Name: Cellules vivantes mesure d’odorants récepteur Activation en utilisant un essai en temps réel de cAMP (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Découvrez un essai cAMP en temps réel pour mesurer l'activation des récepteurs d'odorants dans des cellules vivantes Hana3A. Cette méthode permet un criblage efficace et fiable des interactions récepteur-ligand en neurosciences.

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Le travaux ont été subventionnés par la Chinese National Science Foundation (31070972), la Science et la technologie Commission of Shanghai Municipality (16ZR1418300), le programme novateur recherche équipe de Shanghai Municipal Education Commission, le Shanghai Eastern Scholar Program (J50201) et le Programme National de recherche fondamentale de la Chine (2012CB910401).

1. Culturing et Maintenance des cellules Hana3A <ol><li>cellules de maintenir dans 10 mL de milieu essentiel minimum (MEM) avec 10 % sérum bovin fœtal (SVF), 100 µg/mL la pénicilline-streptomycine et 1,25 µg/mL amphotéricine B dans un 100 mm boîte de Petri de cellules dans un incubateur de culture cellulaire de 37 ° C avec 5 % de CO 2. Avec chaque autre passage, ajouter 1 puromycine µg/mL pour maintenir la transfection stable des plasmides (voir Introduction). 
	Remarque : Effectuez toutes les étapes de culture cellulaire dans une classe II hotte biologique de sécurité afin d’assurer un environnement stérile.</li>
	<li>Sous-culture à un ratio de 10 à 20 % dans les 100 mm plats tous les jours 2-3.</li>
</ol> 2. Placage de cellules pour la Transfection <ol><li>observer les cellules de Hana3A sous un microscope à contraste de phase pour assurer la viabilité des cellules et d’estimer confluent.</li>
	<li>Aspirer tous les moyen de la boîte de Petri cell.</li>
	<li>Laver les cellules en ajoutant 10 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sur la plaque, agitant le plat et aspirer le PBS.</li>
	<li>Ajouter 3 mL de 0.05 % trypsine-acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) sur la plaque. Mélanger pendant 1 min ou jusqu'à ce que toutes les cellules sont à flot. 
	Remarque : Observer l’évolution de cellules détacher le fond de la plaque sous le microscope comme nécessaire.</li>
	<li>Désactiver la trypsine en ajoutant 5 mL de MEM avec 10 % FBS et pipette up et down pour briser les morceaux de cell Mass 
	Remarque : Pour l’électrodéposition avant la transfection, le support utilisé ne doit pas contenir antibiotiques. Ajout d’antibiotiques peut-être diminuer l’efficacité de transfection.</li>
	<li>Transférer une quantité appropriée de cellules dans un tube de mLl-15 selon le nombre de plaques à transfecter. Pour chaque plaque à 96 puits, plaque 2 x 10 6 cellules ou environ 1/5 d’un plat de confluentes 100 mm 100 %, ce qui donne un nombre de cellules de 2 x 10 4 cellules par puits ou d’une densité d’environ 15 à 30 % confluence / puits. Centrifuger les tubes à 200 x g pendant 5 min et aspirer le surnageant sans déranger le culot cellulaire. 
	Remarque : Calculer le montant exact des cellules pour être ensemencés sur des plaques de 96 puits afin d’éviter les recouvrant ou undergrowing des cellules avant stimulation.</li>
	<li>Ajouter une quantité appropriée de MEM avec 10 % FBS dans le 15 mL tube et Pipeter de haut en bas pour briser les morceaux de la cellule de masse. Pour chaque plaque à 96 puits, remettre en suspension les cellules avec 6 mL de MEM avec 10 % BF. 
	Remarque : Veillez à ne pas à générer des bulles d’air dans le tube.</li>
	<li>Ajouter les cellules en suspension dans un réservoir. À l’aide d’une pipette multicanaux, pipette 50 µL de cellules sur chaque puits d’une plaque de 96 puits. Incuber une nuit à 37 ° C, avec 5 % de CO 2.</li>
</ol> 3. Transfection des plasmides <ol><li>avant la transfection, observer les cellules plaqués pour assurer une bonne confluence d’environ 30 à 50 % par puits sous un microscope à contraste de phase et de revenir à l’incubateur.</li>
	<li>Préparer à l’avance la Rho-tag OR construct 11 , 21 , 22 , 28, le facteur accessoire construit (RTP1S 22 , 36 et M3R 23), et la variante de biocapteur construire 29 , 30 par miniprep. Quantifier la concentration d’ADN par un spectrophotomètre et ajuster des concentrations d’ADN plasmidique (par exemple, à 100 ng/µL) avec de l’eau distillée si nécessaire.</li>
	<li>Préparation des mélanges de la Transfection <ol><li>prépare un mélange de transfection de plasmide dans 500 µL de MEM pour chaque plaque de 96 puits selon le tableau 1. 
		Remarque : Lorsque différents ORs sont testés sur la même plaque 96 puits, le volume de la mélange de transfection et la quantité d’ADN ajouté plasmidique doit être adapté en fonction du nombre de puits transfectées avec un donné ou.</li>
		<li>Préparer un mélange de transfection dans un tube avec 18 µL de réactif de transfection de médiation lipidique dans 500 µL de MEM.</li>
	</ol></li> <li>Mélanger le mélange de plasmide avec le mélange de transfection par pipetage de haut en bas. Incuber à température ambiante pendant 15 min.</li>
	<li>Arrêter la réaction en ajoutant 5 mL de MEM avec 10 % BF.</li>
	<li>Étalé une épaisse couche d’essuie-tout stérile dans la hotte de la culture cellulaire. Prendre une plaque à 96 puits avec des cellules de l’incubateur. Doucement et à plusieurs reprises Appuyez sur la plaque à l’envers sur la pile de papier essuie-tout afin que le milieu est complètement absorbé par le papier absorbant. 
	Remarque : Ne pas avec force ou brusquement taper la plaque comme on pourrait perdre des cellules.</li>
	<li>Transférer 50 µL du mélange combiné transfection dans chaque puits de la plaque à 96 puits et incuber pendant la nuit pendant 18 à 24 heures à 37 ° C, avec 5 % de CO 2. 
	Remarque : Un calendrier de transfection et stimulation temps géré doit précéder la mesure lorsque plus d’une plaque à 96 puits sont testés dans une expérience afin d’avoir toutes les plaques mesurées après la transfection fois et le temps de pose stimulation.</li>
</ol> 4. Stimulation et instruments de mesure ou activité à l’aide du test de cAMP en temps réel <ol><li>observer les cellules transfectées sous un microscope à contraste de phase pour assurer une bonne confluence de 50 à 80 % par puits et revenir à l’incubateur.</li>
	<li>Préparer le moyen de stimulation en ajoutant 10 mM hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acide (HEPES) et 5 mM de glucose à Hank &#39; s Balanced Salt Solution (HBSS).</li>
	<li>Décongeler les aliquotes de réactif de substrat essai cAMP en temps réel sur la glace. Réactif de substrat de magasin à-80 ° C à 55 µL par tube en tubes PCR. Utiliser 1 tube par plaque.</li>
	<li>Préparer 2 % solution de l’équilibration en mélangeant 55 µL de réactif au substrat et 2750 µL de solution de glucose/HEPES/HBSS.</li>
	<li>Étalé une épaisse couche de papier absorbant sur le banc. Doucement et à plusieurs reprises Appuyez sur la plaque à l’envers sur du papier absorbant afin que le milieu de la transfection est complètement absorbé par le papier absorbant.</li>
	<li>Laver les cellules par pipetage 50 µL de solution de HBSS/HEPES/glucose dans chaque cupule.</li>
	<li>Taper doucement et à plusieurs reprises la solution HBSS/HEPES/glucose de la plaque à 96 puits.</li>
	<li>Pipette 25 µL de solution d’équilibration de 2 % à chaque puits et incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 2 h.</li>
	<li>Préparer à l’avance de 1 M de solutions odorant dans le DMSO et conserver à-20 ° C jusqu'à ce que.</li>
	<li>Avant la fin de la période d’incubation, diluer les solutions mères odorant à des concentrations de travail en milieu de stimulation HBSS/HEPES/glucose. 
	Remarque : Les concentrations des dilutions odorant préparées dans cette étape doivent être doublées pour obtenir les concentrations finales correctes dans chaque puits.</li>
	<li>à l’aide d’une chimiluminescence lecteur et avant l’ajout de la substance odorante, mesurer le niveau de luminescence basale de la plaque pour 2 fois de suite à un taux de 1000 ms par bien 34.</li>
	<li>Rapidement retirer la plaque du lecteur plaque et ajouter des dilutions de substance odorante 25 µL à chaque puits et commencer immédiatement la mesure de la luminescence continue de tous les puits pendant 20 cycles dans les 30 min. 
	NOTE : Pipette avec précaution pour éviter de contaminer les voisins puits lors de l’utilisation de différentes substances odorantes et/ou des concentrations différentes de la même odorisants dans la même assiette.</li>
</ol> 5. Analyse des données <ol><li>Exporter les données depuis le logiciel de lecteur de plaque chimiluminescence.</li>
	<li>Calculer normalisé réponse OR pour chaque point de temps à l’aide de la formule 
	(luminescence N &#8211; luminescence basale) / (luminescence plus haut &#8211; luminescence basale) où N = valeur de la luminescence d’un certain bien ; basal = valeur moyenne luminescence des deux basales valeurs de la luminescence ; plus haut = valeur la plus élevée luminescence d’une plaque ou un ensemble de plaques. 
	Remarque : Selon le but de l’expérience, autres représentations graphiques peuvent être adoptées. Par exemple, pour le dépistage des essais (voir Figure 1) et pour générer des courbes concentration-réponse, la valeur de la luminescence d’un certain puits à un point de temps désirée pendant la mesure cinétique, telles que la valeur maximale ou la le montant final, peut être utilisé.</li>
</ol>

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<li>Block, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implausibility+of+the+vibrational+theory+of+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Implausibility of the vibrational theory of olfaction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), E2766-E2774 (2015).</li>
<li>Sato-Akuhara, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+Specificity+and+Evolution+of+Mammalian+Musk+Odor+Receptors%3A+Effect+of+Single+Receptor+Deletion+on+Odor+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ligand Specificity and Evolution of Mammalian Musk Odor Receptors: Effect of Single Receptor Deletion on Odor Detection.</a> J Neurosci. 36 (16), 4482-4491 (2016).</li>
<li>Gane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+vibration-sensing+component+in+human+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular vibration-sensing component in human olfaction.</a> PLoS One. 8 (1), e55780(2013).</li>
<li>Young, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+evolutionary+processes+shaped+the+mouse+and+human+olfactory+receptor+gene+families%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Different evolutionary processes shaped the mouse and human olfactory receptor gene families.</a> Hum Mol Genet. 11 (5), 535-546 (2002).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Mesurer avec exactitude l’activation de l’OR après une exposition à une certaine substance odorante est la première étape en déchiffrant le codage de l’information olfactive. Les expériences montré dans cet étude représentent qu'un exemple de la façon dont on peut identifier, en utilisant un in vitro système d’expression OR, ORs sensibles parmi le répertoire OR humain pour la substance odorante d’intérêt et ensuite caractériser les récepteurs pharmacologie à l’aide de différentes concentrations du produit chimiq...

Le sens de l’odorat joue un rôle important dans la survie des animaux qu’ils comptent sur leurs capacités olfactives pour procurer de la nourriture, éviter les prédateurs et le danger, distinguer les espèces et sélectionnez mate1,2. La réalisation de ces fonctions dépend les récepteurs odorants (RUP), qui sont exprimés individuellement à la surface ciliaire des neurones sensoriels olfactifs (OSNs) située dans l’épithélium olfactif (OE). SRO constitue la plus grande famille de la superfamille des récepteurs (GPCR) G-protéine a couplé avec environ 400 et 1200 divers OR gènes chez les humains et les souris, respectivement3,4,5. RUP activé par odorisants conduire à une augmentation taux d’AMPc intracellulaires via l’activation séquentielle d’olfactif G-protéine (Golf) et tapez III l’adénylyl cyclase (ACIII). L’augmentation qui en résulte du niveau d’AMPc intracellulaire pourrait fonctionner comme un second messager, qui ouvre le canal de nucléotides bloquées sur la surface des cellules, provoquant l’afflux des cations dont Ca2 + et les potentiels d’action et le lancement en fin de compte neuro-potentiel transmission et perception olfactive. Le processus de détection et de discrimination un grand nombre de substances odorantes par ORs est considéré comme la première étape de la perception olfactive6,7.
Étant donné que Buck et Axel8 tout d’abord avec succès cloné récepteurs odorants et élucidé le mécanisme de la perception olfactive initiée par ORs, deorphanization de la famille de l’OR est devenu l’un des points chauds dans ce domaine. Diverses méthodes in vivo, ex vivo et in vitro pour mesurer l’activation de l’OR ont été déclarés9,10,11,12. Une méthode traditionnelle utilisée Ca2 + imagerie suivie de single-cell RT-PCR sur OSNs permis l’identification de différents ORs à aliphatiques composés malodorants13,14,15. Plus récemment, l’avènement des analyses à grande échelle transcriptome a favorisé le développement de méthodes plus haut débit en vivo . Le dosage de Kentucky identifié souris eugénol et muscone-favorisant l’ORs avec l’utilisation de la S100a5-tauGFP journaliste souris souche et microarray analysis9. Selon la diminution des niveaux d’ARNm de l’OR après exposition odorant, la technologie de rêve employé une approche transcriptomique afin de déterminer les profils activation OR dans les deux espèces de vertébrés et non-vertébré16. De même, compte tenu de la phosphorylation de S6 activations neuronales, la Matsunami groupe séquencée ARNm de ribosome phosphorylés immunoprécipitation pour identifier les réactifs ORs12. Enfin, le groupe Feinstein a rapporté souris super renifleur qui pourraient servir de plate-forme pour étudier l’odeur codage en vivo, connu comme la technologie de MouSensor17.
Dans le domaine in vitro , le défi de la mise en culture OSNs a fait un système d’expression hétérologue qui imite ou expression fonctionnelle in vivo une solution idéale pour effectuer un dépistage à grande échelle de produits chimiques odorantes pour ORs. Néanmoins, étant donné que les lignées de cellules cultivées d’origines non-olfactifs diffèrent des OSNs natifs, ou protéines sont conservées dans le réticulum endoplasmique et incapable de faire le trafic vers la membrane plasmique, entraînant perte de récepteur fonction18 et la dégradation de l’OR , 19. pour résoudre ce problème, importants travaux ont été faits pour répliquer l’expression fonctionnelle d’OR sur la membrane cellulaire dans les lignées cellulaires hétérologue. Krautwurst et coll. d’abord attaché les 20 premiers acides aminés de la rhodopsine (Rho-tag) à la N-terminale de la protéine de l’OR et cela favorisé l’expression de la surface cellulaire de certains ORs de cellules humaines embryonnaires de rein (HEK)20. En procédant à une analyse en série de (SAGE) Bibliothèque analyse l’expression génique de OSNs unique, Saito et al. tout d’abord cloné transportant des récepteurs protéiques (RTP) membres de la famille, RTP1 et RTP2 et la protéine réceptrice de l’enrichisseur expression 1 (REEP1) qui a facilité le trafic d’OR à la membrane cellulaire et améliorés de réponses véhiculées par les odorants des RUP dans les cellules HEK293T 21. se fondant sur ces constatations, le groupe Matsunami réussi à établir la lignée de cellules Hana3A, stablement transfected avec RTP1, RTP2, REEP1 et Gαolf dans HEK293T et transitoirement transfectées avec ORs Rho-tag, efficaces ou fonctionnels expression. Les études ont révélé 1) une forme plus courte de RTP1, RTP1S, qui pourrait plus fermement favorisent ou fonction que la protéine originale de RTP1 et 2) le récepteur muscarinique de l’acétylcholine, type 3 (M3R) qui pourrait augmenter l’activité d’OR par l’intermédiaire de l’inhibition de la β-arrestine-2 recrutement, qui ont été introduits dans le système d’expression hétérologue pour optimiser expérimental sortie22,23.
Plusieurs méthodes de détection ont été utilisés pour quantifier l’activation des récepteurs dans les systèmes hétérologues. Le dosage de la phosphatase alcaline placentaire sécrétées (SEAP) travaille avec une enzyme de journaliste transcriptionnellement réglementée par des éléments de réponse de l’AMPc (CREs), ce qui en fait une option intéressante pour évaluer l’activation de l’OR. La fluorescence est facilement détectée dans un échantillon de milieu de culture après l’incubation avec SEAP détection réactif24. En utilisant cette méthode, les fonctions d’ORs comme une classe secondaire des récepteurs chemosensoriels exprimée dans la trace de OE-les récepteurs associés à amine (TAARs) ont été caractérisent25,26,27. Une autre méthode courante, le dosage de la luciférase, utilise un gène rapporteur luciférase de firefly sous le contrôle de l’élément de réponse de l’AMPc (CRE). Luminescence générée par la production de la luciférase procure un moyen efficace et robuste de quantifier OR activation10,11,28.
Des tests en temps réel de cAMP aussi sont sont répandues dans la surveillance dynamiquement la fonction des RCPG hétérologues ou endogènes. Un exemple de ces tests avancés tire parti d’une variante de biocapteur génétiquement codé, qui possède un domaine de liaison au cAMP fusionné à une forme mutante de la luciférase. Lorsque le cAMP se lie, le changement conformationnel aboutit à l’activation de la luciférase, luminescence d'où peut ensuite être mesurée avec un lecteur de chimiluminescence29,30. La technologie en temps réel de cAMP a été signalée pour l’orphelin hors des récepteurs de l’odeur humaine dans les cellules HEK293 et NxG de 108CC15âne = « xref » > 31,32,33, ainsi que dans le Hana3A dérivé de HEK293T cellules34,35. Le groupe Krautwurst a également décrit en détail la technologie cAMP en temps réel afin de convenir aux bi-directionnel à grande échelle ou la projection des approches32,33.
Nous décrivons ici un protocole permettant de mesurer l’activation d’OR à l’aide d’un essai en temps réel de cAMP dans les cellules Hana3A. Dans ce protocole, la luminescence des cellules vivantes préalablement équilibrés est cinétiquement mesurée pendant 30 min après le traitement par certains composés volatils, ce qui représente une analyse plus efficace et plus précise de l’activation d’OR qui sont moins sensibles aux artefacts qui se produisent dans l’environnement cellulaire avec temps prolongé et la toxicité cellulaire induite par l’odeur. Cette mesure en temps réel permet un dépistage à grande échelle des ORs et des ligands, ainsi que la caractérisation des paires d’OR-ligand spécifiques d’intérêt. En utilisant cette méthode, nous avons avec succès identifié OR5AN1 comme le récepteur de la muscone composés de musc en réalisant une projection contre 379 ORs humaines et en confirmant par la suite le résultat du dépistage positif.

<table><tbody><tr><td>Amphotéricine B</td><td>Sigma</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>Réactif GloSensor cAMP</td><td>Promega</td><td>E1290</td><td></td></tr><tr><td>pGloSensor-20F plasmide</td><td>cAMP Promega</td><td>E1171</td><td></td></tr><tr><td>Hana3A cellules</td><td></td><td></td><td>disponibles auprès des auteurs sur demande</td></tr><tr><td>HBSS, sans calcium ni magnésium</td><td>GIBCO</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Hyclone</td><td>SH30237</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide</td><td></td><td></td> M3R <td>cloné dans un vecteur d’expression de mammifère tel que pCI</td></tr><tr><td>MEM, avec EBSS et L-glutamine</td><td>Hyclone</td><td>SH30024</td><td></td></tr><tr><td>Muscone</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200528</td><td></td></tr><tr><td>Musc tibétain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S359165</td><td></td></tr><tr><td>Plasmides</td><td></td><td></td> OR <td>clonés avec un Rho-tag dans un vecteur d’expression de mammifère tel que pCI</td></tr><tr><td>PBS, sans calcium ni magnésium</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide miniprep kit</td><td>Tiangen</td><td>DP103-03</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide</td><td></td><td></td> Puromycin Sigma P8833 <td></td></tr><tr><td>RTP1S</td><td>cloné dans un vecteur d’expression de mammifère tel que pCI</td>Trypsine-EDTA Hyclone SH30236 tube PCR de 0,2 mL Axygen PCR-02-C Tube Eppendorf de 1,5 mL Eppendorf 15 mL Tube conique de 17 mm x 120 mm <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>pipeteur multicanaux à 8 puits et/ou 12 puits</td><td>Eppendorf</td> Plaque de culture de cellules blanches à fond plat à 96 puits Greiner <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm Antenne parabolique</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Enceinte de sécurité biologique de classe II à flux</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>laminaireIncubateur de culture cellulaire, avec 5 % de CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrifugeuse, avec rotor à godets oscillants pour tubes</td><td></td><td></td><td></td>coniques de 15 ml</tr><tr><td>Lecteur de plaques Infinite F200</td><td>Microscope à</td> contraste de phase Tecan <td></td><td></td></tr><tr><td>avec objectifs</td><td></td><td></td><td></td>x10 et x20</tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Réservoirs de réactifs stériles pour la distribution</td><td></td><td></td><td></td>multicanaux</tr><tr><td>Essuie-tout</td><td></td><td></td><td></td> stérile</tr></tbody></table>

cellules vivantes mesure d’odorants récepteur activation en utilisant un essai en temps réel de camp

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

La taille énorme des familles mammifères odorant du récepteur (OR) présente des difficultés à trouver leurs ligands apparentés parmi de nombreux produits chimiques volatils. Pour efficacement et précisément deorphanize ORs, nous combinons l’utilisation d’une lignée de cellules hétérologues d’exprimer les mammifères ORs et un plasmide génétiquement modifié biocapteur permettant de mesurer la production d’AMPc en aval de l’activation d’OR en temps réel. Ce test peut être utilisé pour écran odorisants contre ORs et vice versa. Interactions positives odorant-récepteur à partir des écrans peuvent être confirmées par la suite en testant contre diverses concentrations d’odeurs, générant des courbes concentration-réponse. Ici, nous avons utilisé cette méthode pour effectuer un criblage à haut débit d’un composé odorant contre une bibliothèque OR humain exprimés dans les cellules Hana3A et a confirmé que le récepteur répond positivement est le récepteur apparenté du composé d’intérêt. Nous avons trouvé cette méthode de détection de haut débit pour être efficaces et fiables pour évaluer l’activation de l’OR et nos données fournissent un exemple de son utilisation possible dans les études fonctionnelles d’OR.

Muscone est le principal composant aromatique du musc naturel. Récentes études OR5AN1 identifié comme un récepteur humain pour muscone et autres composés de musc macrocycliques issus d’homologie avec la souris ou, MOR215-1, clonée à partir des glomérules muscone réagissant en comportement souris37,38. En sélectionnant le répertoire OR humain, notre groupe et le groupe Touhara également identifié OR5AN1 comme un récepteur majeur po...

Caractériser le fonctionnement des récepteurs odorants sert un élément indispensable dans le processus de deorphanization. Nous décrivons une méthode permettant de mesurer l’activation des récepteurs odorants en temps réel à l’aide d’un test de cAMP.

Cellules vivantes mesure d’odorants récepteur Activation en utilisant un essai en temps réel de cAMP

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Le but global de ce dosage en temps réel et à haut débit de l'AMP cyclique est d'analyser les odorants vis-à-vis des récepteurs à odorants, et inversement. Les souris étant utiles pour étudier le fonctionnement des récepteurs à odorants, elles permettent des criblages à plus grande échelle tant des récepteurs à odorants que de leurs ligands, ainsi que la caractérisation pharmacologique de paires récepteur-ligand d'intérêt. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons évaluer de manière efficace et fiable l'activation du récepteur par l'odorant.Système d'expression hétérologue d'odeurs vers des récepteurs utilisant des cellules vivantes. Commencez par observer les cellules Hana3A au microscope à contraste de phase afin de vérifier la viabilité cellulaire et d'estimer la confluence. Ensuite, aspirez tout le milieu du plat de culture cellulaire.Et lavez les cellules en ajoutant 10 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate sur la plaque, en agitant doucement la boîte, puis en aspirant le PBS. Ensuite, ajoutez trois millilitres de trypsine-EDTA à 0,5 % sur la plaque. Laissez la trypsine agir sur les cellules pendant une minute ou jusqu’à ce que toutes les cellules soient en suspension.Inactiver la trypsine en ajoutant 5 millilitres de MEM contenant 10 % de FCS et en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas pour dissocier les agrégats cellulaires. Après avoir effectué un dénombrement cellulaire, transférer 2 x 10⁶ cellules par plaque de 96 puits à transfecter dans un tube de 15 millilitres. Il est important de calculer avec précision le nombre de cellules à préparer dans la plaque de 96 puits afin d'éviter une surcroissance ou une sous-croissance des cellules avant la stimulation.Centrifuger les tubes à 200 × g pendant cinq minutes. Ensuite, aspirer le surnageant sans perturber le culot cellulaire. Ajouter six millilitres de milieu sans antibiotiques pour chaque plaque de 96 puits et pipeter par aspiration et distribution sans créer de bulles d'air afin de rompre les agrégats de masse cellulaire.Transférez les cellules en suspension dans un réservoir. À l’aide d’une pipette multicanal, ajoutez 50 microlitres de cellules dans chaque puits des plaques de 96 puits. Incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.Avant la transfection, observer les cellules ensemencées au microscope à contraste de phase afin de s'assurer d'une confluence adéquate d'environ 30 à 50 % par puits, puis les replacer dans l'incubateur. Suivre la ligne indiquée pour le construit odorant-récepteur, les construits des facteurs accessoires et le construit variant du biocapteur d'AMPc. Préparer ensuite un mélange de transfection plasmidique dans 500 microlitres de MEM pour chaque plaque de 96 puits.Ensuite, préparez un mélange de transfection contenant 18 microlitres de réactif de transfection médiée par lipides dans 500 microlitres de MEM. Mélangez le mélange de transfection avec le mélange plasmatique en aspirant et en expulsant plusieurs fois à l’aide d’une pipette. Incubez ensuite à température ambiante pendant 15 minutes.Après l'incubation, arrêter la réaction en ajoutant 5 millilitres de MEM contenant 10 % de FBS au mélange de transfection. Ensuite, étendre une couche épaisse de serviettes en papier stériles dans la hotte de culture cellulaire. Prendre une plaque de 96 puits contenant des cellules depuis l'incubateur.Tapotez doucement et répétitivement la plaque à l’envers sur la pile de serviettes en papier afin que le milieu soit complètement absorbé par les serviettes. Transférez 50 microlitres du mélange de transfection combiné dans chaque puits de la plaque 96-puits et incubez toute la nuit pendant 18 à 24 heures à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Vous pouvez gérer la transfection et le calendrier de stimulation doit rester identique sur l’appareil lorsque plusieurs plaques 96-puits sont testées dans une même expérience, de sorte que toutes les plaques subissent le même intervalle de transfection et d’exposition aux distillats.Avant la stimulation, observer les cellules transfectées au microscope à contraste de phase afin de s'assurer d'une confluence adéquate de 50 à 80 % par puits avant de les remettre dans l'incubateur. Préparer ensuite le milieu de stimulation en ajoutant 10 millimolaire de heaps et 5 millimolaire de glucose à la solution saline équilibrée de Hanks. Décongeler 55 microlitres d'aliquots du réactif substrat pour le dosage du cycle AMP en temps réel sur de la glace.Préparez une solution d'abration égale à 2 % en mélangeant 55 microlitres du réactif substrat et 2 750 microlitres de milieu de stimulation. Après avoir étalé une couche épaisse de serviettes en papier sur la paillasse, tapez doucement et répétitivement la plaque à l'envers sur les serviettes en papier afin que le milieu de transfection soit absorbé par celles-ci. Lavez les cellules en pipetant 50 microlitres de milieu de stimulation dans chaque puits.Tapotez doucement et répétitivement pour éliminer le milieu de stimulation de la plaque de 96 puits. Ajoutez 25 microlitres de solution d'équilibre à 2 % dans chaque puits à l’aide d’une pipette et incubez pendant deux heures à température ambiante à l’abri de la lumière. Juste avant la fin du temps d’incubation, diluez les solutions stock d’odeurs décongelées à la concentration de travail ainsi que le milieu de stimulation.Avant l'ajout de l'agent odorant, utilisez un lecteur de plaque à chimiluminescence pour mesurer le niveau de luminescence basal de la plaque. Retirez rapidement la plaque du lecteur et ajoutez 25 microlitres des dilutions d'agent odorant dans chaque puits. Ensuite, démarrez immédiatement la mesure continue de la luminescence de tous les puits pendant 20 cycles dans un délai de 30 minutes.379 récepteurs odorants humains uniques ont été criblés contre la muscone à 30 micromolaire en utilisant le dosage de l'AMPc en temps réel. Les blocs colorés le long de l'axe des X indiquent différentes familles de récepteurs odorants humains. L'axe des Y représente la luminiscence normalisée 30 minutes après l'ajout de l'odeur, lorsque la réponse a atteint son maximum pour le témoin positif.La réponse de l'OR5AN1 est indiquée. Cette figure montre des mesures en temps réel de l'activation de l'OR5AN1 par différentes concentrations de muscone, ainsi que le résultat d'un contrôle négatif sans odeur. La flèche indique le moment de l'ajout de l'odeur. Ici, une courbe de réponse en fonction de la concentration de OR5AN1 face à la muscone, 30 minutes après l'ajout de l'odeurant, est présentée. La technique décrite ici nécessite au total trois jours, en commençant par une plaque stock de cultures cellulaires le premier jour. Une fois maîtrisée, l'opération du dernier jour peut être réalisée en trois heures pour chaque plaque de 96 puits, si elle est effectuée correctement.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de gérer l'activation des récepteurs des odeurs à l'aide d'un dosage de l'AMP cyclique afin d'exploiter les résultats.

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Ici nous démontrons un protocole pour mener à bien coloration de cellules vivantes qui peuvent être utilisés pour détecter les récepteurs olfactifs à la surface des cellules HEK293T commodément. En outre, il peut également être utilisé pour le dosage de l'expression de surface d'autres récepteurs chimiosensoriels ou RCPG.

Dosage expression en surface des récepteurs chimiosensoriels dans des cellules hétérologues

Cette vidéo montre le protocole de mesure de l’activation des récepteurs odorants dans les cellules transfectées à l’aide d’un biocapteur d’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) et de la détection de luminescence. La méthode est appliquée pour étudier les interactions récepteur-ligand et les voies de signalisation dans les neurones olfactifs.

Mesure de l’activation des récepteurs odorisants à l’aide d’un dosage cyclique en temps réel de l’adénosine monophosphate

Source : de March, C. A. et. al., Surveillance in vitro en temps réel de l’activation des récepteurs odorants par un odorisant en phase vapeur. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo montre la méthode de surveillance de l’activation en temps réel des récepteurs odorants dans les cellules de mammifères recombinants à l’aide de la mesure de la luminescence. La liaison odorante déclenche l’activation de la protéine G et la production d’AMPc, activant les protéines glocapteurs qui émettent de la...

Surveillance en temps réel de l’activation des récepteurs odorants dans les cellules recombinantes

Activation persistante des inhibiteurs G récepteurs couplés aux protéines résultats dans la sensibilisation de la signalisation de l'adénylcyclase. Pour identifier les voies moléculaires essentiels, les approches non biaisée sont nécessaires, mais, cette stratégie nécessite le développement d'un test AMPc de sensibilisation à base de cellules évolutive. Ici, nous décrivons un test de sensibilisation pour une petite molécule et le dépistage siRNA.

Sensibilisation à la drogue induit des adénylylcyclase: Rationalisation de dosage et la miniaturisation des petites molécules et siARN préalable Applications

Modèles d'activation des récepteurs olfactifs codent l'identité de l'odeur, mais le manque de données publiées identification des ligands odorants pour les récepteurs olfactifs de mammifères entrave le développement d'un modèle complet de codage de l'odeur. Ce protocole décrit un procédé pour faciliter l'identification à haut débit de ligands de récepteurs olfactifs et la quantification de l'activation du récepteur.

Analyse à haut débit de mammifères olfactifs récepteurs: mesure de activation du récepteur via la luciférase activité

L’analyse des propriétés physiologiques des neurones sensoriels olfactifs se heurte encore à des limites techniques. Ici, nous les enregistrons à l’aide d’un patch-clamp perforé dans une préparation intacte de l’épithélium olfactif chez des souris ciblées par des gènes. Cette technique permet de caractériser les propriétés membranaires et les réponses à des ligands spécifiques de neurones exprimant des récepteurs olfactifs définis.

Perforé patch-clamp enregistrement des souris neurones sensoriels olfactifs dans neuroépithélium Intact: Analyse fonctionnelle des neurones exprimant un récepteur odorant Identifié

Ce protocole analyse le comportement de navigation de larve de drosophile en réponse à la stimulation simultanée d’optogenetic de ses neurones olfactifs. Lumière de longueur d’onde de 630 nm permet d’activer les neurones olfactifs individuels exprimant une rhodopsine canal décalée vers le rouge. Mouvement larvaire est suivi en même temps, d’enregistrement numérique et analysées à l’aide du logiciel d’écriture personnalisée.

Analyser le comportement larves de drosophile en réponse à une Stimulation des neurones olfactifs Optogenetic

Physiologiquement, les odorants récepteurs sont activés par des molécules odorantes inhalés en phase vapeur. Cependant, la plupart des systèmes in vitro utilisent une stimulation de la phase liquide odorant. Nous présentons ici une méthode qui permet un suivi en temps réel in vitro de l’activation des récepteurs odorants lors de la stimulation de la substance odorante en phase gazeuse.

En temps réel en Vitro suivi d’Activation des récepteurs de l’odeur par une substance odorante en Phase vapeur

Le protocole présenté dans cette étude illustre l’efficacité du détecteur de différence AMPc in situ  dans la mesure de l’AMPc à l’aide de deux méthodes. L’une des méthodes utilise un spectrophotomètre à lecture de plaques à 96 puits avec des cellules HEK-293. L’autre méthode permet de visualiser des cellules HASM individuelles au microscope fluorescent.

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Neurones récepteurs olfactifs (ORNs) convertir les signaux d'odeurs dans un premier récepteur de courant qui à son tour déclenche des potentiels d'action qui sont acheminés à des neurones de second ordre dans le bulbe olfactif. Ici, nous décrivons la technique pipette d'aspiration d'enregistrer simultanément le récepteur olfactif courant induit et des potentiels d'action de ORNs souris.

Odorant induites réponses enregistrées à partir de neurones récepteurs olfactifs en utilisant la technique de la pipette d&#39;aspiration

Découvrez un essai cAMP en temps réel pour mesurer l'activation des récepteurs d'odorants dans des cellules vivantes Hana3A. Cette méthode permet un criblage efficace et fiable des interactions récepteur-ligand en neurosciences.

Cellules vivantes mesure d’odorants récepteur Activation en utilisant un essai en temps réel de cAMP

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