Préparation à moyen terme de Drosophila Extraits d'embryons pour les expériences protéomiques

L’objectif global de cette expérience est de fournir une approche simple et peu coûteuse pour la collecte d’embryons de drosophilie à moyenne échelle. Et la préparation d’extraits de protéines pouvant être utilisés dans des applications protéomiques en aval, telles que la spectrométrie de masse de purification d’affinité. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la signalisation cellulaire et de la biologie du développement.

Par exemple, comment des interactions spécifiques entre protéines et protéines assurent la communication cellulaire au cours du développement de l’organisme. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une méthode facile et peu coûteuse pour générer une lyse d’embryon de drosophile. Qui peut être utilisé pour des applications en aval comme la purification par affinité protéique.

Traditionnellement, les chercheurs collectaient des embryons de drosophile dans de très grandes cages de population. Mais nous présentons une procédure conviviale pour collecter des embryons dans des cages de taille moyenne qui peuvent être facilement installées dans n’importe quel laboratoire. Après avoir préparé des récipients de cinq litres et coupé des carrés de 25 x 25 centimètres de maille de nylon, selon le protocole de texte, placez la maille sur le récipient et appuyez avec le couvercle.

Assurez-vous que le filet est bien serré et que le couvercle n’est pas incliné. La cage est maintenant prête à être peuplée de mouches. Après la préparation de pots en plastique d’un litre et de carrés en maille de nylon de 18 x 18 centimètres, placez le filet sur le bord supérieur du pot et vissez le couvercle pour serrer.

Assurez-vous que le grillage est bien serré et que le couvercle n’est pas incliné. Amplifiez les lignées de mouches transgéniques porteuses de la protéine typée d’intérêt. Et transférez les bouteilles tous les deux jours jusqu’à ce que 25 à 30 bouteilles soient accumulées pour chaque ligne de mouche.

Amplifier un stock témoin de la même manière. Ensuite, réchauffez les assiettes de jus de pomme à température ambiante. Ensuite, à l’aide d’un doigt ganté, étalez un peu de pâte de levure humide au centre des assiettes.

Formant un cercle d’environ six centimètres pour une plaque de 15 centimètres. Et un cercle de quatre centimètres pour une plaque de 10 centimètres. Après avoir anesthésié les mouches et les avoir transférées dans les cages préparées avec le filet vers le bas, couvrez les cages avec des assiettes de jus de pomme.

Laissez les mouches se réveiller. Ensuite, retournez les cages et incubez les mouches à température ambiante pendant deux à trois jours. Changez les plaques deux fois par jour, en retournant la cage, et tout en tenant la plaque contre la cage, décollez le ruban adhésif de la plaque.

Tapotez doucement toute la cage sur le banc et remplacez rapidement l’ancienne plaque par une nouvelle, en essayant de ne pas permettre aux mouches de s’échapper. Laissez les mouches pondre des embryons sur des assiettes de jus de pomme frais pendant la nuit ou pendant toute autre durée souhaitée. Le lendemain matin, marquez et pesez les contenants grillagés pour le prélèvement des embryons.

Un pour chaque ligne de mouche utilisée. Préparez 1 tampon de lyse dans un tube de 50 millilitres en utilisant des réactifs préalablement préparés, en ajoutant 40 millilitres d’eau à 10 millilitres de tampon de lyse concentré 5 fois dans un tube de 50 millilitres. Ajouter 50 microlitres d’une molaire DTT à une concentration finale d’une molaire milliaire.

Mélangez bien et répartissez la solution dans deux tubes de 50 millilitres. Dans l’un des tubes, ajoutez un comprimé d’inhibiteur de protéase. Et placez le tube sur un rotateur à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.

Pendant que le comprimé se dissout, commencez à collecter les embryons en marquant les plaques de jus de pomme sur les cages, avec les génotypes des lignes de mouches utilisées. Et remplacez les assiettes par des assiettes fraîches. Ajoutez suffisamment d’eau pour couvrir chaque assiette de jus de pomme.

Ensuite, à l’aide d’un pinceau doux, délogez doucement les embryons de la plaque. Versez les embryons dans le récipient grillagé préalablement pesé et marqué et égouttez l’excès d’eau. Ensuite, épongez brièvement le filet sur du papier absorbant pour éliminer l’excès d’eau.

Pour déchorionner les embryons, remplissez à moitié une boîte de Pétri de six centimètres avec 50 % d’eau de Javel. Préparez ensuite deux boîtes de Pétri plus grandes avec de l’eau. Plongez le récipient grillagé avec les embryons dans 50 % d’eau de Javel pendant 90 secondes.

Tapotez doucement le grillage pendant l’incubation à quelques reprises, pour suspendre les embryons dans la solution d’eau de Javel. À la fin de l’incubation, utilisez de l’eau pour laver le récipient en filet dans chacun des deux plats, pendant environ 10 secondes. Utilisez ensuite 18,2 mégohms d’eau dans une bouteille à jet d’eau, pour rincer abondamment le récipient en filet, y compris les côtés et l’extérieur.

Aucune odeur d’eau de Javel ne doit être détectée après un lavage minutieux. Épongez le récipient en filet sur du papier absorbant. Pesez ensuite le récipient en filet, avec les embryons et soustrayez le poids du récipient vide.

Enregistrez le poids résultant des embryons. Pour préparer l’extrait d’embryon, ajoutez un millilitre de tampon de lyse avec inhibiteurs de protéase dans un homogénéisateur en verre Dounce et maintenez-le sur de la glace. Transférez ensuite les embryons du récipient grillagé dans l’homogénéisateur.

Utilisez un millilitre de tampon de lyse pour laver les embryons restants sur le grillage. Et ajoutez les embryons et le tampon au matériel dans l’homogénéisateur. Laissez ensuite les embryons se déposer au fond de l’homogénéisateur et aspirez soigneusement le surnageant.

Ensuite, ajoutez le tampon de lyse avec des inhibiteurs de protéase à l’homogénéisateur, en visant cinq à six millilitres de tampon de lyse par gramme d’embryons. Insérez ensuite un pilon lâche pour homogénéiser les embryons en quatre à six passages. Lors des premiers coups, il y aura plus de résistance.

Essayez de déplacer le pilon dans un mouvement continu, pour éviter d’éclabousser la solution. Passez ensuite à un pilon bien ajusté. Et homogénéiser les embryons en huit à 10 coups.

Incuber l’homogénéide sur glace pendant 20 minutes. Transférez ensuite l’homogénéide dans des micro-tubes à centrifuger. Et centrifugeuse à 13 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes.

Tout en évitant les granules dans la couche lipidique supérieure, transférez les surnageants dans des micro-tubes à centrifuger frais sur de la glace. Après avoir répété la centrification, utilisez une pointe d’un millilitre pour recueillir soigneusement les surnageants. Et transférez-les dans des seringues réfrigérées de 10 millilitres, avec des filtres de 045 micromètres attachés.

Poussez toute la solution dans des microtubes à centrifuger de deux millilitres étiquetés sur de la glace. Congelez les échantillons dans de l’azote liquide et conservez-les à moins 80 degrés Celsius. Ou utilisez-le immédiatement pour des expériences de purification de protéines.

En utilisant le protocole décrit dans cette vidéo, des lysats ont été préparés à partir d’embryons de drosophile exprimant de manière ubiquitaire la protéine EGFP-ERK, sous le contrôle du promoteur arm-odillo. L’expression de la protéine a été confirmée par Western Blot pour la protéine ERK totale afin de détecter simultanément les niveaux d’EGFP-ERK endogène et transgénique, migrant à 42 kilodaltons et 69 kilodaltons respectivement. Une seule bande, correspondant à des ERK endogènes non marqués, a été détectée dans la ligne de contrôle jaune-blanc, confirmant une extraction réussie de ERK et EGFP-ERK à partir d’embryons.

Pour tester si le protocole d’extraction est adapté à la purification ultérieure des protéines marquées, des extraits de mouches jaune, blanche et arm-EGFP-ERK ont été soumis à une purification par affinité, à l’aide de billes d’agarose GFP. La coloration à l’argent d’échantillons analysés sur un gradient SDS-PAGE, montre une purification réussie de la protéine d’appât EGFP-ERK. Outre EGFP-ERK, la voie expérimentale contenait des bandes supplémentaires, non observées dans l’échantillon de contrôle, suggérant que la purification a récupéré des protéines interagissant potentiellement avec ERK.

Une fois maîtrisés, le prélèvement d’embryons et les étapes d’extraction, peuvent être réalisés en deux heures environ. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier d’effectuer les étapes d’extraction sur de la glace. Et d’utiliser des inhibiteurs de protéase pour minimiser la dégradation des protéines.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mettre en place des cages de population de drosophiles à moyenne échelle. Et faire des extraits de protéines de cellules entières à partir d’embryons.