Manipulation facile des Architectures à base de protéines Hydrogels pour Applications de Culture de cellules

L’objectif global de cette méthodologie est de créer des hydrogels macroporeux avec des pores de différentes tailles pour des applications de culture cellulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la culture cellulaire 3D, telles que la faisabilité principale d’un nouveau matériau hydrogel pour les applications de culture cellulaire 3D. Le principal avantage de cette méthodologie est qu’elle offre une gamme de techniques permettant d’optimiser et d’ajuster un nouveau matériau aux exigences de différents types de cellules.

Pour commencer, diluez un milligramme du peptide RGD ou d’un peptide adhésif cellulaire équivalent dans 100 microlitres d’eau stérile pour obtenir la solution de 10 milligrammes par millilitre. Ensuite, retirez le fond d’une plaque à 96 puits et remplacez-la par une pellicule plastique de retrait. Mélangez 100 microlitres de solution mère BSA et 100 microlitres de solution mère de THPC dans la plaque à 96 puits pour obtenir 200 microlitres d’hydrogel.

Mélangez les composants en pipetant de haut en bas au moins cinq fois pour garantir un hydrogel uniforme après polymérisation. Placez la plaque à 96 puits à température ambiante pendant environ 10 minutes jusqu’à ce que tous les hydrogels soient correctement polymérisés. Après la polymérisation, retirez soigneusement et lentement la pellicule plastique du bas de la plaque.

Pressez les hydrogels hors de la plaque à 96 puits à l’aide d’un petit coup et transférez-les dans des tubes de 1,5 millilitre avec un PBS stérile pH 7,4. Conservez les hydrogels dans une solution saline tamponnée au phosphate à quatre degrés Celsius pendant plusieurs mois maximum. Pour lyophiliser les hydrogels, remplissez d’abord des tubes de 1,5 millilitre avec 500 microlitres d’eau déminéralisée stérile et retirez les bouchons.

Transférez les hydrogels dans les tubes de réaction de 1,5 millilitre à l’aide d’une pince. Enveloppez hermétiquement les tubes de 1,5 millilitre d’un film de paraffine en utilisant au moins trois couches pour chaque flacon. Utilisez une aiguille pour percer de petits trous dans le film afin de permettre la libération de gaz des tubes.

Pour garantir que l’eau et l’hydrogel gèlent complètement, transférez le flacon dans une solution d’azote liquide pendant cinq minutes. Immédiatement après l’élimination de l’azote liquide, transférez les flacons dans le lyophilisateur pour éviter que le matériau ne dégèle. Comme autre étape de congélation, conservez les flacons à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit pour congeler lentement les hydrogels.

Immédiatement après avoir été retirés de moins 20 degrés Celsius, transférez les flacons dans le lyophilisateur pour éviter que le matériau ne dégèle. Après 24 heures et l’évaporation complète de l’eau dans et autour de l’hydrogel, décongelez le matériau en le retirant du lyophilisateur. Pour la lixiviation des particules, mélangez les composants de l’hydrogel comme précédemment.

Après le mélange, ajoutez immédiatement le chlorure de sodium jusqu’à saturation. Ajoutez du sel jusqu’à ce que des cristaux de sel soient visibles dans la solution sous la forme d’un précipité blanc. La taille des pores peut être modifiée en broyant les cristaux de sel avant utilisation.

Transférez la plaque à 96 puits dans un agitateur et agitez jusqu’à ce que la polymérisation ait lieu. Après environ 10 minutes, retirez les hydrogels de la plaque comme précédemment. Incuber les hydrogels pendant au moins 24 heures à température ambiante dans de l’eau stérile sur un rotateur pour éluer tout le sel de la matrice d’hydrogel.

Conservez les hydrogels à quatre degrés Celsius dans du PBS pendant plusieurs mois. Pour une formation en douceur, préparez les hydrogels comme décrit. Retirez ensuite un hydrogel de la solution à l’aide d’une pince.

Retirez l’excès d’eau avec du papier très absorbant et placez-le sur un bloc de glace sèche. Congelez l’hydrogel pendant 30 secondes et retirez-le délicatement du bloc. N’endommagez pas l’hydrogel.

Utilisez soigneusement une spatule pour le gratter du bloc. Transférez l’hydrogel dans un tube de 1,5 millilitre et séchez-le pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Préparez une solution mère de rhodamine B ainsi que des dilutions en série comme décrit dans le protocole de texte.

Retirez l’hydrogel de la solution stockée et transférez-le dans un tube de 1,5 millilitre avec un millilitre de solution de rhodamine B de 0,01 milligramme par millilitre. Colorer l’hydrogel pendant la nuit dans une solution de rhodamine B à température ambiante. Le lendemain, transférez l’hydrogel à visualiser dans 10 millilitres de PBS et lavez pendant au moins trois heures.

Coupez de petites tranches dans l’hydrogel à l’aide d’une lame. Transférez ensuite l’hydrogel sur une lame microscopique à huit puits et recouvrez-la de PBS. À l’aide d’un microscope confocal à balayage laser, visualisez l’hydrogel à une longueur d’onde de 514 nanomètres.

Filtre stérile toutes les solutions mères avec un filtre de 0,45 micron. Commencez la préparation de l’hydrogel et incluez le peptide adhésif cellulaire avant la polymérisation de l’hydrogel. Après avoir mélangé les composants, pipetez immédiatement le mélange dans une lame microscopique à huit puits jusqu’à ce que le fond soit complètement recouvert.

Transférez les cellules dans un milieu de culture cellulaire DMEM stérile préchauffé complété par du sérum de veau fœtal, de la pénicilline, de la streptomycine et une solution d’acides aminés non essentiels. Après avoir compté les cellules à l’aide d’une chambre de comptage Neubauer, pipetez soigneusement 200 microlitres du nombre souhaité de cellules sur la surface de l’hydrogel. Couvrez la lame microscopique à huit puits avec un couvercle et transférez-la dans un incubateur.

Après au moins quatre heures de fixation cellulaire, lavez les cellules deux fois avec 200 microlitres de PBS de culture cellulaire stérile. Ensuite, fixez les cellules avec 200 microlitres de formaldéhyde à 3,7 % pendant 10 minutes à température ambiante et lavez-les deux fois avec du PBS. Perméabiliser les cellules avec 200 microlitres de 0,1 % Triton X pendant cinq minutes avant de laver deux fois de plus avec du PBS.

Colorez les cellules avec de la toluidine rhodamine en mélangeant cinq microlitres de stock méthanolique avec 195 microlitres de PBS et en l’ajoutant aux cellules à température ambiante. Teintez les cellules pendant 20 minutes dans l’obscurité avant de les laver deux fois avec du PBS. Étudiez les propriétés d’adhésion cellulaire à l’aide d’un microscope confocal à 514 nanomètres.

Analysez les propriétés de l’hydrogel comme décrit dans le protocole de texte. Comme le montre ici, les hydrogels polymérisés et colorés n’ont pas d’architectures distinctives. Après la lyophilisation des hydrogels à différentes températures, la taille moyenne des pores à l’intérieur de l’hydrogel peut être étendue jusqu’à 60 microns.

La lixiviation du sel permet d’obtenir des réseaux uniformes avec des tailles de pores d’environ 10 microns. La taille peut être ajustée en broyant des cristaux de sel avant utilisation. L’utilisation d’une approche de congélation par gradient sur un bloc de glace carbonique conduit à la formation de canaux d’un diamètre d’environ 20 microns et d’une longueur de plusieurs centaines de microns.

Avant la fonctionnalisation avec la fraction adhésive cellulaire, les cellules ne peuvent pas adhérer à la surface de l’hydrogel et présentent une morphologie ronde. Ce n’est qu’après avoir fourni au matériau le peptide adhésif cellulaire que les cellules trouvent des points d’adhésion focaux qui permettent une bonne adhérence de la cellule sur un matériau. Ceci est crucial pour l’utilisation de nouveaux matériaux dans les applications de culture cellulaire 3D.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de manipuler l’architecture d’un hydrogel avec des méthodes simples. Cette méthode peut être appliquée à la plupart des nouveaux systèmes d’hydrogel afin d’en savoir plus sur l’utilisation en culture cellulaire et d’optimiser l’architecture de l’hydrogel en fonction de l’utilisation prévue.