Name: In Vitro Polymérisation de l’actine F sur Endosomes précoces (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Découvrez la polymérisation de l'actine F sur des endosomes précoces à l'aide d'un test in vitro basé sur la microscopie. Cette méthode permet d'étudier la dynamique de l'actine dans le trafic membranaire cellulaire.

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Prise en charge a été reçue de la Swiss National Science Foundation ; le programme Suisse Sinergia ; le helvético-polonaise recherche Programme (PSPB-094/2010) ; PRN en biologie chimique ; et LipidX de l’initiative Suisse SystemsX.ch, évaluée par la Swiss National Science Foundation (à G.). M. O. a été soutenu par une bourse à long terme de l’EMBO (Fota-516-2012).

1. solutions et préparations Remarque : tous les tampons et les solutions doivent être préparées en bidistillée (dd) H 2 O. Parce que l’état d’hydratation du saccharose varie, la concentration finale de toutes les solutions de saccharose doit être déterminée à l’aide d’un réfractomètre.
<ol><li>Prepare tampon phosphate salin sans les cations divalents (PBS-) : 137 mM CCNI, KCl 2,7 mM, 1,5 mM KH 2 PO 4 et 6,5 mM Na 2 HPO 4. Ajuster le pH à 7,4. Stériliser à l’autoclave (1 cycle à 121 ° C pendant 15 min) et conserver à température ambiante.</li>
	<li>Préparer la solution mère de l’imidazole 300 mM : 0,204 g d’imidazole dans 10 mL de ddH 2 O.Adjust le pH à 7,4 à 4 ° C à l’aide de HCl filtrer-stériliser à l’aide d’un 0,22 μm filtre de taille des pores et conserver à 4 ° C.</li>
	Tampon <li>Prepare homogénéisation (HB ; préparer 100 mL environ) : saccharose de 250 mM à l’imidazole de 3 mM. Ajuster le pH à 7,4 à 4 ° C à l’aide d’un pH-mètre. Filtre-stériliser à l’aide d’un filtre de taille de pore de 0,22 μm et conserver à 4 ° C. complément le HB juste avant usage avec un cocktail d’inhibiteurs de la protéase à concentrations finales correspondant à leupeptine de 10 mM, 1 mM pepstatine A et 10 ng/mL aprotinine.</li>
	<li>Pour les gradients de flottaison étape, préparer les 62 %, 39 % et 35 % de sucrose solutions en imidazole de 3 mM, pH 7,4, tel que décrit ci-dessous. Déterminer avec précision la concentration finale de toutes les solutions de saccharose à l’aide d’un réfractomètre.
	<ol><li>Préparer 100 mL de solution de saccharose de 62 % en imidazole de 3 mM, pH 7,4. Dissoudre en remuant 80,4 g de saccharose à FD 2 O préchauffée à 35 ° C. Ajouter 1 mL de solution mère de 300 mM imidazole et remplissage à 100 mL avec FD 2 O. ajuster le pH à 7,4 à 4 ° C. filtre-stériliser à l’aide d’un filtre de taille de pore μm et 0,22 à 4 ° C.</li>
		<li>Préparer 100 mL d’une solution d’imidazole de 3 mM, pH 7,4 a 35 % de sucrose. Dissoudre en remuant 40,6 g de saccharose dans ddH 2 O. Ajouter 1 mL de solution mère de 300 mM imidazole et compléter à 100 mL avec FD 2 O. ajuster le pH à 7,4 à 4 ° C. filtre-stériliser en utilisant un 0,22 μm filtre de taille des pores et conserver à 4 ° C.</li>
		<li>Préparation de 50 mL de 39 % de sucrose dans imidazole de 3 mM, pH 7,4. Diluer la solution de saccharose de 62 % avec la solution de saccharose de 35 %. Conserver à 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Dissoudre 3 g du paraformaldéhyde (PFA) en le remuant dans 100 mL de PBS-pre-warmed à 60 ° C tout en ajoutant goutte à goutte de 1 NaOH M ; ajuster le pH final de 7,4 à l’aide de NaOH. Filtre-stériliser à l’aide d’un filtre de taille de pore de 0,22 μm et conserver à -20 ° C. 
	ATTENTION : 3 % PFA est un réactif toxique.</li>
	<li>Solution mère préparer 1 M KCl. Dissoudre 3,73 g de KCl par agitation dans 50 mL de ddH 2 O. filtre-stériliser à l’aide d’un filtre de taille de pore de 0,22 μm et conserver à température ambiante.</li>
	<li>Solution préparer 50 X concentré contenant 0,625 M Hepes à pH 7,0 et 75 mM MgOAc 2 ddH 2 O. aliquote et magasin à -20 ° C.</li>
	Milieu de montage <li>Prepare. Mélanger en remuant 2,4 g de poly(vinyl alcohol) M w ~ 31 000 (PVA) avec 6 g de glycérol. Ajouter 6 mL de ddH 2 O et laisser pendant au moins 2 h à température ambiante. Ajouter 12 mL de 0,2 M Tris-Cl (pH 8,5) et la chaleur à environ 53 ° C avec occasionnels en remuant jusqu'à ce que le PVA a dissous.</li>
	<li>Clarifier la solution par centrifugation à 5 000 x g pendant 20 min à température ambiante. Récupérer le surnageant et ajouter 2,5 % (p/v) 1, 4 - diazabicyclo-[2.2.2] octane (DABCO) pour empêcher le photoblanchiment pendant la détection de la fluorescence. Vortex pour environ 30 s pour dissoudre. Aliquote dans 1,5 mL tubes en plastique et les conserver à -20 ° C.</li>
</ol> 2. Culture cellulaire <ol><li>cellules HeLa Culture Dulbecco &#39; s Modified Eagle moyenne additionné de sérum de veau foetal de 10 %, 10 % acides aminés non essentiels 10 % L-glutamine et 1 % la pénicilline-streptomycine. Maintenir à 37 ° C dans une étuve à 5 % CO 2.</li>
	<li>Transfecter les cellules 24h avant l’expérience avec GFP-RAB5 10, utilisant le réactif de transfection commerciale selon le fabricant &#39; instructions de s.</li>
	<li>Si nécessaire, préparer des fractions d’endosomale et le cytosol des cellules appauvri d’une protéine d’intérêt (p. ex., à l’aide d’Arni ou CRISPR/Cas9) et/ou surexprimant une forme type sauvage ou mutant de la protéine d’intérêt.</li>
</ol> 3. Préparation de Fraction endosomale Remarque : ce protocole décrit la préparation simple de fractions subcellulaires contenant des endosomes et les autres membranes légères. Le cas échéant, les fractions purifiées endosome peuvent également être utilisée 11. Préparer 2 boîtes de Pétri (diamètre extérieur de 10 cm, 57 cm 2) de cellules confluentes exprimant GFP-RAB5 comme matériau de départ. Le nombre total de cellules HeLa confluentes dans 2 boîtes de Pétri correspond grosso modo à 2,5 x 10 7 cellules. Lorsque nécessaire, les endosomes peuvent également être préparés de cellules appauvries d’une protéine d’intérêt (p. ex., à l’aide d’Arni ou CRISPR/Cas9) et/ou surexprimant une forme type sauvage ou mutant de la protéine d’intérêt, exprimant toujours GFP-RAB5.
 attention : toutes les étapes du protocole fractionnement doivent être effectuées sur glace
<ol><li>Placer les boîtes de Pétri sur une plaque de métal humide dans un seau à glace plat et laver immédiatement les cellules deux fois avec 5 mL de PBS glacee-.</li>
	<li>Retirer tous les PBS - le dernier lavage et ajouter 3 mL de PBS-glacee par plat. Cellules ne devraient pas sécher lors de la manipulation : si nécessaire, placer le bac à glaçons sur une plate-forme bascule de couvrir adéquatement les cellules avec le fluide.</li>
	<li>Supprimer mécaniquement les cellules dans du PBS depuis les boîtes de Pétri à l’aide d’un policier en caoutchouc souple (c.-à-d., racleur de cellule de maison). Grattez les cellules hors les plats tout d’abord dans un mouvement rapide et circulaire autour de l’extérieur du plat, suivi d’un mouvement vers le bas au milieu du plat. Gratter délicatement pour obtenir &#34; feuilles &#34; de cellules attachées. Transférer doucement les cellules à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique avec une large ouverture pour un tube en polypropylène 15 mL conique sur Ice.</li>
	<li>Centrifuger pendant 5 min à 175 g et 4 ° C.</li>
	<li>Délicatement retirer le surnageant (SN) et ajouter 1 à 3 mL de HB au culot. À l’aide d’une pipette Pasteur en plastique avec une large ouverture, Pipetez doucement monter et descendre une fois pour remettre en suspension les cellules.</li>
	<li>Centrifugeuse pendant 7-10 min à 1 355 x g et 4 ° C. doucement Retirez le SN.</li>
	<li>Effectuer l’homogénéisation de la cellule. 
	Remarque : Les Conditions devraient être douces afin que les membranes plasmiques des cellules sont cassées mais les endosomes restent intacts.
	<ol><li>Ajouter un volume connu d’HB par inhibiteurs de protéase sur chaque culot cellulaire (environ 100 μL / culot cellulaire). À l’aide d’une micropipette 1 000 µL, Pipetez doucement haut et en bas, jusqu'à ce que les cellules sont remises en suspension. Ne pas introduire des bulles d’air.</li>
		<li>Préparer une seringue de 1 mL tuberculine avec une aiguille de 22G rincée au préalable avec HB et exempte de bulles d’air.</li>
		<li>Remplir la seringue avec la suspension de cellules relativement lentement (pour éviter de créer des bulles d’air), placer l’extrémité biseautée de l’aiguille contre la paroi du tube et expulser de la suspension cellulaire rapidement à cisaillement hors les membranes plasmiques des cellules attachées.</li>
		<li>Prendre une petite portion de l’homogénat (environ 3 µL) et le diluer dans 50 µL de HB sur une lame de verre. Mélanger et recouvrir d’une lamelle de verre. Inspecter l’homogénat sous un microscope à contraste de phase avec un 20 X ou 40 X objectif. 
		Remarque : Dans des conditions optimales, la plupart des cellules sont brisées, mais les noyaux, qui apparaissent comme des gris foncé et autour de structures, ne sont pas ( Figure 1).</li>
		<li>Répéter l’étape 3.7.3 et 3.7.4 jusqu'à ce que la plupart des cellules est cassés ; 3-6 coups de va-et-vient à travers l’aiguille sont généralement nécessaires. Garder une petite aliquote (10-30 µL) de l’homogénat pour dosage de la protéine.</li>
	</ol></li> <li>Homogénat centrifugation pendant 7 min à 1 355 x g et 4 ° C. 
	Remarque : après centrifugation, le culot (défini comme le culot nucléaire ; NP) contient le noyau et le surnageant (défini comme le surnageant post-nucléaire ; PNS) contient le cytosol et les organites sortis après homogénéisation et en suspension libre.</li>
	<li>Recueillir soigneusement le PNS. Conserver les petites parties aliquotes (10-30 µL) de la PNS et NP pour détermination des protéines et d’ignorer le NP.</li>
	<li>Régler le PNS à 40,6 % de saccharose en diluant la solution de saccharose de 62 % par PNS un ratio de 1:1.1 de PNS:62 % de sucrose. Mélanger doucement mais complètement, sans créer de bulles d’air. Vérifier la concentration de saccharose à l’aide du réfractomètre.</li>
	<li>Placer le PNS dans 40,6 % de sucrose au fond d’un tube d’ultracentrifugation. Overlay avec soin avec 2,5 mL de la solution de saccharose de 35 % et de remplir le tube à centrifuger de HB. 
	Remarque : Les solutions de saccharose devraient être superposées pour que les interfaces sont bien visibles.</li>
	<li>Ultracentrifugeuse les gradients pendant 1 h à ̴165, 000 x g et 4 ° C.</li>
	<li>Retirer délicatement la couche blanche de lipides au sommet de la pente. Ensuite, recueillir l’interface contenant des endosomes, entre le HB et 35 % de sucrose, à l’aide d’une micropipette 200 μL avec une pointe coupée. 
	Remarque : Les fractions endosomale peut être utilisées directement dans l’analyse de la polymérisation d’actine in vitro ou peut être aliquotés sur la glace, flash-congelés dans l’azote liquide et stockées à -80 ° C.</li>
	<li>Déterminer la concentration de protéine des fractions PNS et endosomale. 
	NOTE : Cette concentration doit être au moins 100 µg/mL. Environ 2,5 x 10 7 cellules cultivées dans 2 boîtes de Pétri sont nécessaires pour obtenir un PNS avec au moins 100 µg/mL (voir la Note ci-dessus).</li>
</ol> 4. Préparation du cytosol Remarque : préparer 2 boîtes de Pétri (10 cm de diamètre ; 57 cm 2) de cellules HeLa confluentes comme matériau de départ. Lorsque nécessaire, le cytosol peut également être préparé de cellules appauvries d’une protéine d’intérêt (p. ex., à l’aide d’Arni ou CRISPR/Cas9) et/ou surexprimant un type sauvage ou la forme mutante de la protéine d’intérêt. En ce qui concerne le protocole de fractionnement endosome, toutes les étapes doivent être suivies sur Ice.
<ol><li>Répétez les étapes 3.1-3.8.</li>
	<li>Placer le PNS dans un tube à centrifuger et ultracentrifugeuse pendant 45 min à ̴250, 000 x g et 4 ° C.</li>
	<li>Soigneusement retirer la couche blanche sur le dessus et recueillir le SN (fraction cytosol) sans déranger le culot microsome. Garder une partie aliquote de la fraction cytosol pour dosage de la protéine. 
	Remarque : Le cytosol est utilisable directement dans l’analyse de la polymérisation d’actine in vitro ou peut être aliquotés sur la glace, flash-congelés dans l’azote liquide et stockées à -80 ° C.</li>
	<li>Déterminer la concentration de protéine du cytosol. 
	Remarque : Il doit être au moins de 3 mg/mL.</li>
</ol> 5. Dosage de polymérisation de l’actine Endosome dépendant de mesure In Vitro Remarque : polymérisation de l’actine Endosome-dépendantes peut être effectuée à l’aide de deux approches alternatives. Dans la première approche, les matériaux sont mélangés dans un tube à essai, fixe et transférés à un lamelle couvre-objet et analysés. Dans la deuxième approche, décrite ici, le test peut être effectué directement dans la chambre d’imagerie et peuvent être fixes et analysé sans perturbations mécaniques ( Figure 2). Dans cette deuxième approche, le mélange d’essai n’est pas transféré d’un tube à essai à un lamelle couvre-objet et reste donc non perturbé, diminuant le danger des réseaux d’actine F étant physiquement perturbé pendant le transfert. En outre, cette seconde approche est compatible avec une analyse Time-lapse de la polymérisation de l’actine F. Il est à noter qu’on a observé aucune différence dans l’analyse de la polymérisation de l’actine F avec deux approches. 
Remarque : Utilisation coupe conseils tout au long du protocole.
<ol><li>Dans un tube à essai <ol><li>doucement mélange glacé purifié GFP-RAB5 endosomes (étape 3) avec le cytosol (étape 4) dans un rapport de 01:10 (concentration de protéines) dans un tube à essai conique glacé 1,5 mL. 
		NOTE : Une expérience typique s’effectue environ 40-50 µl.</li>
		<li>Régler le mélange de la réaction glacée à la concentration finale de 125 mM de KCl (à l’aide de la solution mère de KCl 1 M), Hepes de 12,5 mM et 1,5 mM MgOAc 2 (en utilisant le 50 x solution mère). Ensuite, réglez le mélange avec les inhibiteurs de la protéase à la concentration finale de 10 mM leupeptine 1 mM pepstatine A et 10 ng/mL aprotinine. Mélanger délicatement tous les composants.</li>
		<li>Le tube à essai contenant le mélange réactionnel à 37 ° C, sans trembler et incuber pendant le temps désiré. 
		Remarque : En règle générale, il faudra environ 3 min pour détecter la polymérisation de l’actine sur endosomes et 30 min pour la formation d’un vaste réseau.</li>
		<li>à l’heure souhaitée (c.-à-d., 3 min ou 30 min), arrêter la réaction en plaçant le tube à essai sur la glace et ajouter 1/10 (dilution) de la solution PFA 3 % rafraîchie.</li>
		<li>Ajoute 0.3:10 (dilution) de 200 unités/mL (~6.6 μM) phalloïdine, conjugué au colorant rouge-orange pour colorer l’actine polymérisée.</li>
		<li>Place 12 μL de mélange sur 12 μl de milieu de montage de PVA sur une lame de verre micro. Mettre un plateau en verre coverslipon 18 x 18 mm 2.</li>
		<li>Analyser l’échantillon avec la microscopie confocale.</li>
	</ol></li> <li>Dans la chambre d’imagerie <ol><li>pour faire des chambres d’imagerie microscopiques, utiliser plasma pendant 1 min pour nettoyer une lamelle ronde 18 mm de diamètre et un rond 35 mm de diamètre équipé d’un fond de verre de 20 mm boîte de Pétri (0,16-0,19 mm).</li>
		<li>Incuber les surfaces nettoyées avec 1 % de β-caséine pendant 20 min réduire au minimum la liaison aux protéines pour le verre. Laver deux fois avec de l’imidazole de 3 mM.</li>
		<li>Ajouter endosome et le cytosol, dans le même dosage mélange tout comme aux étapes 5.1.1 et 5.1.2, dans un tube à essai rafraîchies 1,5 mL et compléter le mélange de dosage avec 0,1 μg/μL rhodamine-actine.</li>
		<li>Ajuster l’indice de réfraction final du mélange à 1,375 (26,5 % de sucrose) à l’aide de la solution de sucrose à 39 %. 
		Remarque : En général, le même volume est ajouté ; Toutefois, cela doit être empiriquement réajustée en fonction de la concentration de saccharose de la fraction recueillie, déterminée à l’aide d’un réfractomètre, étant donné que la concentration de saccharose peut changer un peu d’expérience à expérience.</li>
		<li>Placer le mélange sur le plat de 35 mm prétraité (étape 5.2.1) et couvrir avec la lamelle de 18 mm prétraitée (étape 5.2.1).</li>
		<li>Placer la chambre à 37 ° C, sans agiter.</li>
		<li>Analyser l’échantillon à l’aide de la microscopie confocale à fluorescence.</li>
	</ol></li></ol> 6. Ac de l’imagequisition et analyse du réseau d’actine <ol><li>d’acquisition d’images <ol><li>acquérir les images sur un microscope confocal balayage inversé. 
		NOTE : Paramètres d’acquisition Image ont été optimisées pour un microscope confocal balayage inversé avec un objectif d’huile NA 63 X 1,25. Ajuster la puissance du laser (généralement autour de 50 %) pour atteindre un bon rapport signal-bruit.</li>
	</ol></li> <li>Quantifier le réseau d’actine <ol><li>analyser les micrographies fluorescents. Utilisez le logiciel opensource CellProfiler (v2.1.1) 12 pour mesurer la quantité d’actine par endosome (logiciel alternatif peut être utilisé).
		<ol><li>Tout d’abord, identifiez les endosomes comme l’objet principal en utilisant le signal de GFP-RAB5. Puis, quantifier l’actine F associée à des endosomes individuels à l’aide de la propagation du signal actine (colorant rouge-orange conjuguées phalloïdine) comme un objet secondaire.</li>
			<li>Moyenne et normaliser le nombre de documents connexes pour chaque objet à la condition contrôle.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

L’actine joue un rôle crucial dans l’endosome membrane dynamique4,14. Nous avons déjà indiqué que la polymérisation et nucléation de l’actine se produisent dans les endosomes précoces, formant des petits correctifs d’actine F ou réseaux. Ces réseaux d’actine F est absolument requis pour le transport membranaire au-delà des endosomes précoces le long de la voie de dégradation. Intervenir à n’importe quelle étape de ce processus de nucléation et polymérisation empê...

Dans les cellules eucaryotes supérieurs, les protéines et les lipides sont internalisés dans les endosomes précoces où tri se produit. Certaines protéines et les lipides, qui sont destinés à être réutilisés, sont incorporés dans des régions tubulaires des endosomes précoces et ensuite transportées vers la membrane plasmique ou pour le trans-Golgi network (TGN)1,2. En revanche, les autres protéines et des lipides sont emballés sélectivement en régions des endosomes précoces qui présentent un aspect multivésiculaires. Développer ces régions et, sur le détachement des membranes d’endosomes précoces, éventuellement mature gratuit endosomale transporteur vésicules ou multivésiculaires (VME/Mvc), qui sont chargés du transport de marchandises vers la fin des endosomes1, 2.
L’actine joue un rôle crucial dans le processus de remodelage de membrane associé à la capacité de tri endosomal et endosome biogenèse. Protéine triant le long des voies de recyclage à la membrane plasmique ou le TGN dépend de la retromer complexe et les protéines associées. Ce mécanisme de tri semble être couplée à la formation de recyclage tubules par interactions de la retromer complexe, avec la guêpe et cicatrice homologue (WASH) complexe et ramifié actine3,4,5 . En revanche, molécules destinées à la dégradation, particulièrement active les récepteurs de signalisation, sont triés dans des vésicules intraluminal (ILVs) par les endosomes tri complexes requis pour le transport (ESCRT)2,6, 7. Alors qu’on ne connaît pas le rôle éventuel de l’actine dans le processus de tri ESCRT dépendant, F-actine joue un rôle important dans la biogenèse des VME/MVC et transport au-delà des endosomes précoces. En particulier, nous avons constaté qu’annexine A2 lie régions enrichies en cholestérol et avec spire1 de l’endosome précoce, nucléation de polymérisation de l’actine-F. La formation du réseau ramifié actine observée sur les endosomes requiert l’activité de ramification de la protéine liée à l’actine (ARP) 2/3 complexe, ainsi que la moésine de protéine ERM et la liaison de l’actine protéine cortactin8,9.
Nous décrivons ici une analyse axée sur la microscopie in vitro qui reconstitue la nucléation et la polymérisation de l’actine F sur les membranes endosomes précoces dans des éprouvettes. Ce test a été utilisé précédemment pour enquêter sur le rôle de l’annexine A2 dans la nucléation de l’actine F et de la moésine et cortactin dans la formation d’endosomes actine réseaux8,9. Avec ce protocole in vitro , la série complexe de réactions qui se produisent sur les endosomes au cours de la polymérisation de l’actine se prête à l’analyse biochimique et moléculaire des étapes du processus, y compris de nucléation de l’actine, linéaire polymérisation, ramification et réticulation.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Acros Organics</td><td>196770010</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>AppliChem</td><td>A1042</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Acros Organics</td><td>424370025</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>AppliChem</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiun acétate tétrahydraté</td><td>Fluka</td><td>63047</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A2948</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10125</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fluka</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Merck Millipore</td><td>107687</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Roche</td><td>11017101001</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatine</td><td>Roche</td><td>10253286001</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Roche</td><td>10236624001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehide</td><td>Polysciences. Inc</td><td>380</td><td></td></tr><tr><td>Sondes moléculaires</td><td>Alexa Fluor 555 Phalloïdine</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr>Cytosquelette<td>d’actine rhodamine</td><td>. Inc</td><td>APHR-A</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>poly(alcool vinylique), Mw ~31 000</td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2522</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-caséine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6905</td><td></td></tr><tr><td>Filtre 0.22 &mu ; m</td><td>Millex</td><td>SL6V033RS</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes rondes de 10 cm pour culture cellulaire</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur en plastique</td><td>Assistent</td><td>569/3 40569003</td><td></td></tr><tr><td>Tube en polypropylène de 15 mL</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille hypodermique 22G Noir 30mm</td><td>BD Microlance</td><td>300900</td><td></td></tr><tr><td>Seringues stériles Luer-slip 1mL sans aiguille</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Micro lames de verre</td><td>Assistent</td><td>2406</td><td></td></tr><tr><td>18 x 18 mm lamelle en verre</td><td>Assistent</td><td>1000/1818</td><td></td></tr><tr><td>SW60 tube à centrifuger</td><td>Beckman soc</td><td>344062</td><td></td></tr><tr><td>TLS-55 tube à centrifuger</td><td>Beckman 343778</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200-&mu ; L embout jaune</td><td>Starlab</td><td>S1111-0706</td><td></td></tr><tr><td>1 000-&mu ; L Bleu Pointe graduée</td><td>Starlab</td><td>S1111-6801</td><td></td></tr><tr><td>Tube à essai de 1,5 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C 311-04-051</td><td></td></tr><tr><td>Lamelle ronde de 18 mm de diamètre</td><td>Assistent</td><td>1001/18</td><td></td></tr><tr><td>Plat rond de 35 mm de diamètre avec fond en verre de 20 mm (0,16 - 0,19 mm)</td>Réfractomètre <td>In vitro Scientific</td><td>D35-20-1,5-N</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Carl Zeiss</td><td>79729</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur de plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX80 Ultracentrifugeuse</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46900</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse de table</td><td>Beckman Soc</td><td>TL-100</td><td></td></tr><tr><td>SW60 Soc</td><td>Beckman</td><td>335649</td><td></td></tr><tr><td>TLS-55 Rotor</td><td>Beckman</td><td>346936</td><td></td></tr><tr><td>Microscopie confocale</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM-780</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD réactif de transfection</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de dosage des protéines A</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0113</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de dosage des protéines B</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0114</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de dosage des protéines S</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0115</td><td></td></tr><tr><td>Grattoir</td><td>cellulaire Fait maison</td><td></td><td>Pièce en caoutchouc de silicone d’environ 2 cm, coupée à un angle très aigu et fixée à une barre métallique ou maintenue à l’aide d’une pince</td></tr><tr><td>Réfractomètre</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Eagle (MEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0643</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PH-mètre 691</td><td>Metrohm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td></td><td></td><td>NIH, Bethesda MD</td></tr></tbody></table>

in vitro polymérisation de l’actine f sur endosomes précoces

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Beaucoup de fonctions endosome précoce, particulièrement fret protéine membranaire de tri et de déformation, dépendent des patchs de courts filaments d’actine F nucléées sur la membrane endosomale. Nous avons établi une analyse axée sur la microscopie in vitro qui reconstitue la nucléation et la polymérisation de l’actine F sur les membranes endosomale précoce dans des éprouvettes, rendant ainsi cette série complexe de réactions se prêtent à la génétique et biochimique manipulations. Endosomale fractions sont préparées par flottaison dans les gradients de sucrose de cellules exprimant la protéine d’endosomes précoces GFP-RAB5. Fractions cytosoliques sont préparées à partir des lots distincts de cellules. Les endosomes et les fractions cytosoliques peuvent être stockées congelés dans l’azote liquide, si nécessaire. Dans l’essai, les endosomes et les fractions cytosoliques sont mélangées, et le mélange est incubé à 37 ° C dans des conditions appropriées (par exemple, force ionique, réduisant l’environnement). À l’heure souhaitée, le mélange réactionnel est fixe, et l’actine-F se révèle avec la phalloïdine. Polymérisation et nucléation de l’actine sont ensuite analysés par microscopie à fluorescence. Nous rapportons ici que ce test peut être utilisé pour étudier le rôle des facteurs qui jouent un rôle dans la nucléation de l’actine sur la membrane ou l’allongement subséquent, ramification ou réticulation des filaments d’actine-F.

Mieux comprendre la formation de taches d’actine F sur les membranes endosome précoce, nous avons suivi le protocole indiqué dans la Figure 2. En bref, les cellules ont été transfectées avec GFP-RAB5 et puis les endosomes précoces ont été préparés par fractionnement subcellulaire. Ces purifiées endosomes précoces ont été incubées avec cytosol afin de fournir l’actine lui-même ainsi que d’autres facteurs éventuellement impliqués dans la réaction. À la fin de l...

Début endosome fonctions dépendent de la polymérisation de l’actine-F. Nous décrivons ici une analyse axée sur la microscopie in vitro qui reconstitue la nucléation et la polymérisation de l’actine F sur les membranes endosomale précoce dans des éprouvettes, rendant ainsi cette série complexe de réactions se prêtent à biochimiques et génétiques manipulations.

In Vitro Polymérisation de l’actine F sur Endosomes précoces

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

L'objectif général de cet essai in vitro basé sur la microscopie est d'étudier la polymérisation de l'actine à partir des endosomes in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines du trafic membranaire et de l'actine, telles que le rôle de l'actine dans la voie acide. Le principal avantage de cette technique réside dans la reconstitution de la nucléation et de la polymérisation de l'F-actine sur les membranes des endosomes précoces dans un tube à essai.Cela rend cette série complexe de réactions accessible à mes manipulations chimiques. La procédure sera démontrée par Jorge Larios et Olivia Muriel du laboratoire. Commencez par placer des boîtes de cellules HeLa sur une plaque métallique humide dans un seau à glace plat.Et laver les cellules deux fois avec cinq millilitres de PBS glacé. Après avoir retiré le PBS du dernier lavage, ajouter trois millilitres de PBS glacé par boîte. Ensuite, utiliser un racloir en caoutchouc souple pour détacher les cellules des boîtes par un mouvement circulaire rapide autour du bord extérieur de la boîte.Suivi d'un mouvement descendant au milieu de la boîte. Racler doucement pour obtenir des feuillets de cellules

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Les auteurs décrivent comment les techniques micro - et photomanipulation comme FRAP et photoactivation permettent la détermination des paramètres de la motilité et la dynamique spatio-temporelle des protéines au sein de la migration des cellules. Afficheurs expérimentales incluent dynamique subcellulaire et chiffre d’affaires de régulateurs de la motilité ou du cytosquelette d’actine sous-jacent.

Techniques de micromanipulation permettant l’analyse de la dynamique morphogénétique et chiffre d’affaires des organismes de réglementation du cytosquelette

Nous rapportons une analyse simple, rapide et à haut débit basée sur la spectroscopie de fluorescence pour la quantification des filaments d’actine dans des échantillons biologiques ex vivo des tissus cérébraux des rongeurs et des sujets humains.

Un test basé sur la spectroscopie de fluorescence à temps efficace pour évaluer l’état de polymérisation de l’actine dans les tissus cérébraux des rongeurs et des humains

Nous présentons des protocoles pour des tests microfluidiques de filaments d’actine simples, en combinaison avec la microscopie à fluorescence, qui permettent de surveiller avec précision les filaments d’actine individuels en temps réel tout en les exposant séquentiellement à différentes solutions protéiques.

Utilisation de la microfluidique et de la microscopie à fluorescence pour étudier la dynamique d’assemblage des filaments et des faisceaux d’actine unique

Ce protocole décrit la formation de bicouches lipidiques soutenues et l’ajout de filaments cytosquelettiques et de protéines motrices pour étudier la dynamique de réseaux cytosquelettiques reconstitués et attachés à la membrane à l’aide de la microscopie à fluorescence.

Reconstitution de cortex minimembranaires d’actine sur des bicouches lipidiques soutenues

Dans ce manuscrit, nous démontrons les techniques expérimentales pour encapsuler le cytosquelette F-actine dans des vésicules lipidiques unilamellaires géantes (également appelées liposomes), et la méthode pour former une couche de F-actine biomitant le cortex au niveau du feuillet interne de la membrane liposomique.

In vitro Reconstitution du cytosquelette d’actine à l’intérieur de vésicules unilamellaires géantes

Ce protocole est un guide pour visualiser l’actine dynamique et les microtubules à l’aide d’un test de microscopie à fluorescence interne totale (TIRF) in vitro .

Visualisation de la dynamique de couplage de l’actine et des microtubules in vitro par microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF)

Cet article présente des protocoles pour l’ingénierie et la caractérisation de réseaux composites tridimensionnels accordables de filaments d’actine et de microtubules co-intriqués. Les composites subissent une restructuration active et un mouvement balistique, entraînés par des moteurs de myosine II et de kinésine, et sont réglés par les concentrations relatives d’actine, de microtubules, de protéines motrices et de réticulations passives.

Reconstitution et caractérisation de composites actine-microtubule avec dynamique et mécanique induites par moteur accordable

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Reconstitution de la motilité à base d’actine avec des protéines disponibles dans le commerce

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Réglage des modes de contractilité et de déformation des assemblages à base d’actine active in vitro : des réseaux actifs bidimensionnels aux gouttes à cristaux liquides

Cette étude décrit les techniques biophysiques, biochimiques et moléculaires permettant de caractériser l'activité de chaperon d'Escherichia coli HdeB dans des conditions de pH acides. Ces méthodes ont été appliquées avec succès pour d'autres chaperons acide de protection tels que HdeA et peuvent être modifiés pour travailler pour d'autres chaperons et des conditions de stress.

Détection de l&#39;activité dépendant du pH de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In vitro</em&gt; et<em&gt; In Vivo</em

Découvrez la polymérisation de l'actine F sur des endosomes précoces à l'aide d'un test in vitro basé sur la microscopie. Cette méthode permet d'étudier la dynamique de l'actine dans le trafic membranaire cellulaire.

In Vitro Polymérisation de l’actine F sur Endosomes précoces

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