de nouveaux vaisseaux.Ceci permet l'évaluation fonctionnelle de cellules endothéliales transplantées. Les implications de cette technique ne se limitent pas au test de la fonction endothéliale. Elles peuvent s'étendre à l'évaluation de l'effet de facteurs angiogéniques sur le remodelage localisé des vaisseaux.Ces approches sont des outils efficaces qui peuvent être appliqués à plusieurs disciplines, notamment l'étude des populations endothéliales dans l'environnement tumoral et les altérations de la puissance cellulaire. La procédure sera démontrée par Wenqian Song, étudiante diplômante de notre laboratoire. Après avoir préparé un milieu basé sur la digestion tissulaire et sacrifié des souris rapporteuses matures vierges Actin-GFP âgées de huit semaines conformément au protocole décrit, utilisez un scalpel pour disséquer la quatrième paire de glandes mammaires inguinales en effectuant d'abord une incision cutanée verticale au niveau de la ligne médiane abdominale inférieure.Peser le tissu haché et le placer dans un tube de 50 millilitres. Pour préparer le tampon de digestion, ajouter 300 unités de collagénase de type trois par 10 millilitres de milieu de base de digestion. Mélanger uniformément et ajouter au tissu haché.Horizontalement, placer le tube de centrifugation de 50 millilitres sur une plateforme agitée et régler la vitesse à 100 tr/min et la température à 37 degrés Celsius. Agiter le tissu mammaire pendant deux heures. Après la digestion, compléter le tube de centrifugation de 50 millilitres avec du PBS stérile préalablement réchauffé et retourner le tube pour homogénéiser. Ensuite, centrifuger le tube à 200 × g pendant cinq minutes. Éliminer le surnageant et tapoter le fond du tube pour desserrer le culot cellulaire. Puis ajouter trois millilitres de tampon d’hémolyse et incuber le tube à température ambiante pendant cinq minutes afin d’éliminer les globules rouges.Ajouter 10 millilitres de PBS stérile et retourner le tube pour bien mélanger. Ensuite, après centrifugation du tissu et élimination du surnageant, ajouter trois millilitres de trypsine 0,05 % préchauffée et incuber le tube à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes afin de poursuivre la digestion du tissu résiduel. Puis, ajouter trois millilitres de IMDM préchauffé, puis ajouter 100 microlitres de solution de DNase I.Incuber le tube à 37 degrés Celsius pour fragmenter les filaments d'ADN. Ensuite, faire passer le mélange tissulaire à travers un tamis cellulaire de 70 microns afin d'obtenir la solution cellulaire. Utiliser deux millilitres de PBS additionné de 5 % de FBS pour rincer le tamis deux fois afin de neutraliser la digestion enzymatique.Centrifuger le mélange cellulaire à 200 fois g pendant cinq minutes. Jeter le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans un millilitre de PBS contenant 5 % de FBS pour la coloration par anticorps. Après la coloration par anticorps, compléter le volume des cellules avec du PBS contenant 5 % de FBS, puis centrifuger l'échantillon à 200 fois g pendant cinq minutes.Ensuite, après avoir éliminé le surnageant, utilisez un millilitre de PBS contenant 5 % de FBS pour resuspendre les cellules. Filtrez la suspension à travers un tamis cellulaire de 40 microns. Puis effectuez un tri basé sur la cytométrie en flux (FACS) pour isoler les cellules souches endothéliales vasculaires positives pour le récepteur de la protéine C, conformément au protocole décrit dans le texte.Compléter les cellules triées par FASC avec 10 millilitres de PBS contenant 5 % de FBS, puis centrifuger les échantillons à 200 × g pendant cinq minutes afin de déposer les cellules au fond du tube. Après avoir soigneusement aspiré le liquide, compter le nombre de cellules à l’aide d’un hématimètre et resuspendre le culot cellulaire dans un mélange de matrice de membrane basale à raison de 15 000 cellules par 15 microlitres. Diluer progressivement les cellules triées et comptées pour atteindre les concentrations d’entrée requises dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre, en veillant à ce que les volumes finaux d’injection n’excèdent pas 15 microlitres.Ensuite, ajouter 0,1 % de bleu de trypan à chaque tube pour une meilleure visualisation du contenu pendant la transplantation. Pipler soigneusement pour homogénéiser et conserver les tubes sur de la glace jusqu'à utilisation. Pour transplanter des cellules endothéliales primaires ou CE dans le bourrelet adipeux mammaire, placer chaque souris en position supine, le dos sur la table d'opération.Ensuite, utilisez du ruban adhésif pour immobiliser les membres. Imbibez un coton-tige de solution antiseptique à base d'iode. Essuyez soigneusement toute la région abdominale de la souris afin de stériliser la surface de la peau avant la chirurgie.Ensuite, utilisez une pince pour tenir et soulever la peau de l'abdomen de la souris. Puis, avec un scalpel chirurgical, faites une petite incision verticale d'un centimètre. Effectuez deux coupes d'environ 0,5 à un centimètre de longueur chacune en direction de la patte arrière afin d'obtenir une incision en forme de Y inversé.Utilisez une pince et un coton-tige pour séparer délicatement la peau de l'abdomen et épingler la peau sur le côté afin d'exposer les glandes mammaires inguinales. Ensuite, placez la souris sous un stéréomicroscope et réglez le grossissement sur 2X. Placez une aiguille de calibre 27 de 1/2 pouce sur de la glace pour la pré-refroidir.Après avoir amorcé la seringue, pipetez 15 microlitres de solution de matrice de la membrane basale sur le bouchon du tube microcentrifuge, puis aspirez l'ensemble du volume dans la seringue amorcée. Pour garantir l'injection complète du contenu cellulaire, veillez à ce qu'aucun air ne soit piégé dans l'aiguille après l'amorçage et la prise des cellules. À l'aide de pinces fines, maintenez la glande mammaire grasse devant le ganglion lymphatique inguinal et soulevez-la légèrement afin de faciliter l'injection.Insérez ensuite délicatement environ un quart de l'aiguille de la seringue dans le bourrelet adipeux. Relâchez la pince du bourrelet adipeux pour saisir et stabiliser l'aiguille de la seringue. Injectez lentement la solution afin d'éviter toute fuite de liquide.Ensuite, maintenir l'aiguille en place pendant quelques secondes afin de s'assurer que le mélange cellulaire est solidifié, ce qui minimise les fuites lors du retrait de l'aiguille. Utiliser des sutures résorbables en boyau 5-0 pour fermer et suturer le lambeau de peau, et refermer les plaies avec des nœuds de type chirurgical, chaque nœud étant espacé d'environ 0,3 centimètre. Pour prélever le tissu, marquer la circulation systémique du receveur par une injection veineuse caudale de colorant Isolectin 647 dans du PBS.Prévoir une période de repos de cinq à dix minutes. Après avoir sacrifié les souris conformément au protocole décrit, utiliser des ciseaux chirurgicaux pour disséquer la zone de tissu mammaire où les cellules ont été initialement injectées. Dans une boîte de Pétri de six centimètres de diamètre, utiliser une lame chirurgicale pour découper le tissu en cubes d'environ trois à quatre millimètres cubes.Ensuite, pour digérer les fragments de tissu, transférez-les dans un tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres de milieu de digestion préchauffé supplémenté en collagénase trois. Placez le tube de centrifugation de 15 millilitres horizontalement sur une plateforme oscillante à 100 tr/min et à 37 degrés Celsius pendant environ une heure afin de relâcher la structure du tissu et d'éliminer l'excès de tissu adipeux. Ensuite, utilisez du PBS pour laver le tissu à température ambiante pendant 10 minutes.Ensuite, pour préserver la fluorescence, fixez le tissu en montage entier en plaçant soigneusement les fragments dans une boîte de Pétri de six centimètres à moitié remplie de PFA à 4 %. Placez la boîte de Pétri sur une plateforme oscillante et agitez doucement le tissu pendant 30 minutes à température ambiante. Après avoir lavé le tissu et l'avoir incubé dans l'anticorps primaire dilué selon le protocole indiqué dans le texte, retirez la coloration et utilisez du tampon de lavage pour rincer le tissu trois fois, pendant 10 minutes chacune.Incubez ensuite le tissu avec l'anticorps secondaire et le DAPI à température ambiante pendant quatre heures sur une plateforme agitée, ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Après avoir lavé l'échantillon conformément au protocole indiqué dans le texte, transférez le tissu dans du glycérol à 80 % ou du saccharose à 80 % pendant une nuit afin de le déshydrater pour une meilleure conservation. Montez le tissu et réalisez la microscopie confocale selon le protocole indiqué dans le texte.Un résultat représentatif d'isolement cellulaire par tri cellulaire par flux (FACS) est montré ici. Les lignées sanguines ont été éliminées par sélection, et les cellules endothéliales ont été définies à l'aide de marqueurs CD31 positif et CD105 positif, suivie de l'enrichissement des cellules souches endothéliales positives pour le récepteur de la protéine C. Cette image de microscopie confocale représente un bourrelet adipeux mammaire receveur au site de transplantation.Les vaisseaux sanguins formés à partir de cellules endothéliales positives pour le récepteur de la protéine C transplantées se sont intégrés et ont contribué à la vascularisation mammaire de l'hôte. La vascularisation mammaire du receveur est présentée sur cette figure. L'injection intraveineuse d'isolectine chez les souris receveuses a révélé que les cellules endothéliales positives pour le récepteur de la protéine C avaient formé des vaisseaux fonctionnels dotés de lumière.Une fois maîtrisée, la procédure de transplantation peut être réalisée en moins de cinq minutes si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de surveiller attentivement les animaux receveurs après l'intervention chirurgicale. Des procédures de soins appropriées doivent être mises en place si des signes de détresse ou d'infection sont observés.Après la réalisation de cette procédure, d'autres méthodes telles que le traçage de la lignée cellulaire peuvent être effectuées afin d'examiner le comportement des cellules ciblées durant divers processus biologiques in vivo. Depuis son développement, cette technique a permis aux chercheurs du domaine de la biologie vasculaire d'explorer le potentiel des sous-populations de l'endothélium dans des conditions physiologiques et pathologiques. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser la transplantation de la graisse mammaire et la préparation de tissus en montage complet pour étudier la capacité de formation de vaisseaux des populations endothéliales, ainsi que pour évaluer la fonctionnalité des vaisseaux formés.

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Une nouvelle technique de transplantation de graisse mammaire mammaire pour visualiser la génération de vaisseaux de cellules souches endothéliales vasculaires (Vidéo) | JoVE Journal

Une nouvelle technique de transplantation de graisse mammaire mammaire pour visualiser la génération de vaisseaux de cellules souches endothéliales vasculaires

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