Développer des corps embryoïdes libres de sérum dérivés dérivés de HiPSC pour l'interrogation de cultures cellulaires souches 3-D à l'aide de tests physiologiquement pertinents

L’objectif global de ce protocole pour les corps embryoïdes libres de sérum iPSC humain 3D est de fournir un système in vitro qui se rapproche du développement cortical précoce humain, qui peut être utilisé pour la découverte de médicaments. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des cellules souches, telles que la façon dont les neurones dérivent des iPSC et forment des réseaux fonctionnels dans les tissus 3D. Le principal avantage de cette technique est qu’elle nous permet de modéliser des aspects du développement cortical dans une boîte, à partir de tissus humains contenant la génétique d’individus malades, de sorte que le système sert de plate-forme cellulaire pour le criblage de médicaments qui est évolutive et peut être utilisée pour étudier de nombreux troubles neurobiologiques différents.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des troubles neurobiologiques ou du développement neurologique, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que ceux qui se concentrent sur des modèles de fonction neuro-immune ou d’informations neuronales. Pour ce protocole, commencez par établir des cellules fœtales. Pour établir cette culture, placez 600 000 cellules fœtales dans chaque puits d’une plaque à six puits, avec 300 millilitres de milieu par puits.

Après avoir cultivé les cellules fœtales pendant 48 heures, remplacez le milieu. Incuber les plaques pendant une heure, tout en préparant les cellules souches. Décongelez les cellules souches dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.

Une fois décongelées, transférez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres et remplissez le tube à cinq millilitres avec du milieu de culture, ajouté goutte à goutte. Ensuite, centrifugez doucement les cellules pendant quatre minutes, aspirez le surnageant et remettez doucement la pastille en suspension dans un millilitre de milieu de cellules souches avec inhibiteur de ROCK. Après avoir quantifié la densité cellulaire, placez 300 000 cellules souches sur les cellules nourricières.

Ensuite, cultivez et élargissez les cultures, en sélectionnant périodiquement les cellules saines, après l’expansion et en congelant les cellules pour la sauvegarde. Cultivez les colonies de cellules souches sur des plaques standard jusqu’à ce qu’elles atteignent 50 % à 70 % de confluence. Ensuite, utilisez un traitement enzymatique doux et une trituration douce avec la pointe de pipette d’un millilitre pour récolter les hiPSC pour la différenciation des cellules précurseurs neurologiques.

Centrifugez doucement la suspension, aspirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un milieu iPSC humain de cinq millilitres. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans une boîte de culture cellulaire de cinq centimètres recouverte de gélatine à 0,1 % et incubez la plaque pendant une heure. Au bout d’une heure, transférez les cellules non adhérentes dans un tube à centrifuger de 15 millilitres.

Rincez ensuite délicatement la plaque avec trois millilitres de fluide et transférez-la dans le même tube. Ensuite, répétez l’étape de remise en suspension avec une centrifugation douce, puis déterminez la densité cellulaire et plaquez les cellules dans une plaque inférieure en V à 96 puits à faible adhérence à 9 000 cellules par puits. Maintenant, faites tourner la plaque pendant trois minutes et commencez à cultiver les cellules.

Au cours des 14 jours suivants, remplacez tous les deux un demi-milieu par un milieu frais et différenciant. Après deux semaines de culture des cellules, préparez six plaques de puits avec des inserts de culture cellulaire de 40 microns et un millilitre de milieu DM1. Incuber ces plaques pendant au moins quatre heures avant d’ajouter les cellules cultivées.

Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette à large ouverture de 200 microlitres, collectez des agrégats de cellules âgés de deux semaines d’une valeur d’environ 20 microlitres de milieu. Transférez quatre à six agrégats sur chaque insert avec un minimum de solution, retirez tout excès. Au cours de cette étape, il est important de travailler rapidement et d’une main ferme, tout en enlevant le fluide autour des SFEB, vous pouvez voir les SFEB se déplacer à travers la solution en raison de la tension superficielle.

Vous pouvez les repositionner une fois le support retiré. Une fois que tous les agrégats sont chargés sur des inserts, changez le milieu à un millilitre de DM2 et continuez la culture des cellules tous les deux jours. Remplacez les trois quarts du milieu par du milieu frais.

Après 14 jours de culture, commencez à ajouter du milieu DM3 aux cultures. Continuez la culture pendant 16 jours de plus pour faire pousser les SFEB. Séparez maintenant délicatement les SFEB de l’insert, à l’aide d’une pointe de pipette à large ouverture de 200 microlitres.

Transférez les SFEB sur des plaques de 12 puits, en chargeant quatre à huit par puits. Ensuite, colorez-les comme plan dans le protocole de texte. Pour préparer le puits 12 et les huit assiettes, lavez-les d’abord trois fois à l’eau stérile.

Ensuite, lavez-les une fois avec de l’éthanol à 75 % et une fois de plus avec de l’éthanol à 100 %. Ensuite, faites cuire les plaques à 50 degrés Celsius pendant quatre à cinq heures à l’envers, pour terminer le processus de stérilisation. Après la cuisson, ajoutez 500 microlitres de solution à 0,2 % d’Île-du-Prince-Édouard dans chaque puits et laissez reposer la plaque à température ambiante pendant une heure.

Ensuite, aspirez l’IPE et lavez les puits quatre fois avec de l’eau distillée stérile et séchez-les à l’air libre pendant la nuit. Le lendemain, préparez du laminant frais dans un milieu L15 et ajoutez 10 microlitres au centre de chaque puits. Ensuite, ajoutez de l’eau distillée dans les réservoirs environnants pour éviter l’évaporation et incubez la plaque pendant une heure à 37 degrés Celsius.

Assurez-vous de projeter le laminant au centre des électrodes, en faisant attention de ne pas dépasser l’espace des électrodes de mise à la terre, si cet espace dépasse, les neurones se développeront au-dessus des électrodes de mise à la terre, provoquant des artefacts de bruit et affectant la fidélité de l’enregistrement. Maintenant, ajoutez un SFEB préparé dans chaque puits, en utilisant une aspiration douce avec une pipette à large diamètre. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de DM2 dans chaque puits et cultivez la plaque pendant la nuit.

Plus tard, pour enregistrer l’activité neuronale, placez une plaque dans le lecteur de plaques. Préchauffez-le à 37 degrés Celsius. Ensuite, utilisez le logiciel pour enregistrer 10 minutes d’activité de chaque puits.

SFEB est cultivé à l’aide de la méthode décrite, a produit des tissus avec des caractéristiques morphologiques qui ressemblent à une zone sous-ventriculaire corticale en développement précoce remplie de neurones Tuj1 positifs étendus, ainsi que de neuroprogéniteurs. De nombreuses rosettes corticales en développement ont été observées dans les couches externes et dans les couches internes des corps. Le bord externe du corps ressemble à une plaque corticale en développement contenant des neurones postmitotiques, ce qui est soutenu par l’expression de Brn2, un marqueur des neuroprogéniteurs et des couches corticales externes les plus ventralisées.

Les couches externes contiennent également des cellules positives à Reelin qui peuvent être des cellules gratzel occasionnelles ou leurs progéniteurs. Les corps ont également exprimé des marqueurs compatibles avec l’origine mixte des immenants ganglionnaires codaux et médiaux. Basé sur l’expression de marqueurs TF2 et Nkx2.1 cuits.

Les SFEB cultivés produisent à la fois des interneurones positifs à CalR et CalB. Ainsi que les neurones excitateurs positifs VGLUT et les progéniteurs neuronaux glutamatergiques positifs Tbr1. Conformément à d’autres rapports, 61 % des cellules du corps étaient VGLUT positives et 43 % étaient positives pour Tbr1.

Les enregistrements MEM effectués à partir des corps peuvent être pris pendant de longues périodes et les enregistrements ont montré le développement de l’éclatement au niveau du réseau cortical. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cultiver des SFEB à partir d’iPSC humaines, de caractériser le contenu neurule des rosettes corticales punitives en développement avec des NSFEB. et effectuer des tests neurophysiologiques sur les SFEB en cours de maturation.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent avoir des difficultés car il faut du temps et de la pratique pour développer le domaine scientifique nécessaire au comportement des iPSC et à l’arrivée des neurones dans la culture. Les cellules cultivées doivent être surveillées quotidiennement. Après cette procédure, d’autres méthodes comme l’imagerie calcique peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que l’effet des traitements médicamenteux sur les oscillations du réseau cortical.