Cellules vivantes mesure d’odorants récepteur Activation en utilisant un essai en temps réel de cAMP

Le but global de ce dosage en temps réel et à haut débit de l'AMP cyclique est d'analyser les odorants vis-à-vis des récepteurs à odorants, et inversement. Les souris étant utiles pour étudier le fonctionnement des récepteurs à odorants, elles permettent des criblages à plus grande échelle tant des récepteurs à odorants que de leurs ligands, ainsi que la caractérisation pharmacologique de paires récepteur-ligand d'intérêt. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons évaluer de manière efficace et fiable l'activation du récepteur par l'odorant.

Système d'expression hétérologue d'odeurs vers des récepteurs utilisant des cellules vivantes. Commencez par observer les cellules Hana3A au microscope à contraste de phase afin de vérifier la viabilité cellulaire et d'estimer la confluence. Ensuite, aspirez tout le milieu du plat de culture cellulaire.

Et lavez les cellules en ajoutant 10 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate sur la plaque, en agitant doucement la boîte, puis en aspirant le PBS. Ensuite, ajoutez trois millilitres de trypsine-EDTA à 0,5 % sur la plaque. Laissez la trypsine agir sur les cellules pendant une minute ou jusqu’à ce que toutes les cellules soient en suspension.

Inactiver la trypsine en ajoutant 5 millilitres de MEM contenant 10 % de FCS et en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas pour dissocier les agrégats cellulaires. Après avoir effectué un dénombrement cellulaire, transférer 2 x 10⁶ cellules par plaque de 96 puits à transfecter dans un tube de 15 millilitres. Il est important de calculer avec précision le nombre de cellules à préparer dans la plaque de 96 puits afin d'éviter une surcroissance ou une sous-croissance des cellules avant la stimulation.

Centrifuger les tubes à 200 × g pendant cinq minutes. Ensuite, aspirer le surnageant sans perturber le culot cellulaire. Ajouter six millilitres de milieu sans antibiotiques pour chaque plaque de 96 puits et pipeter par aspiration et distribution sans créer de bulles d'air afin de rompre les agrégats de masse cellulaire.

Transférez les cellules en suspension dans un réservoir. À l’aide d’une pipette multicanal, ajoutez 50 microlitres de cellules dans chaque puits des plaques de 96 puits. Incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Avant la transfection, observer les cellules ensemencées au microscope à contraste de phase afin de s'assurer d'une confluence adéquate d'environ 30 à 50 % par puits, puis les replacer dans l'incubateur. Suivre la ligne indiquée pour le construit odorant-récepteur, les construits des facteurs accessoires et le construit variant du biocapteur d'AMPc. Préparer ensuite un mélange de transfection plasmidique dans 500 microlitres de MEM pour chaque plaque de 96 puits.

Ensuite, préparez un mélange de transfection contenant 18 microlitres de réactif de transfection médiée par lipides dans 500 microlitres de MEM. Mélangez le mélange de transfection avec le mélange plasmatique en aspirant et en expulsant plusieurs fois à l’aide d’une pipette. Incubez ensuite à température ambiante pendant 15 minutes.

Après l'incubation, arrêter la réaction en ajoutant 5 millilitres de MEM contenant 10 % de FBS au mélange de transfection. Ensuite, étendre une couche épaisse de serviettes en papier stériles dans la hotte de culture cellulaire. Prendre une plaque de 96 puits contenant des cellules depuis l'incubateur.

Tapotez doucement et répétitivement la plaque à l’envers sur la pile de serviettes en papier afin que le milieu soit complètement absorbé par les serviettes. Transférez 50 microlitres du mélange de transfection combiné dans chaque puits de la plaque 96-puits et incubez toute la nuit pendant 18 à 24 heures à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Vous pouvez gérer la transfection et le calendrier de stimulation doit rester identique sur l’appareil lorsque plusieurs plaques 96-puits sont testées dans une même expérience, de sorte que toutes les plaques subissent le même intervalle de transfection et d’exposition aux distillats.

Avant la stimulation, observer les cellules transfectées au microscope à contraste de phase afin de s'assurer d'une confluence adéquate de 50 à 80 % par puits avant de les remettre dans l'incubateur. Préparer ensuite le milieu de stimulation en ajoutant 10 millimolaire de heaps et 5 millimolaire de glucose à la solution saline équilibrée de Hanks. Décongeler 55 microlitres d'aliquots du réactif substrat pour le dosage du cycle AMP en temps réel sur de la glace.

Préparez une solution d'abration égale à 2 % en mélangeant 55 microlitres du réactif substrat et 2 750 microlitres de milieu de stimulation. Après avoir étalé une couche épaisse de serviettes en papier sur la paillasse, tapez doucement et répétitivement la plaque à l'envers sur les serviettes en papier afin que le milieu de transfection soit absorbé par celles-ci. Lavez les cellules en pipetant 50 microlitres de milieu de stimulation dans chaque puits.

Tapotez doucement et répétitivement pour éliminer le milieu de stimulation de la plaque de 96 puits. Ajoutez 25 microlitres de solution d'équilibre à 2 % dans chaque puits à l’aide d’une pipette et incubez pendant deux heures à température ambiante à l’abri de la lumière. Juste avant la fin du temps d’incubation, diluez les solutions stock d’odeurs décongelées à la concentration de travail ainsi que le milieu de stimulation.

Avant l'ajout de l'agent odorant, utilisez un lecteur de plaque à chimiluminescence pour mesurer le niveau de luminescence basal de la plaque. Retirez rapidement la plaque du lecteur et ajoutez 25 microlitres des dilutions d'agent odorant dans chaque puits. Ensuite, démarrez immédiatement la mesure continue de la luminescence de tous les puits pendant 20 cycles dans un délai de 30 minutes.

379 récepteurs odorants humains uniques ont été criblés contre la muscone à 30 micromolaire en utilisant le dosage de l'AMPc en temps réel. Les blocs colorés le long de l'axe des X indiquent différentes familles de récepteurs odorants humains. L'axe des Y représente la luminiscence normalisée 30 minutes après l'ajout de l'odeur, lorsque la réponse a atteint son maximum pour le témoin positif.

La réponse de l'OR5AN1 est indiquée. Cette figure montre des mesures en temps réel de l'activation de l'OR5AN1 par différentes concentrations de muscone, ainsi que le résultat d'un contrôle négatif sans odeur. La flèche indique le moment de l'ajout de l'odeur.

Ici, une courbe de réponse en fonction de la concentration de OR5AN1 face à la muscone, 30 minutes après l'ajout de l'odeurant, est présentée. La technique décrite ici nécessite au total trois jours, en commençant par une plaque stock de cultures cellulaires le premier jour. Une fois maîtrisée, l'opération du dernier jour peut être réalisée en trois heures pour chaque plaque de 96 puits, si elle est effectuée correctement.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de gérer l'activation des récepteurs des odeurs à l'aide d'un dosage de l'AMP cyclique afin d'exploiter les résultats.