Name: Un cadre méthodologique unifié pour la recherche sur le schwannome vestibulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Découvrez une méthode de culture cellulaire primaire minimalement manipulatoire pour le schwannome vestibulaire humain. Ce protocole permet de collecter les sécrétions tumorales et de tester directement les candidats thérapeutiques sur les cellules cultivées.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par les subventions du Département national de la surdité et des autres troubles de la communication R01DC015824 (KMS) et T32DC00038 (en soutenant JES et SD), le ministère de la Défense accorde W81XWH-14-1-0091 (KMS), la Fondation Bertarelli (KMS) , La Nancy Sayles Day Foundation (KMS), le Lauer Tinnitus Research Center (KMS) et la Fondation Barnes (KMS).

<ol><li>Babu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vestibular+schwannomas+in+the+modern+era%3A+epidemiology%2C+treatment+trends%2C+and+disparities+in+management%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Vestibular schwannomas in the modern era: epidemiology, treatment trends, and disparities in management.</a> J Neurosurg. 119 (1), 121-130 (2013).</li>
<li>Gal, T. J., Shinn, J., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+epidemiology+and+management+trends+in+acoustic+neuroma%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Current epidemiology and management trends in acoustic neuroma.</a> Otolaryngol Head Neck Surg. 142 (5), 677-681 (2010).</li>
<li>Propp, J. M., McCarthy, B. J., Davis, F. G., Preston-Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Descriptive+epidemiology+of+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Descriptive epidemiology of vestibular schwannomas.</a> Neuro Oncol. 8 (1), 1-11 (2006).</li>
<li>Stangerup, S. E., Tos, M., Thomsen, J., Caye-Thomasen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((True+incidence+of+vestibular+schwannoma%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">True incidence of vestibular schwannoma?</a> Neurosurgery. 67 (5), 1335-1340 (2010).</li>
<li>Tos, M., Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P., Tos, T., Thomsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+real+incidence+of+vestibular+schwannoma%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">What is the real incidence of vestibular schwannoma?</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 130 (2), 216-220 (2004).</li>
<li>Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+natural+history+of+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and natural history of vestibular schwannomas.</a> Otolaryngol Clin North Am. 45 (2), 257-268 (2012).</li>
<li>Mahaley, M. S., Mettlin, C., Natarajan, N., Laws, E. R., Peace, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+patterns+of+care+of+brain+tumor+patients+in+the+United+States%3A+a+study+of+the+Brain+Tumor+Section+of+the+AANS+and+the+CNS+and+the+Commission+on+Cancer+of+the+ACS%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Analysis of patterns of care of brain tumor patients in the United States: a study of the Brain Tumor Section of the AANS and the CNS and the Commission on Cancer of the ACS.</a> Clin Neurosurg. 36, 347-352 (1990).</li>
<li>Carlson, M. L., Link, M. J., Wanna, G. B., Driscoll, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+sporadic+vestibular+schwannoma%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Management of sporadic vestibular schwannoma.</a> Otolaryngol Clin North Am. 48 (3), 407-422 (2015).</li>
<li>Dilwali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporadic+vestibular+schwannomas+associated+with+good+hearing+secrete+higher+levels+of+fibroblast+growth+factor+2+than+those+associated+with+poor+hearing+irrespective+of+tumor+size%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Sporadic vestibular schwannomas associated with good hearing secrete higher levels of fibroblast growth factor 2 than those associated with poor hearing irrespective of tumor size.</a> Otol Neurotol. 34 (4), 748-754 (2013).</li>
<li>Caye-Thomasen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+and+VEGF+receptor-1+concentration+in+vestibular+schwannoma+homogenates+correlates+to+tumor+growth+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">VEGF and VEGF receptor-1 concentration in vestibular schwannoma homogenates correlates to tumor growth rate.</a> Otol Neurotol. 26 (1), 98-101 (2005).</li>
<li>Koutsimpelas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+VEGF%2FVEGF-R+axis+in+sporadic+vestibular+schwannomas+correlates+with+irradiation+and+disease+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22ORL+J+Otorhinolaryngol+Relat+Spec%22%5BJournal%5D)">The VEGF/VEGF-R axis in sporadic vestibular schwannomas correlates with irradiation and disease recurrence.</a> ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 74 (6), 330-338 (2012).</li>
<li>Dilwali, S., Roberts, D., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+VEGF-A+and+cMET+signaling+in+human+vestibular+schwannomas+and+schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Interplay between VEGF-A and cMET signaling in human vestibular schwannomas and schwann cells.</a> Cancer Biol Ther. 16 (1), 170-175 (2015).</li>
<li>Dilwali, S., Kao, S. Y., Fujita, T., Landegger, L. D., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsteroidal+anti-inflammatory+medications+are+cytostatic+against+human+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Nonsteroidal anti-inflammatory medications are cytostatic against human vestibular schwannomas.</a> Transl Res. 166 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Dilwali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+validation+of+anti-nuclear+factor-kappa+B+therapy+to+inhibit+human+vestibular+schwannoma+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Preclinical validation of anti-nuclear factor-kappa B therapy to inhibit human vestibular schwannoma growth.</a> Mol Oncol. 9 (7), 1359-1370 (2015).</li>
<li>Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+Factors+from+Human+Vestibular+Schwannomas+Can+Cause+Cochlear+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage.</a> Sci Rep. 5, 18599(2015).</li>
<li>Blakeley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+drug+treatments+for+neurofibromatosis+type+2-associated+vestibular+schwannoma%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Development of drug treatments for neurofibromatosis type 2-associated vestibular schwannoma.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 20 (5), 372-379 (2012).</li>
<li>Schroeder, R. D., Angelo, L. S., Kurzrock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF2%2Fmerlin+in+hereditary+neurofibromatosis+2+versus+cancer%3A+biologic+mechanisms+and+clinical+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">NF2/merlin in hereditary neurofibromatosis 2 versus cancer: biologic mechanisms and clinical associations.</a> Oncotarget. 5 (1), 67-77 (2014).</li>
<li>Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+human+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture of human vestibular schwannomas.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Dilwali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+human+Schwann+and+schwannoma+cells%3A+improved+and+simplified+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Primary culture of human Schwann and schwannoma cells: improved and simplified protocol.</a> Hear Res. , 25-33 (2014).</li>
<li>Brown, C. M., Ahmad, Z. K., Ryan, A. F., Doherty, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+expression+in+sporadic+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor expression in sporadic vestibular schwannomas.</a> Otol Neurotol. 32 (1), 158-162 (2011).</li>
<li>Cioffi, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-21+overexpression+contributes+to+vestibular+schwannoma+cell+proliferation+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-21 overexpression contributes to vestibular schwannoma cell proliferation and survival.</a> Otol Neurotol. 31 (9), 1455-1462 (2010).</li>
<li>Doherty, J. K., Ongkeko, W., Crawley, B., Andalibi, A., Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ErbB+and+Nrg%3A+potential+molecular+targets+for+vestibular+schwannoma+pharmacotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">ErbB and Nrg: potential molecular targets for vestibular schwannoma pharmacotherapy.</a> Otol Neurotol. 29 (1), 50-57 (2008).</li>
<li>Aguiar, P. H., Tatagiba, M., Samii, M., Dankoweit-Timpe, E., Ostertag, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comparison+between+the+growth+fraction+of+bilateral+vestibular+schwannomas+in+neurofibromatosis+2+%28NF2%29+and+unilateral+vestibular+schwannomas+using+the+monoclonal+antibody+MIB+1%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochir+%28Wien%29%22%5BJournal%5D)">The comparison between the growth fraction of bilateral vestibular schwannomas in neurofibromatosis 2 (NF2) and unilateral vestibular schwannomas using the monoclonal antibody MIB 1.</a> Acta Neurochir (Wien). 134 (1-2), 40-45 (1995).</li>
<li>Cattoretti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+recombinant+parts+of+the+Ki-67+antigen+%28MIB+1+and+MIB+3%29+detect+proliferating+cells+in+microwave-processed+formalin-fixed+paraffin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections.</a> J Pathol. 168 (4), 357-363 (1992).</li>
<li>Hung, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+study+of+human+vestibular+nerve+schwannoma+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry study of human vestibular nerve schwannoma differentiation.</a> Glia. 38 (4), 363-370 (2002).</li>
<li>Archibald, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+expression+in+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">B7-H1 expression in vestibular schwannomas.</a> Otol Neurotol. 31 (6), 991-997 (2010).</li>
<li>Landegger, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+AAV+vector+enables+safe+and+efficient+gene+transfer+to+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear.</a> Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).</li>
<li>Zinn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Silico+Reconstruction+of+the+Viral+Evolutionary+Lineage+Yields+a+Potent+Gene+Therapy+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector.</a> Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).</li>
<li>Kim, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulforaphane%2C+a+natural+component+of+broccoli%2C+inhibits+vestibular+schwannoma+growth+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Sulforaphane, a natural component of broccoli, inhibits vestibular schwannoma growth in vitro and in vivo.</a> Sci Rep. 6, 36215(2016).</li>
<li>Soares, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+derived+from+human+vestibular+schwannomas+associated+with+poor+hearing+damage+cochlear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells.</a> Neuro Oncol. 18 (11), 1498-1507 (2016).</li>
<li>Lysaght, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+of+human+perilymph%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteome of human perilymph.</a> J Proteome Res. 10 (9), 3845-3851 (2011).</li>
<li>Caye-Thomasen, P., Borup, R., Stangerup, S. E., Thomsen, J., Nielsen, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulated+genes+in+sporadic+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Deregulated genes in sporadic vestibular schwannomas.</a> Otol Neurotol. 31 (2), 256-266 (2010).</li>
<li>Schulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+nerve+microenvironment+for+schwannoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The importance of nerve microenvironment for schwannoma development.</a> Acta Neuropathol. 132 (2), 289-307 (2016).</li>
<li>Torres-Martin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+profiling+in+vestibular+schwannomas+shows+critical+deregulation+of+microRNAs+and+upregulation+in+those+included+in+chromosomal+region+14q32%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Global profiling in vestibular schwannomas shows critical deregulation of microRNAs and upregulation in those included in chromosomal region 14q32.</a> PLoS One. 8 (6), e65868(2013).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Ce manuscrit décrit un cadre méthodologique unifié pour la recherche VS, décrivant le traitement simultané de spécimens humain VS et GAN pour les applications de recherche en aval. À mesure que la recherche VS entre dans l&#39;âge de la médecine de précision, la préparation du même échantillon sous des formes capables de répondre à de nombreuses questions de recherche permettra la découverte d&#39;idées moléculaires, cellulaires, génétiques et protéomiques spécifiques aux patients individuels. <p class="jove_content...

Les schwannomes vestibulaires (VS) sont les néoplasmes les plus fréquents de l&#39;angle de la cerebellopontine, diagnostiqués chez 1 sur 100 000 individus. Bien que non métastatiques, ces tumeurs affectent sévèrement la qualité de vie du patient 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Les personnes touchées vivent généralement avec une perte auditive, un acouphène et un sentiment de plénitude auditive. Les symptômes deviennent de plus en plus débilitants à mesure que la tumeur augmente, provoquant des problèmes d&#39;équilibre, une paralysie faciale et une altération d&#39;autres fonctions du nerf crânien. Des complications potentiellement mortelles dus à la compression du tronc cérébral peuvent également entraîner 7 . Les options de gestion des VS sont essentiellement limitées à l&#39;attente vigilante de tumeurs statiques et de radiothérapie stéréotaxique ou de résection chirurgicale pour les tumeurs croissantes <sUp class = &quot;xref&quot;&gt; 8. L&#39;élimination chirurgicale de ces tumeurs dans les hôpitaux affiliés à la recherche présente l&#39;opportunité d&#39;acquérir et d&#39;analyser le tissu tumoral frais recueilli lors des chirurgies du patient. Une approche chirurgicale spécifique de VS, la résection de translabérine, peut même offrir un accès à l&#39;épithélium sensoriel humain précieux de l&#39;oreille interne et du périlymph. Parce que les VS proviennent d&#39;un nerf sensoriel périphérique ( c.-à-d. Le nerf vestibulaire), il est important de comparer les observations associées aux VS avec celles issues d&#39;un nerf témoin approprié, comme le nerf auriculaire humain (GAN) humain. Les GAN sains sont régulièrement sacrifiés lors de la parotidectomie ou des dissections cervicales et peuvent être utilisés comme modèles robustes pour la physiologie des cellules Schwann saines 9 . Étant donné qu&#39;il n&#39;y a pas de médicaments approuvés par la FDA pour le traitement ou la prévention de VS sporadiques, il est impératif que les chercheurs élucient les mécanismes moléculaires sous-jacentsNismes de la maladie pour identifier les cibles thérapeutiques. Les protéines qui ont montré qu&#39;ils jouent un rôle dans la pathogenèse VS comprennent le Merlin, le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), la cyclooxygénase 2 (COX-2), le facteur nucléaire kappa B (NF-κB), le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-alpha) , Le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), et les molécules de signalisation connexes 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Des avancées récentes ont élargi et amélioré les protocoles pour la collecte, le traitement, la culture et l&#39;étude en aval des schwannomes vestibulaires humains primaires et des tissus nerveux sains 18 , 19 . Cependant, la plupart des protocoles existants sont conçus pour accueillir la préparationDe ces tissus pour une seule demande de recherche en aval ( c.- à-d. Culture cellulaire seule). Cet article présente un cadre méthodologique unifié pour le traitement simultané d&#39;un seul échantillon VS ou GAN humain primaire pour de multiples applications en aval: culture spécifique au type de cellule, extraction de protéines, préservation de l&#39;ARN, collecte de la sécrétion tumorale et fixation des tissus. Ce travail décrit également la collecte et le traitement chirurgicaux du liquide céphalo-rachidien humain (CSF) et du perilymph lors de la résection VS de translabyrinthine, car ces tissus étroitement apparentés peuvent servir de sources importantes de biomarqueurs pour VS. Enfin, ce protocole présente des étapes pour la transduction virale de cellules VS humaines primaires en culture comme une nouvelle application de ce tissu pour une utilisation en thérapie génique.

<table><tbody><tr><td>BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12 mm #1 German Glass Coverslip</td><td>Corning</td><td>354087</td><td>Ou préparez des lamelles avec Corning Laminin (CB-40232) et Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01)</td></tr><tr><td>CELLSTAR 15 mL Tubes à centrifuger, fond conique, graduation,</td><td>Greiner stérile Bio-One</td><td>188161</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 50 mL Tubes à centrifuger, fond conique, graduation,</td><td>Greiner stérile Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture cellulaire CELLSTAR, 60 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de Clostridium histolyticum,</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1639</td><td></td></tr><tr><td>Filtre stérile Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Well Treated TC, Corning</td><td></td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hyperglucose, pyruvate, sans glutamine, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 Pinces, Dumoxel</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td>Autoclave avant utilisation</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pince, pointe standard,</td><td>Inox Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>Autoclave avant utilisation</td></tr><tr><td>Sérum fœtal de bovin, qualifié, régions approuvées par l’USDA, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10437-028</td><td>Aliquote en tubes de 50 mL et stockage en -20&deg ; C congélateur</td></tr><tr><td>Hyaluronidase à partir de testicules de bovins, type I-S, poudre lyophilisée</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP Unité de filtre à seringue, 0,22 & micro ; m, polyéthersulfone, 33 mm, EMD stérile</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde, qualité réactif, cristallin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Avant l’utilisation : Établir des procédures opérationnelles standard basées sur les protocoles disponibles en ligne</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td>Autoclave avant utilisation</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL), 100 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP Inhibiteur de phosphatase</td><td>Comprimés Roche</td><td>04906845001</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Inhibiteur de protéase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88666</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes et pointes de pipette, 5/10/25 mL</td><td>Pilon</td> à homogénéisation <td>plastique variable</td><td></td></tr><tr><td>variable pour microtubes</td><td>E& K Scientific</td><td>EK-10539</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles PrecisionGlide, 27 g x 1 1/2 po</td><td>BD</td><td>301629</td><td></td></tr><tr><td>tampon RIPA</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-115</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater (solution de stabilisation de l’ARN)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger Safe-Lock, polypropylène, 0,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363719</td><td>Autoclave avant utilisation</td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation Safe-Lock, polypropylène, 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td>Autoclave avant utilisation</td></tr><tr><td>Solution saline - injection de chlorure de sodium à 0,9 %, bactériostatique, 20 mL</td><td>Hospira</td><td>0409-1966-05</td><td></td></tr><tr><td>Lames de scalpel - #15</td><td>Outils de science fine</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Tube d’aspiration Schuknecht calibre 24</td><td>Bausch + Lomb</td><td>N1698 42</td><td>Utile pour l’approche chirurgicale (en plus des instruments chirurgicaux otologiques courants) et par exemple un marqueur chirurgical bleu</td></tr><tr><td>Récipient d’échantillons, OU stérile, 4OZ</td><td>Medline</td><td>DYND30331H</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000-C Stéréomicroscope</td><td>Zeiss</td><td>000000-1106-133</td><td></td></tr><tr><td>Combinaison seringue/aiguille, pointe Luer-Lok, 5 ml, 22 g x 1 po.</td><td>BD</td><td>309630</td><td></td></tr><tr><td>Seringue à tuberculine seule, Embout coulissant, 1 mL</td><td>309659</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringue à tuberculine uniquement, Embout coulissant, 3 mL</td><td></td><td></td> Homogénéisateur à ultrasons BD 309656<td></td></tr>, <tr><td>Série 4710, Sonde CV18</td><td>Cole-Parmer</td><td>CP25013</td><td></td></tr></tbody></table>

un cadre méthodologique unifié pour la recherche sur le schwannome vestibulaire

A Unified Methodological Framework for Vestibular Schwannoma Research

Les schwannomes vestibulaires sont les néoplasmes les plus courants de l&#39;angle de la cerebellopontine, ce qui représente 6 à 8% de toutes les croissance intracrânienne. Bien que ces tumeurs provoquent une perte auditive sensiveureure chez 95% des personnes affectées, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent cette perte auditive demeurent insaisissables. Cet article décrit les étapes établies dans notre laboratoire pour faciliter la collecte et le traitement de divers échantillons primaires de tissus humains pour les applications de recherche en aval intégrées à l&#39;étude des schwannomes vestibulaires. Plus précisément, ce travail décrit un cadre méthodologique unifié pour la collecte, le traitement et la culture des cellules Schwann et Schwannoma à partir d&#39;échantillons chirurgicaux. Ceci est intégré aux étapes de traitement en parallèle, maintenant considérées comme essentielles pour la recherche actuelle: la collecte des sécrétions tumorales et nerveuses, la préservation de l&#39;ARN et l&#39;extraction des protéines des tissus collectés, la fixation du tissu pour la préparation des sections,D l&#39;exposition des cellules humaines primaires aux virus adéno-associés pour l&#39;application à la thérapie génique. En outre, ce travail met en évidence l&#39;approche chirurgicale translymérine pour collecter cette tumeur comme une occasion unique d&#39;obtenir l&#39;épithélium sensoriel humain de l&#39;oreille interne et de la périlymph. Des conseils pour améliorer la qualité expérimentale sont fournis et les pièges courants sont mis en évidence.

Les cellules VS humaines primaires en culture, telles qu&#39;établies dans la section 5, peuvent être traitées comme des modèles informatifs pour les processus associés à la maladie dans de nombreuses applications de recherche en aval ( Figure 1 ). Les cellules Schwann saines cultivées dans la section 6 fournissent un point de comparaison direct et instructif. Comme indiqué ci-dessous, des données étendues de VS et GAN traitées selon ce cadre méthodologique ...

Le but de ce protocole est de décrire la collecte et le traitement des échantillons chirurgicaux humains pour de multiples applications en aval dans le schwannome vestibulaire et la recherche de cellules Schwann.

Un cadre méthodologique unifié pour la recherche sur le schwannome vestibulaire

Vestibular schwannomas are the most common neoplasms of the cerebellopontine angle, making up 6-8% percent of all intracranial growths. Though these ...

L'objectif général de cette procédure est de traiter un échantillon de schwannome vestibulaire humain reçu de la salle d'opération afin d'obtenir une culture cellulaire primaire et de recueillir les sécrétions tumorales. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur les schwannomes vestibulaires, notamment la meilleure façon de recevoir, conserver et traiter un échantillon tumoral primaire humain destiné à être utilisé dans plusieurs essais biomoléculaires. Le principal avantage de cette technique réside dans l'utilisation d'une méthode de culture peu manipulatrice pour propager des cellules primaires humaines de schwannome vestibulaire.Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie du schwannome vestibulaire, car des candidats thérapeutiques prometteurs peuvent être testés directement sur des cellules en culture. Commencez par transférer le contenant d'échantillon contenant le prélèvement frais de schwannome vestibulaire ou de nerf grand auriculaire, depuis la glace utilisée pour le transport depuis la salle d'opération, vers une hotte à flux laminaire en laboratoire. Utilisez des pinces stériles pour transférer soigneusement l'échantillon vers le premier des trois tubes de 1,5 millilitre remplis de 1,4 millilitre de PBS extérieur. Fermez chaque tube dès qu’il contient l’échantillon et agitez doucement pour rincer. Placez l’échantillon dans une boîte de Pétri sèche de 60 millimètres et utilisez une pince pour enlever tous les tissus morts dans les zones présentant des vaisseaux sanguins apparents. Utilisez une pince ou une lame de scalpel pour diviser l’échantillon en fragments distincts destinés à la conservation de l’ARN, à l’extraction des protéines, à la collecte des sécrétions, à la fixation et à la culture cellulaire.Transférez le fragment de l'échantillon désigné pour la culture cellulaire vers une nouvelle boîte de culture de 60 millimètres contenant de cinq à huit millilitres de milieu DMEM F12 froid supplémenté. Placez le fragment de schwannome vestibulaire ou de nerf grand auriculaire désigné pour la collecte des sécrétions dans un tube vide de 1,5 millilitre. Commencez par prélever 500 microlitres de DMEM non supplémenté en FBS, dans deux tubes de 1,5 millilitre.Le premier tube servira à recueillir les sécrétions tumorales et le deuxième tube servira de témoin apparié. Placer l'un des tubes contenant le DMEM sur une balance numérique étalonnée. Remettre la balance à zéro, introduire le fragment d'échantillon désigné pour le prélèvement des sécrétions dans le tube et le peser.Noter le résultat, qui représentera le poids du tissu seul. Sous une hotte à flux laminaire, ajuster le volume de DMEM dans le tube à 100 microlitres par 10 milligrammes d'échantillon. Placer le tube contenant l'échantillon de tissu et son témoin apparié dans l'incubateur.Incuber pendant au moins 72 heures afin de recueillir des quantités biologiquement utiles de sécrétions tumorales ou nerveuses. Après une incubation de 72 heures, utiliser une pipette d'un millilitre pour prélever le milieu contenant les sécrétions à partir de l'échantillon. Afin d'éviter des cycles répétés de congélation-décongélation, fractionner le milieu en aliquotes dans de nouveaux tubes selon les analyses en aval prévues.Conserver l'échantillon de tissu d'origine, les sécrétions et le DMEM témoin à moins 80 degrés Celsius jusqu'au démarrage des applications en aval. Commencer la procédure de culture en utilisant une paire de pinces dans chaque main pour séparer le tissu du schwannome vestibulaire en morceaux d'environ un millimètre cube. Ensuite, aspirer le milieu et les morceaux de tumeur à l'aide d'une pipette sérologique de 10 millimètres et transférer l'ensemble du contenu dans un tube conique de 15 millilitres.Centrifuger pendant trois minutes à 1000G à 25 degrés Celsius. Pendant la centrifugation, préparer le milieu de disintégration en combinant 4,7 millilitres de milieu DMEM F12 supplémenté avec 250 microlitres de collagénase et 50 microlitres d'hyaluronidase dans une boîte de culture de 60 millimètres. Après la centrifugation, les fragments tumoraux formeront un culot au fond du tube conique.Aspirez soigneusement et jetez le surnageant. Ensuite, ajoutez deux millilitres de milieu de disintégration contenant une enzyme fraîchement préparée au palais tumoral. Aspirez et expulsez plusieurs fois pour mobiliser le tissu, puis transférez-le dans la boîte de culture de 60 millimètres.Placer la boîte de culture dans l’incubateur pendant 18 heures. Le lendemain, réchauffer le milieu DMEM F12 complété avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Retirer la boîte contenant la culture de schwannome vestibulaire de l’incubateur et la transférer dans la hotte à flux laminaire. À l’aide d’une aiguille de 22 gauge fixée à une seringue de six millilitres, aspirer le milieu contenant la culture et le transférer dans un nouveau tube conique de 15 millimètres.Centrifuger pendant cinq minutes à 1000G et à 37 degrés Celsius. Pendant ce temps, utiliser des pinces stériles pour placer le nombre requis de lamelles en verre recouvertes de polydécylène et de laminine dans une plaque de culture de 24 puits. On peut cultiver de 24 à 32 puits à partir d'un cube de tumeur d'un centimètre de côté ; ainsi, pour la plupart des tumeurs plus petites, prévoir de huit à seize puits de cellules en culture est approprié.Après centrifugation, éliminer le surnageant et re-suspendre le culot cellulaire dans le milieu préchauffé, de manière à obtenir un millilitre de suspension cellulaire par puits prévu. Utiliser une pipette serologique de cinq millilitres pour aspirer deux millilitres de suspension cellulaire et déposer un millilitre dans un puits de la plaque 24 puits. Continuer à aspirer et à déposer le milieu contenant les cellules tumorales, en aspirant par incréments de deux millilitres dont un millilitre est déposé dans chaque puits prévu, jusqu'à ce que la suspension de cellules tumorales soit répartie uniformément entre tous les puits préparés.Placer la plaque 24 puits dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Vérifier la plaque le lendemain : si des débris importants sont observés au fond des puits, changer soigneusement le milieu de chaque puits pour du nouveau milieu de culture DMEM F12 supplémenté, en prenant soin de ne pas détacher les cellules adhérentes. S’il n’y a pas de débris, remettre la plaque dans l’incubateur et effectuer le premier changement de milieu au jour cinq, puis tous les trois jours par la suite.Cette image en champ clair illustre le schéma d'organisation typique des cellules de schwannome vestibulaire en culture. Ces images d'immunofluorescence d'une culture primaire humaine de schwannome vestibulaire ont été prises 48 heures après exposition à l'ink 80 exprimant la GFP, montré en vert. La fluorescence rouge provient de la coloration immunohistochimique à la phalloïdine F-actine, qui marque le cytosquelette, et la fluorescence bleue est due au DAPI, qui colore le noyau.L'encart est une image à plus fort grossissement d'une région de l'image à faible grossissement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de noter les heures auxquelles l'échantillon de sécrétion et l'échantillon de culture ont été placés dans l'incubateur, afin de s'assurer que les étapes ultérieures soient effectuées après les durées d'incubation correctes. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la transduction virale, la fixation, l'immunofluorescence, le traitement par médicament et l'extraction d'ARN peuvent être réalisées pour répondre à des questions supplémentaires, comme la manière dont différents virus s'expriment dans les cellules ou la façon dont l'expression génique change après un traitement médicamenteux.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur les schwannomes vestibulaires pour explorer la manière dont les cellules humaines primaires réagissent à différents médicaments chez des patients vivants ayant subi une chirurgie.

a-unified-methodological-framework-for-vestibular-schwannoma-research

Research

Recherche

JoVE Journal

Cancer Research

Recherche sur le cancer

On décrit une méthode pour mesurer tridimensionnelles réflexes oculaires VESTIBULO (3D VOR) chez l'homme en utilisant une période de six degrés de liberté (6DF) du simulateur de mouvement. Le gain et le désalignement de la VOR angulaire 3D fournissent une mesure directe de la qualité de la fonction vestibulaire. Des données représentatives sur les sujets sains sont...

Tridimensionnelle vestibulaire oculaire Test Reflex aide d&#39;un Six degrés de plate-forme de mouvement de la liberté

Vestibulaire schwannomes (VSS) sont des tumeurs non malignes de cellules de Schwann (SC) origine, associées à des mutations dans le gène suppresseur de tumeur NF2. Nous rapportons, un protocole efficace et reproductible pour l'homme primaire VS culture cellulaire qui permet la manipulation et l'analyse expérimentale moléculaire et cellulaire et récapitule la nature hétérogène de la maladie humaine.

Culture primaire de l&#39;homme vestibulaire schwannomes

Afin d’évaluer les changements morphologiques des nerfs crâniens tels que la perte de neurones structures ou gonflement des nerfs crâniens dans la maladie de Menière (MD) ou à des personnes en bonne santé en vivo, un protocole d’évaluation a été élaboré à l’aide de l’imagerie par résonance magnétique (IRM) . Confirmation par IRM supplémentaire du MD a été réalisée.

In Vivo Analyse morphométrique des humains nerfs crâniens à l’aide de l’imagerie par résonance magnétique oreilles maladie de Menière et des oreilles de l’audition normale

Une nouvelle méthode de réadaptation est présentée pour rééquilibrer le système vestibulaire dans les patients présentant des réponses asymétriques, qui se compose des rotations unidirectionnelles vers le côté plus faible. En modifiant directement la voie vestibulaire plutôt que d'améliorer les aspects multisensoriels de la compensation, l'asymétrie peut être normalisée dans un délai de 1-2 séances et montrer des effets durables.

Utilisation de rotations unidirectionnelles pour améliorer l'asymétrie du système vestibulaire chez les patients atteints de dysfonction vestibulaire

La perception de la gravité est généralement déterminée par la verticale visuelle subjective dans la position droite de la tête. L’évaluation supplémentaire à l’inclinaison de la tête de 15 et 30 degrés dans le plan roulant permet d’augmenter le contenu de l’information pour la détection de la perception graviceptive altérée.

Évaluation de la perception graviceptive statique dans le roll-Plane à l’aide du paradigme vertical visuel subjectif

Dans cet article, nous décrivons la configuration expérimentale, le matériel et les procédures pour évaluer les mouvements oculaires réflexifs, la perception des mouvements de soi et les tâches cognitives sous stimulation vestibulaire magnétique, ainsi que l’orientation anatomique des organes vestibulaires, dans un scanner de tomographie par résonance magnétique 7 Tesla (7T-MRT).

Mesure de l’influence de la stimulation vestibulaire magnétique sur le nystagmus, la perception du mouvement de soi et les performances cognitives dans un MRT 7T

Ici, nous décrivons une technique de prélèvement d’organes vestibulaires humains dans des conditions physiologiques lors d’une labyrinthectomie et leur analyse à l’aide de l’immunomarquage.

Prélèvement des organes vestibulaires terminaux dans des conditions physiologiques lors d’une labyrinthectomie

La méthodologie a exploré les contributions visuelles et vestibulaires à la stabilisation du regard pendant les rotations optocinétiques et du corps entier. Les stimulations ont été réalisées par le biais d’essais visuels, vestibulaires et visuo-vestibulaires. Le gain de mouvement oculaire en torsion et les fréquences du nystagmus ont servi d’indicateurs pour le relais sous-cortical des informations de mouvement spécifiques sensorielles vers la réponse réflexe du tronc cérébral pour chaque...

Utilisation de l’oculométrie pour évaluer l’importance relative de l’entrée visuelle et vestibulaire dans le traitement du mouvement sous-cortical dans le plan de roulis

La prise en charge d’un cancer du poumon récurrent isolé dans un champ préalablement irradié est un défi. Ici, nous décrivons une injection de cisplatine guidée par échographie endobronchique (EBUS) pour la prise en charge des patients présentant une récidive localisée du cancer du poumon dans un champ précédemment irradié.

Endobronchique guidée par échographie injection intratumorale de cisplatine pour le traitement des Isolated médiastinale Récurrence du cancer du poumon

Les souris porteuses du carcinome du côlon 26 (C26) représentent un modèle classique de cachexie cancéreuse. La fonte musculaire progressive se produit en association avec la croissance tumorale, la surexpression des ubiquitine ligases spécifiques aux muscles et la réduction de la section transversale musculaire. Une perte de graisse est également observée. La cachexie est étudiée de manière dépendante du temps avec une sévérité croissante de l’émaciation.

Le Colon-26 Carcinome portant une tumeur de la souris comme modèle pour l&#39;étude du cancer cachexie

Découvrez une méthode de culture cellulaire primaire minimalement manipulatoire pour le schwannome vestibulaire humain. Ce protocole permet de collecter les sécrétions tumorales et de tester directement les candidats thérapeutiques sur les cellules cultivées.

Un cadre méthodologique unifié pour la recherche sur le schwannome vestibulaire

Explorer plus de vidéos