Un test d’Inhibition (HI) hémagglutination optimisé pour quantifier les titres d’anticorps spécifiques à la grippe
1 décembre 2017
Les protocoles présentés décrivent comment effectuer un test d’inhibition hémagglutination afin de quantifier les titres d’anticorps spécifiques à la grippe d’échantillons de sérum des destinataires de vaccin contre la grippe. Le premier dosage détermine la concentration optimale d’antigène viral par hémagglutination. Le deuxième essai quantifie les titres d’anticorps spécifiques à la grippe par l’inhibition de l’hémagglutination.
L'objectif général de ce test d'inhibition de l'hémagglutination est de mesurer les titres d'anticorps dirigés contre des virus spécifiques d'intérêt. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la vaccinologie concernant l'immunité et la protection induites par les vaccins au sein de différentes populations et chez divers groupes d'âge ou de patients. Les principaux avantages de cette technique sont sa précision et sa capacité à permettre une détermination rapide du titre des anticorps neutralisants présents.
Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les titres d'anticorps humains, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme les titres d'anticorps présents dans le sérum de souris ou encore les surnageants de culture. Commencez par étiqueter des plaques microtitration de 96 puits avec les informations expérimentales appropriées. Ensuite, placez la plaque en orientation verticale et utilisez une pipette multicanal pour ajouter 25 microlitres de PBS dans chaque puits, à l'exception du premier puits de la rangée de titration arrière inférieure.
Ajouter 50 microlitres de la solution d’antigène fraîchement préparée d’intérêt dans le premier puits de la rangée de rétrotitrage, puis ajouter 25 microlitres d’échantillons de sérum traités par RDE dans les premiers puits des dix rangées supérieures. Ajouter 25 microlitres de l’antisérum approprié dans le premier puits de la 11e rangée comme témoin positif. Transférer ensuite 25 microlitres du premier puits de chaque rangée vers les puits suivants afin d’effectuer des dilutions sérielles par deux.
Pipeter de haut en bas 10 à 15 fois pour chaque étape de dilution, en rejetant les 25 microlitres finaux des derniers puits. Ensuite, ajouter 25 microlitres de la solution d'antigène dans chaque puit des lignes 1 à 11 et 25 microlitres de PBS uniquement dans chaque puit de la ligne de titrage arrière. Tapoter délicatement la plaque 10 fois sur chacun des quatre côtés pour mélanger.
Ensuite, couvrez la plaque pendant 30 minutes à température ambiante. À la fin de l'incubation, ajoutez 50 microlitres de solution de globules rouges dans chaque puits et mélangez la plaque en tapotant davantage. Recouvrez ensuite à nouveau la plaque et incubez les globules rouges selon l'espèce utilisée, comme indiqué dans le tableau.
Après avoir ajouté les globules rouges dans la plaque, respecter le temps d'incubation approprié en fonction du type de sang utilisé dans le test. Une incubation trop courte ou trop longue conduira à une interprétation incorrecte des résultats. À la fin de l'incubation, évaluer l'hémagglutination en inclinant la plaque de 90 degrés pendant 25 secondes et noter les résultats pour chaque puits, pendant que la plaque est encore inclinée, sur un schéma imprimé de la plaque à 96 puits.
Dans cette expérience, la réponse anticorps induite par le vaccin a été évaluée chez 26 volontaires sains ayant reçu un vaccin antigrippal trivalent inactivé contenant les souches A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 et B/Massachusetts/O2/2012 avant la saison grippale 2015. Une réponse immunitaire croisée contre les souches virales A/H3N2/Switzerland/2013 et A/H3N2/Texas/2012 a été observée, avec des titres géométriques moyens d'inhibition de l'hémagglutination significativement plus faibles et une séroprotection induite moindre contre la souche A/H3N2/Switzerland/2013 par rapport à la souche A/H3N2/Texas/2012. Après la vaccination, les titres d'anticorps dirigés contre les deux souches ont augmenté, bien que la souche A/H3N2/Switzerland/2013 ne soit pas présente dans le vaccin.
L'hémagglutinine virale présente un potentiel d'hémagglutination des érythrocytes dépendant de l'espèce. Il est intéressant de noter que le sang de cobaye n'hémagglutine pas correctement avec l'influenza B, tandis que le sang de dinde possède un potentiel d'hémagglutination élevé avec des titres élevés et une faible réactivité croisée. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois heures si elle est effectuée correctement.
Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de traiter le sérum avec la RDE afin d'inactiver les inhibiteurs non spécifiques et les liaisons non spécifiques durant l'hémagglutination du virus. Après cette procédure, d'autres méthodes comme le test ELISA peuvent être réalisées pour répondre à des questions supplémentaires sur le rôle des immunoglobulines spécifiques à un agent pathogène. Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'immunologie virale pour approfondir notre compréhension de l'immunité liée aux vaccins chez des patients sains et immunodéprimés appartenant à différents groupes d'âge.
Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer un test d'inhibition de l'hémagglutination pour quantifier à grande échelle les titres d'anticorps spécifiques aux souches de grippe. N'oubliez pas que le travail avec des antigènes viraux, du sang animal et des échantillons de sérum humain peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le travail en laboratoire de niveau de sécurité biologique 2 (BSL2) doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.
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Aperçu
Cet article présente des protocoles pour réaliser un test d'inhibition de l'hémagglutination afin de quantifier les titres d'anticorps spécifiques contre la grippe à partir d'échantillons sériques. Cette méthode est essentielle pour comprendre l'immunité induite par le vaccin au sein de différentes populations.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Vaccinologie
- Immunologie
- Sérologie
Contexte
- Le test d'inhibition de l'hémagglutination mesure les réponses anticorps contre la grippe.
- Il fournit des informations sur l'efficacité du vaccin et l'immunité de la population.
- Cette méthode peut être appliquée à divers types d'échantillons, notamment le sérum humain et murin.
- La compréhension des titres d'anticorps est essentielle pour évaluer l'efficacité du vaccin.
Objectif de l'étude
- Quantifier les titres d'anticorps spécifiques contre la grippe chez les personnes vaccinées.
- Évaluer la réponse immunitaire chez différentes populations démographiques.
- Fournir une méthode rapide et précise pour la détermination des titres.
Méthodes utilisées
- Étiquetage de plaques microtitration à 96 puits avec les informations expérimentales.
- Utilisation d'une pipette multipuits pour ajouter du PBS dans les puits.
- Réalisation de l'hémagglutination pour déterminer les concentrations optimales d'antigène viral.
- Effectuation de l'inhibition de l'hémagglutination pour quantifier les titres d'anticorps.
Résultats principaux
- Le dosage quantifie précisément les titres d'anticorps dirigés contre la grippe.
- Il met en évidence la présence d'anticorps neutralisants dans les échantillons sériques.
- Les résultats peuvent orienter le développement de vaccins et les stratégies de santé publique.
- La méthode est adaptable à divers types d'échantillons et populations.
Conclusions
- Le test d'inhibition de l'hémagglutination est un outil fiable pour mesurer les réponses immunitaires.
- Cette technique améliore la compréhension de l'immunité induite par les vaccins.
- Les applications futures pourraient s'étendre à d'autres infections virales et populations.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
La quantification précise des taux d'anticorps spécifiques contre la grippe est essentielle pour évaluer l'immunité induite par le vaccin et orienter les évaluations de l'immunogénicité lors du développement préclinique et clinique. Le dosage d'inhibition de l'hémagglutination (HI) offre une méthode normalisée et rapide pour mesurer les réponses en anticorps neutralisants au sein de populations diverses, soutenant ainsi des décisions fondées sur des données probantes concernant la poursuite ou l'abandon de projets dans le développement de vaccins. En permettant l'analyse de la réactivité croisée et l'optimisation des érythrocytes selon l'espèce, ce dosage renforce la fiabilité prédictive des études en immunologie translationnelle.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Analyse les réponses immunitaires induites par les vaccins en quantifiant les titres d'anticorps spécifiques à chaque souche, contribuant ainsi à l'élimination mécanistique des cibles antigéniques à risque.
- Valeur opérationnelle : Permet la validation fonctionnelle de l'hémagglutinine comme antigène clé de la grippe grâce à l'inhibition de l'agglutination virale.
Développement de tests et de criblages
- Valeur scientifique : Standardise les concentrations en antigène par titrage de l'hémagglutination (HA), garantissant des concentrations initiales reproductibles pour le criblage HI en aval.
- Valeur opérationnelle : Permet le criblage de sérums à haut débit en utilisant des dilutions sérielles deux fois consécutives dans un format 96 puits, améliorant ainsi l'évolutivité du test.
- Valeur scientifique : Réduit les réactions croisées grâce à la sélection empirique de globules rouges d'animaux (par exemple, cobaye, dinde), augmentant la spécificité du test pour le virus de la grippe B et les souches hétérologues.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Mesure la séroprotection induite par le vaccin et les titres moyens géométriques (GMT) chez des cohortes saines, fournissant des biomarqueurs translationnels de l'immunogénicité.
- Valeur opérationnelle : Permet la comparaison transversale des réponses immunitaires entre différents groupes d'âge et populations de patients à l'aide de seuils de titrage standardisés.
- Valeur scientifique : Détecte les réponses immunitaires croisées dirigées contre des souches non vaccinales (par exemple, A/H3N2/Switzerland/2013), orientant la conception de vaccins à large spectre.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le test de HI s'intègre dans le flux de travail d'immunogénicité, depuis la découverte précoce jusqu'à la validation préclinique, en fournissant des données quantitatives sur les anticorps qui orientent le choix de l'antigène, l'optimisation de l'adjuvant et les études de détermination des doses.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses sur l'efficacité des vaccins en mesurant l'inhibition fonctionnelle des anticorps vis-à-vis de l'hémagglutination.
- Dépistage : Fournit des résultats quantitatifs reproductibles de titres à partir de dilutions sérielles, permettant une évaluation fiable de composés ou de candidats vaccins.
- Analytique : Génère des titres finaux et des moyennes géométriques permettant la comparaison statistique des réponses immunitaires entre différents groupes expérimentaux.
- Recherche translationnelle : Assure la continuité préclinique en évaluant l'immunogénicité dans des modèles animaux (par exemple, sérum de souris) avant les essais humains.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme standardisée de sérologie applicable à plusieurs souches de virus de la grippe et à divers formats de vaccins.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Fournit une confiance prédictive dans l'immunité induite par le vaccin en mesurant les titres d'anticorps neutralisants comme corrélat de protection.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité du test grâce à une préparation standardisée de l'antigène, à l'utilisation de sérum traité par la RDE et à des durées d'incubation spécifiques aux érythrocytes selon les espèces.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller ou de ne pas aller en identifiant précocement une immunogénicité insuffisante, réduisant ainsi les risques biologiques en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des candidats vaccins en fonction de l'étendue des titres croisés entre souches et des taux de séroprotection.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en virologie et en sérologie pour manipuler les antigènes viraux, préparer le sérum traité à la RDE et interpréter les points terminaux d'hémagglutination.
- Dépend de l'accès à des installations conformes au niveau de sécurité biologique 2 (BSL2) pour manipuler en toute sécurité les virus de la grippe et les produits sanguins humains ou animaux.
- Exige une standardisation des sources d'érythrocytes (par exemple, cobaye, dinde, humain de groupe O) afin de minimiser les réactions croisées et garantir une agglutination spécifique à l'espèce.
- Requiert un contrôle précis du temps d'incubation des érythrocytes pour éviter des lectures d'hémagglutination faussement négatives ou faussement positives.
- Limité à la mesure de l'activité fonctionnelle des anticorps ; ne permet pas de quantifier les classes d'immunoglobulines non neutralisantes ou non fonctionnelles sans tests complémentaires (par exemple, ELISA).
