Prévoir le silencieux des gènes grâce au contrôle spatiotemporel de la libération de siRNA de Nanocarriers polymériques adaptés à la photo

L’objectif global de ces méthodes est de ne pas pouvoir prédire l’efficacité du silençage génique médié par de petits ARN interférents et de faciliter le contrôle des niveaux d’expression des protéines résultants, de manière spatio-temporelle. Cette méthode permet d’élucider la structure, la fonction, les relations et les véhicules de livraison réactifs aux stimuli. Obtenir un meilleur contrôle de la liaison par rapport à la libération peut débloquer des plateformes transposables et la découverte de médicaments, ainsi que des technologies de médecine régénérative.

Les principaux avantages de cette technique sont que les changements dans l’expression des gènes peuvent être contrôlés et prédits sur la base sous la forme d’un simple test de libération de siRNA et d’une modélisation cinétique. Bien que ces méthodes utilisent de nouveaux polymères photo-sensibles, cet ensemble de tests peut être facilement adapté pour tester la grande variété d’autres systèmes sensibles aux stimuli. Pour commencer, préparez une solution d’ARNi de 32 microgrammes par millilitre, en ajoutant de l’ARNi à une solution d’HEPES de 20 micromolaires à un pH de six.

Ensuite, préparez une solution polymère en ajoutant des polymères polymères polyAPN BMA dissous à bloc mPEG à une solution HEPES de 20 millimolaires à pH six. Pour atteindre une concentration de 220 microgrammes par millilitre, cette concentration se traduira par un rapport N/P de quatre, ce qui signifie qu’il y aura quatre fois plus de groupes amines sur le polymère que de groupes phosphates sur l’ARNi. Ensuite, ajoutez la solution de polymère goutte à goutte à un volume égal de solution de siRNA, tout en mélangeant doucement sur une machine à vortex.

Continuez à vortex pendant 30 secondes après l’ajout de polymère. Ensuite, incubez les échantillons dans l’obscurité à température ambiante pendant 30 minutes. Ajoutez la solution STS à chaque solution de nanotransporteur goutte à goutte tout en mélangeant doucement sur une machine à vortex.

Continuez à vortex pendant 30 secondes après l’édition de la FDS. Centrifugez les échantillons à 3 000 G pendant cinq secondes, puis incubez les échantillons dans l’obscurité à température ambiante pendant 30 minutes. Calibrez et réglez un laser UV avec un filtre de 365 nanomètres à une intensité de 200 watts par mètre carré.

Ensuite, découpez un trou dans un joint en caoutchouc, placez le joint en caoutchouc sur une lame de verre lavée et séchée. Pipetez la solution SDS du nanoporteur sur la lame de verre à l’intérieur du trou du joint en caoutchouc. Chargez un excès de solution sur la lame de verre, tout en évitant tout contact avec le joint en caoutchouc.

Placez la deuxième glissière de verre sur le joint de la glissière. Pour éviter la génération de bulles d’air, placez d’abord une extrémité de la glissière vers le bas, puis abaissez lentement l’autre extrémité. Fixez des pinces à reliure de chaque côté de la chambre en verre pour la maintenir près de vous.

Irradiez les échantillons pendant la durée souhaitée, à l’aide du laser UV avec le filtre de 365 nanomètres à une intensité de 200 watts par mètre carré. Retirez les pinces à reliure et ouvrez la chambre. Ensuite, pipetez 25 microlitres d’échantillons SDS de nanoporteurs irradiés sur des tubes à micro-centrifuger.

Incuber les solutions dans l’obscurité à température ambiante pendant 30 minutes. Ajoutez cinq microlitres de la solution tampon de chargement à 25 microlitres de chaque échantillon de SDS de nanoporteur. Incuber les échantillons dans l’obscurité à température ambiante pendant 10 minutes.

Ensuite, chargez 30 microlitres de chaque échantillon SDS de nanoporteur dans un gel d’agarose à 2 %, pré-coloré au bromure d’éthidium. Faites couler le gel dans l’obscurité à 100 volts pendant 30 minutes. Imagez le gel à l’aide d’un système d’imagerie sur gel avec des filtres au bromure d’éthidium.

Enregistrez les fichiers d’image du gel et procédez à la quantification de l’intensité de pliage comme décrit dans le protocole texte. Retirez les morceaux de papier d’une entretoise adhésive double face pour exposer la surface adhésive. Fixez l’entretoise à une lamelle de verre.

Pipetez la solution SDS du nanoporteur sur la lamelle. Ensuite, placez une lame de verre prélavée sur la lamelle de recouvrement avec le trou de l’entretoise adhésive, centré autour de l’échantillon. Appuyez sur la lame de verre pour vous assurer que la glissière de verre et la lamelle de recouvrement sont bien fixées et forment un joint.

Utilisez un microscope confocal avec un objectif aperchromal 40 fois immergé dans l’eau, ayant une ouverture numérique de 1,2 pour les mesures FCS. Utilisez le canal laser d’excitation approprié pour collecter au moins 30 mesures de 10 secondes chacune, par échantillon. Ensuite, entrez les données de libération de siRNA du FCS dans un modèle cinétique pour prédire les réponses de silençage génique, comme détaillé dans le protocole de texte.

Pour préparer l’administration in vitro d’un siRNA, ajoutez d’abord deux millilitres de suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque à six puits. Laissez les cellules adhérer et récupérer pendant 24 heures dans l’incubateur. Après avoir lavé les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate, préparez-les pour la transvection en ajoutant 1,5 millilitre de sérum et de milieu de transvection sans antibiotique.

Ensuite, ajoutez 25 microlitres de solution de nanocarriers, contenant 30 picomoles de siRNA par puits. Pipetez doucement le milieu de haut en bas pour mélanger. Placez les cellules dans l’incubateur pendant trois heures.

Retirez le milieu de transvection et lavez bien chacun avec du PBS. Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu de croissance supplémenté et placez les cellules dans l’incubateur pour récupérer pendant 30 minutes. Pour préparer les cellules au traitement avec un photostimulus, retirez le milieu de croissance supplémenté.

Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu de transvection dans chaque puits. Après avoir calibré le laser UV comme décrit dans le protocole texte, placez les cellules sur une plaque chauffante réglée à 37 degrés Celsius. Retirez le couvercle de la plaque à six puits.

Irradiez les cellules par le dessus de la plaque pendant le temps souhaité, à l’aide du laser UV avec un filtre de 365 nanomètres à une intensité de 200 watts par mètre carré. Retirez le milieu de transvection et ajoutez deux millilitres de milieu de croissance supplémenté. Placez les cellules dans l’incubateur jusqu’à ce que l’analyse soit plus approfondie.

Pour préparer un masque photo qui bloque complètement la lumière de 365 nanomètres et minimise les reflets, coupez, perforez et/ou usinez d’abord la forme souhaitée dans le masque photo. Collez le masque photo au bas de la plaque à six puits, avec le motif centré sur le puits contenant les cellules et le côté antireflet face à la plaque. Installez deux supports d’anneau à environ 25 mètres l’un de l’autre et détachez une plate-forme de chaque support d’anneau, de sorte que les plates-formes soient de hauteur égale.

Suspendez la plaque cellulaire entre les deux supports en posant la plaque sur le dessus des plates-formes. Irradiez les cellules par le dessous de l’échantillon pendant le temps souhaité, à l’aide d’un laser UV avec un filtre de 365 nanomètres, à une intensité de 200 watts par mètre carré. Retirez le milieu de transvection et ajoutez deux millilitres de milieu de croissance supplémenté.

Ensuite, placez les cellules dans un incubateur pour récupérer pendant au moins 24 heures. Imagez les cellules à l’aide de la microscopie à fluorescence comme décrit précédemment. Voici un exemple de modélisation cinétique simple de la dynamique du silençage génique.

Le modèle a été exécuté pour prédire les concentrations d’ARNm, de protéines et d’ARNi, en fonction du temps suivant la libération d’ARNi photo-induite. Les quantités relatives de siRNA libérées après différentes doses de lumière ont été saisies comme la concentration initiale de siRNA dans le modèle cinétique. Les prédictions du modèle qui en a résulté pour les niveaux d’expression des protéines étaient en accord avec les niveaux d’expression déterminés expérimentalement obtenus par western blot.

Pour la visualisation, les cellules exprimant la GFP ont été traitées avec la GFP ciblant l’ARNi et un masque photo anulaire a été placé sur la plaque avant l’irradiation pour générer un motif circulaire. Les cellules protégées de la lumière présentaient une intensité de fluorescence impossible à distinguer des échantillons de contrôle non traités avec l’ARNi et la lumière. Cependant, presque toutes les cellules du motif circulaire n’ont montré aucune expression de GFP, indiquant une libération efficace de siRNA et l’inactivation du gène.

De plus, l’utilisation de la lumière est un déclencheur de l’expression génique, qui doit être contrôlée sur des échelles de longueur cellulaire. En résumé, cette méthode permet de déterminer rapidement les conditions d’irradiation pour contrôler spatio-temporellement la libération de siRNA et prédire a priori le silençage génique. L’utilisation de ce protocole aidera à élucider les relations structure-fonction régissant la stabilité et l’efficacité des nanoporteurs.

Cette technique peut permettre des applications en médecine régénérative qui nécessite un contrôle spatio-temporel de l’expression des gènes. Ces formulations sont également bien adaptées au traitement de troubles localisés tels que le cancer de la peau, ainsi que les troubles dermatologiques.