Visualisation du modèle de projection axonale des neurones du moteur embryonnaire dans Drosophila

L’objectif global de cette expérience est d’analyser les modèles de projection des motoneurones dans des embryons à un stade avancé de Drosophila melanogaster. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement neuronal, telles que le guidage des axones moteurs et la formation des sous-cus neuronaux. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une visualisation précise de l’axone moteur dans les embryons en développement, ce qui permet une analyse fiable de la recherche de trajectoire axonale et cible le défaut de condition.

Un jour après la mise en place des plaques de collecte des œufs, remplacez les plaques par de nouvelles contenant une noisette de pâte de levure fraîchement préparée. Après trois heures sur les assiettes fraîches, transférez les mouches dans de nouvelles bouteilles de nourriture. Et incubez les assiettes d’œufs pendant la nuit à 25 degrés Celsius.

Le matin, ajoutez 1,8 millilitre de solution PBT dans les plaques. Et utilisez un coton-tige pour déloger les embryons. Ensuite, à l’aide d’une pipette de 1 millilitre, transférez les embryons et la solution dans un microtube à centrifuger.

Une fois que les embryons se sont déposés au fond, aspirez autant de solution que possible. Ensuite, rincez les embryons deux fois avec un millilitre de PBT par rinçage. Pour décoréonner les embryons, remplacez le dernier rinçage par un millilitre d’eau de Javel à 50 % et secouez le tube pendant trois minutes à température ambiante.

Pour enlever l’eau de Javel, rincez les embryons trois fois avec du PBT. Ensuite, remplacez le dernier rinçage par un demi-millilitre de 100 % d’heptane et un demi-millilitre de 4 % de paraformaldéhyde. Maintenant, incubez les embryons pendant 15 minutes avec un léger balancement.

Après l’incubation, retirez la couche de solution sous-jacente et ajoutez 500 microlitres de méthanol à 100 %. Maintenant, pendant 30 secondes, secouez vigoureusement le tube pour dévitelliniser les embryons. Ensuite, retirez la solution sus-jacente, rajoutez 500 microlitres de méthanol à 100 % et secouez le tube pendant encore 10 secondes.

Après avoir secoué le tube, tapotez-le pour aider les embryons à se stabiliser et à retirer autant de solution que possible. Ensuite, rincez brièvement les embryons avec du méthanol à 100 %. Ensuite, rincez immédiatement les embryons avec du PBT trois fois.

Maintenant, mettez les embryons en suspension dans un millilitre de PBT frais. Et incubez les embryons à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes pour les préparer à la coloration LacZ. Pendant l’incubation des embryons, préparez une aliquote d’un millilitre de solution de coloration X-gal.

Réchauffez l’aliquote dans un bain-marie à 65 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle devienne trouble. Transférez-le ensuite dans un bloc de chaleur à 37 degrés Celsius. Après que les embryons aient été réchauffés pendant 15 minutes, retirez la solution PBT et remplacez-la par l’aliquote d’un millilitre de solution de coloration.

Ajoutez ensuite 20 microlitres de substrat X-gal. Pendant environ deux à quatre heures, incubez le tube à 37 degrés Celsius en le balançant doucement jusqu’à ce qu’un précipité bleu se forme. Ensuite, retirez la solution de coloration et rincez les embryons trois fois avec du PBT à température ambiante.

Après les rinçages, utilisez une sonde à aiguille ou une pince pour trier les embryons à la main sous un microscope de dissection. Prélevez les embryons colorés d’intérêt dans un microtube à centrifuger d’un demi-millimètre à l’aide d’une pipette d’un millilitre. Ensuite, lavez les embryons sélectionnés avec 0,4 millilitre de PBT.

Ensuite, remplacez le PBT par 0,3 millilitre de solution bloquante et laissez les embryons incuber en agitant doucement pendant 15 minutes. Après 15 minutes, ajoutez 75 microlitres de l’anticorps primaire et poursuivez l’incubation pendant la nuit. Le lendemain matin, lavez les embryons avec du PBT pendant environ deux heures, en changeant la solution de lavage environ toutes les 30 minutes.

Après le lavage, ajoutez 0,3 millilitre de solution de blocage contenant l’anticorps secondaire et incubez le tube en le balançant doucement à température ambiante pendant la nuit. Le lendemain matin, lavez les embryons avec du PBT pendant environ trois heures. Changez le PBT au moins cinq fois pendant la période de lavage.

Après le lavage, remettez les embryons en suspension dans 0,3 millilitre de solution de dab et ajoutez deux microlitres de peroxyde d’hydrogène à 3 %. Ensuite, incubez-les dans l’obscurité en les berçant doucement à température ambiante jusqu’à ce qu’il produise suffisamment de précipité. Cela prend généralement de 30 à 60 minutes.

Ensuite, rincez les embryons avec du PBT quatre fois et mettez-les en suspension dans 0,2 millilitre de solution de montage. Maintenant, laissez les embryons s’équilibrer dans l’obscurité à 4 degrés Celsius. Pour fileter les embryons, placez-les sur une lame de verre.

Déplacez-les d’abord dans une goutte de glycérol côté ventral vers le haut. Ensuite, sous un microscope de dissection, coupez la partie antérieure et 1/4 de la longueur du corps et retirez la région la plus postérieure, qui est exempte d’axones moteurs. Maintenant, à l’aide d’une sonde à aiguille, déplacez la préparation hors du glycérol, orientée dorsale vers le haut et positionnez-la horizontalement dans le champ de vision.

L’étape suivante nécessite une fine aiguille de tungstène qui a été insérée dans la région creuse d’une sonde à aiguille, puis pliée à l’extrémité. À l’aide de l’aiguille de tungstène, faites une petite incision à l’extrémité postérieure de l’embryon et continuez à couper la ligne médiane dorsale. Assurez-vous que la pointe de l’aiguille en tungstène ne touche pas la surface de la lame de verre pendant la dissection, car l’aiguille se pliera facilement contre le verre.

Ensuite, avec la sonde, retournez la préparation à la goutte de glycérol et positionnez-la, côté dorsal vers le haut. Là, détachez l’intestin de la paroi corporelle en dépliant chaque paroi corporelle dans une direction ventrale-latérale. Les deux parois du corps doivent se séparer.

Maintenant, à l’aide de la sonde, déplacez avec précaution les rabats de la paroi du corps sur une lame de verre. Sur la lame, utilisez une aiguille en tungstène pour retirer les organes internes en les poussant latéralement. Pour stabiliser l’aiguille en tungstène et éviter qu’elle ne soit endommagée, maintenez l’aiguille creuse sondée et maintenez l’aiguille en tungstène appuyée contre la surface de la lame de verre tout en manipulant l’aiguille en tungstène.

Maintenant, montez les préparations dans huit microlitres de solution de montage sur une nouvelle lame de verre. Fixez une lamelle de recouvrement et scellez les bords avec du vernis à ongles ordinaire. Ensuite, capturez des images à haute résolution à l’aide de l’optique DIC.

En utilisant la méthode décrite, les embryons de stade 16 ont été colorés avec l’anticorps Fas2 et préparés pour la visualisation des motoneurones et des hémisegments abdominaux A3 et A4. Normalement, au moins sept motoneurones étendent et fasciculent leurs axones pour former une branche nerveuse ISNb. De nombreux faisceaux nerveux environnants étaient également identifiables dans cette préparation. Lorsque le faisceau nerveux intersegmentaire atteint le point de choix au niveau des muscles 6 et 7, deux axones défasciculent et énervent sélectivement les muscles 6 et 7.

La même chose se produit à d’autres points de choix lorsque le faisceau s’étend dorsalement. Puis, au dernier point de choix, deux axones énervent le muscle 12. En revanche, dans les embryons mutants Sema-1a, les mêmes axones ne parviennent pas à se défasciculer à leurs points de choix.

Ce n’est pas surprenant car le produit Sema-1 aegean est connu pour aider à former des connexions entre les axones moteurs et les muscles cibles au cours du développement neuronal. Ainsi, la méthode décrite peut être utilisée pour analyser les phénotypes mutants. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de trier les embryons mutants souhaités, de la façon d’immunocolorer les modèles de projection axonale des motoneurones et de la façon de disséquer les embryons fixes pour une préparation plate.