Cellules vivantes mesure d’odorants récepteur Activation en utilisant un essai en temps réel de cAMP

L’objectif global de ce test AMP cyclique à haut débit en temps réel est de cribler les odorisants contre les récepteurs odorants et vice versa. Étant donné que les souris sont utiles pour étudier le fonctionnement des récepteurs odorants, elles permettent des dépistages à plus grande échelle des récepteurs odorants et des ligands, ainsi que des cartellisations pharmacologiques d’une paire récepteur-ligand d’intérêt. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons évaluer l’activation de l’odorant au récepteur de manière efficace et fiable.

Système d’expression hétérologue d’odorant à récepteur utilisant des cellules vivantes. Commencez par observer les cellules Hana3A à l’aide d’un microscope à contraste de phase pour assurer la viabilité cellulaire et estimer la confluence. Aspirez ensuite tout le milieu de la boîte de culture cellulaire.

Et lavez les cellules en ajoutant 10 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate sur la plaque, en faisant tourner le plat et en aspirant le PBS. Ensuite, ajoutez les trois millilitres de 0,5 % de trypsine-EDTA dans la plaque. Laissez la trypsine sur les cellules pendant une minute ou jusqu’à ce que toutes les cellules soient à flot.

Inactivez la trypsine en ajoutant 5 millilitres de MEM avec 10 % FBS et en pipetant de haut en bas pour briser des morceaux de masse cellulaire. Après avoir effectué un comptage cellulaire, transférez 2x10 dans les 6e cellules par plaque de 96 puits à transfecter dans un tube de 15 millilitres. Il est important que vous calculiez le bon nombre de cellules à préparer sur une plaque à 96 puits pour éviter la prolifération ou la sous-croissance des cellules avant la stimulation.

Centrifugez les tubes à 200 fois G pendant cinq minutes. Et puis aspirez le surnageant sans perturber la palette de la cellule. Ajoutez six millilitres de milieu sans antibiotiques pour chaque plaque de 96 puits et pipetez de haut en bas sans créer de bulles d’air pour briser des morceaux de la masse cellulaire.

Transférez les cellules en suspension dans un réservoir. À l’aide d’une pipette multicanaux, pipetez 50 microlitres de cellules dans chaque puits des plaques de 96 puits. Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Avant la transfection, observez les cellules plaquées sous un microscope à contraste de phase pour assurer une confluence correcte d’environ 30 à 50 % par puits, puis retournez à l’incubateur. Suivez la ligne marquée construction odorant-récepteur, les constructions de facteur accessoire et la construction de variante du biocapteur AMP cyclique. Préparez ensuite un mélange de transfection de plasma dans 500 microlitres de MEM pour chaque plaque de 96 puits.

Ensuite, préparez un mélange de transfection contenant 18 microlitres de réactif de transfection à médiation lipidique dans 500 microlitres de MEM. Mélangez le mélange de transfection avec le mélange de plasma en pipetant de haut en bas. Incuber ensuite à température ambiante pendant 15 minutes.

Après l’incubation, arrêtez la réaction en ajoutant 5 millilitres de MEM avec 10 % FBS au mélange de transfection. Ensuite, étalez une épaisse couche d’essuie-tout stérile dans le capot de culture cellulaire. Prenez une plaque de 96 puits avec des cellules de l’incubateur.

Doucement et à plusieurs reprises, tapotez l’assiette à l’envers sur le tas d’essuie-tout afin que le support soit complètement absorbé par l’essuie-tout. Transférez 50 microlitres du mélange de transfection combiné dans chaque puits de la plaque de 96 puits et incubez pendant une nuit de 18 à 24 heures à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Vous pouvez gérer la transfection et le programme de stimulation doit persister sur l’instrument pendant plus d’une plaque de 96 puits est testée dans une expérience afin que toutes les plaques soient mises en miroir après le même intervalle d’exposition à la transfection et à la distillerie.

Avant la stimulation, observez les cellules transfectées au microscope à contraste de phase pour assurer une bonne confluence de 50 à 80 % par puits avant de retourner à l’incubateur. Préparez ensuite le milieu de stimulation en ajoutant 10 tas millimolaires et 5 millimolaires de glucose à la solution saline équilibrée de Hanks. Décongelez 55 microlitres d’alloquats de réactifs de substrat d’essai AMP cyclique en temps réel sur de la glace.

Préparez une solution d’abration à 2 % égaux en mélangeant 55 microlitres de réactif de substrat et 2 750 microlitres de milieu de stimulation. Après avoir étalé une épaisse couche d’essuie-tout sur le banc, tapotez doucement et à plusieurs reprises l’assiette à l’envers sur les essuie-tout afin que le fluide de transfection soit absorbé par les essuie-tout. Lavez les cellules en pipetant 50 microlitres de milieu de stimulation dans chaque puits.

Tapotez doucement et à plusieurs reprises le milieu de stimulation de la plaque à 96 puits. Pipetez 25 microlitres de solution d’équilibrage à 2 % dans chaque puits et incubez à température ambiante dans l’obscurité pendant deux heures. Avant la fin de la période d’incubation, diluer les solutions mères odorantes décongelées dans le milieu de concentration et de stimulation de travail.

Avant l’ajout d’odorisant, utilisez un lecteur de plaque de chimiluminescence pour mesurer le niveau de luminescence basale de la plaque. Retirez rapidement la plaque du lecteur de plaques et ajoutez 25 microlitres de dilutions odorantes dans chaque puits. Démarrez ensuite immédiatement la mesure de luminescence continue de tous les puits pendant 20 cycles dans les 30 minutes.

379 récepteurs odorants humains uniques ont été criblés contre 30 muscones micromolaires à l’aide du test AMP cyclique en temps réel. Les blocs colorés le long de l’axe X indiquent différentes familles de récepteurs odorants humains. L’axe Y représente la luminescence normalisée 30 minutes après l’ajout d’odorant lorsque la réponse a atteint le maximum pour le contrôle positif.

La réponse de OR5AN1 est indiquée. Cette figure montre les mesures en temps réel de l’activation d’OR5AN1 par différentes concentrations de muscle et le résultat d’un contrôle négatif sans odeur. La flèche indique le point temporel de l’addition de l’odérant.

Ici, une courbe de réponse de concentration de OR5AN1 contre le muscone 30 minutes après l’ajout d’un odorant est montrée. La technique décrite ici prend un total de trois jours, en commençant par une plaque de stock de niveaux de culture le premier jour. Une fois maîtrisé, le processus du dernier jour peut être complété en trois heures pour chaque plaque de 96 puits s’il est exécuté correctement.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de gérer l’activation des récepteurs odorants à l’aide d’un test AMP cyclique pour exploiter les résultats.