Name: Enrichissement des agrégats de protéine insoluble dans le détergent du cerveau post-mortem humain (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Découvrez un protocole de fractionnement pour enrichir les agrégats de protéines insolubles dans le détergent à partir de tissu cérébral post-mortem humain. Cette méthode rapide facilite l'étude des protéines mal repliées dans les maladies neurodégénératives.

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Les auteurs remercient les Drs Jim Lah et Allan Levey, département de neurologie de Emory, des suggestions et des commentaires utiles. Ce travail a été en partie financé par le partenariat de médecine accélérant (U01AG046161-02), le Emory Alzheimer de grant Disease Research Center (P50AG025688) et un National Institute on Aging accordent (R01AG053960-01) à SNRC Cette recherche a été également soutenue en partie par le noyau de neuropathologie de l’octroi d’installations centrales de Emory Neuroscience NINDS, P30NS055077.

déclaration d’éthique : tous les tissus du cerveau ont été extraites de l’Emory Alzheimer &#39; s Disease Research Center (ADRC) Banque de cerveaux. Des tissus post-mortem humains ont été acquis en vertu de protocoles appropriés de Institutional Review Board (IRB).
 1. homogénéisation et fractionnement <ol><li>sélection de tissu Remarque : Frozen tissus post-mortem de cortex frontal de contrôle sain (Ctl) et pathologiquement AD confirmés ont été sélectionnés parmi la Emory Banque de cerveaux ADRC (n = 2). Évaluation neuropathologique post-mortem de la distribution de plaques amyloïdes a été réalisée selon le Consortium afin de mettre sur pied un registre d’Alzheimer &#39; s maladie semiquantitative marquant les critères 24, bien que pathologie de l’enchevêtrement neurofibrillaire a été évalué conformément au système de mise en scène de Braak. 16 <ol><li>obtenir congelé des tissus post-mortem de cerveau sain contrôle (Ctl) et pathologiquement AD confirmés. Utilisant des conteneurs de glace sèche, forceps et une lame de rasoir, d’accise ~ portions de 250 mg de matière grise de chaque échantillon de tissu sur jetable taré peser bateaux, en prenant soin d’éviter le tissu de la fonte. Noter le poids de chaque pièce pour être homogénéisés.</li>
		<li>D’accise ~ 250 mg de matière grise à l’aide de pinces et rasoir en inspectant visuellement pour localiser l’interface entre la matière grise extérieure et intérieure de matière blanche. Éviter la substance blanche et surtout, un gros vaisseaux sanguins ou régions sanglantes, les méninges ou mater arachnoïdien. Garder les tissus congelés pendant le processus de découpe en travaillant rapidement et fréquemment en plaçant pesage bateau avec tissu cérébral dans des contenants en polystyrène avec glace sèche</li>
		<li>Enregistrer le poids exact de matière grise excisé de chaque morceau gelé à l’aide d’une balance analytique. Calculer le volume de tampon hyposodé (LS) (voir tableau 1) nécessaires pour l’homogénéisation dounce (5 mL/g, soit 20 % p/v).</li>
		<li>Préparer 10 mL LS tampon avec 1 inhibiteur de la protéase et la phosphatase cocktail et chill sur glace.</li>
		<li>Retirer tissu pesé et pesage bateau de glace sèche et dés en morceaux de 2 x 2 mm à peu près comme il dégèle. Transférez dans un tube de homogénisateur de dounce préalablement réfrigérées 2 mL sur glace</li>
		<li>Ajouter 5 mL/g (20 % p/v) de tampon hyposodé glacee (LS) avec 1 X cocktail inhibiteur de la protéase et de la phosphatase.</li>
		<li>Homogénéisez le tissu cérébral sur la glace en utilisant environ 10 coups de clairance élevée Pilon A et 15 coups de pilon de faible garde B.</li>
		<li>Transfert homogénat tous à un tube en polypropylène 2 mL à l’aide d’une pipette Pasteur en verre. Le tube avec l’étiquette &#8220; TH &#8221; (homogénat Total), le tissu affaire nombre et homogénat volume. aliquote 0,8 mL dans un tube marqué 1,5 mL. L’homogénat tout excès peut être de la même manière aliquotés et congelés à -80 ° C.</li>
		<li>à chaque aliquote de 0,8 mL, ajouter 100 µL de chaque de 5 M de NaCl et sarkosyl 10 % (p/v) à des concentrations de 0,5 M et 1 % p/v, respectivement. Mélanger des tubes bien par inversion et incuber sur glace pour les tubes étiquette 15 min. avec &#34; TH-S &#34; (Total homogénat-Sarkosyl) pour indiquer que les homogénats sont en tampon sarkosyl (tableau 1).</li>
		<li>Soniquer chaque tube pour trois 5 s Pulse à amplitude de 30 % sur la glace (intensité maximale = 40 %) en utilisant une sonde de microtip.</li> <li>déterminer les concentrations de protéine des homogénats à l’aide de l’acide bicinchoninic (BCA) dosage 25 méthode. 
		Remarque : La concentration de protéine moyenne des homogénats de TH-S préparés à 5 mL LS par gramme de tissu est de 15 à 20 mg/mL. Les homogénats peuvent être fractionnés immédiatement ou conservées à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.</li>
		<li>Des homogénats de TH-S diluer à 10 mg/mL à l’aide de tampon de sark glacee (tableau 1) avec 1 x inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase.</li>
		<li>Transfert 5 mg protéine (0,5 mL) de chaque homogénat TH-S dans 500 µL en polycarbonate ultracentrifugeuse tubes et de balance des paire avec tampon de Sercq. Charger les tubes dans un rotor préalablement réfrigéré et ultracentrifugeuse à 180 000 x g pendant 30 min à 4 ° C. transfert le sarkosyl soluble dans les surnageants (S1) pour tubes de 1,5 mL et conserver à -80 ° C. 
		NOTE : (En option lavage) ajouter 200 µL de sark-tampon de l’ultracentrifugeuse tubes contenant les fractions insolubles dans un détergent (P1) et déloger les pellets (P1) de la partie inférieure des tubes ultracentrifugeuse à l’aide d’une pointe de pipette de 200 µL.</li>
		Tubes <li>brièvement le pouls-spin inversé pour 2-3 s (&#8804; 2 500 g x) sur une micro-centrifugeuse pour transférer les granulés (P1) et le tampon pour les tubes de 1,5 mL ci-dessous. Resuspendre les pellets insolubles (P1) dans le tampon sark de pipetage de haut en bas afin d’assurer le culot est perturbé.</li>
		<li>La paire-balance et centrifuger à 180 000 x g pendant une supplémentaire de 30 min à 4 ° C.</li>
		<li>Jeter le surnageant de lavage en option (S2) et incuber les pellets sarkosyl insoluble (P2) dans 50 à 75 µL de tampon de l’urée (tableau 1) avec 1 x PIC (protéase et phosphatase inhibiteur de cocktail) pendant 30 min à température ambiante à solubiliser les Pellet. 
		NOTE : Urée chaude tampon à température ambiante avant utilisation pour éviter la précipitation de SDS. Pour les applications sensibles au détergent, omettez SDS du tampon de l’urée et tient compte de laver le culot insoluble (P2) faible tampon salin avant resuspendant dans tampon urée.</li>
		<li>Transfert des granulés remises en suspension (P2) aux tubes de 0,5 mL et l’utilisation brève (1 s) microtip sonication à amplitude de 20 % (intensité maximale = 40 %) à solubiliser complètement les plombs.</li>
		<li>Déterminer les concentrations de protéine du sarkosyl-soluble (S1) et - insolubles fractions (P2) à l’aide de la BCA de la méthode de dosage. Utiliser ces fractions immédiatement ou conserver à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunoblotting <ol><li>Western blotting Remarque : Éponger occidental a été effectuée conformément aux procédures déjà rapportées avec de légères modifications. 5 , 10 <ol><li>préparer 40 µg échantillons totales homogénats (TH-S), sark-soluble (S1), des fractions (P2) sark insoluble dans 1 X Laemmli SDS-page échantillon solution tampon 5 mM PTCE 7. Incuber les échantillons à 95 ° C pendant 5 min.</li>
		Gel d’échantillons <li>charge sur un préfabriqué 10 puits 4-12 % Bis-Tris SDS-PAGE. ELECTROPHORESE à 80 V pour le premier centimètre (10 min) et 120 V pour le reste (60 min) ou jusqu'à ce que le colorant de repérage atteint le fond du gel.</li>
		<li>Utiliser une nouvelle lame de rasoir et couteau de gel pour split-ouvrir la cassette de gel préfabriqué. Couper délicatement les peignes et tout en bas du gel avec une lame de rasoir fraîche.</li>
		<li>Remettre en suspension les pellets insolubles (P1) dans 200 µl de sark-tampon avec 1 x PIC de pipetage up ou down.</li>
		<li>Transfert d’une membrane de nitrocellulose de 0,2 µm en utilisant une méthode de transfert sec sur une machine de transfert (voir la Table des matières).</li>
		<li>Bloquer la membrane dans un tampon bloquant (BB) sans Tween 20 pendant 30 min, suivie avec BB avec 0,05 % Tween 20 (BB/T) pendant 30 min. Après le blocage, rincez la membrane dans SCT/T (0,1 % Tween 20) pendant 5 min enlever l’excès de tampon bloquant.</li>
		<li>Préparer des dilutions de 1 : 1 000 de l’anticorps primaire pT231, Tau-2 (pan tau), AT8 et EEA1 en BB/T (0,05 % de Tween 20).</li>
		<li>Incuber les membranes en solution d’anticorps primaire pendant la nuit à 4 ° C sous agitation circulaire. Rincer la membrane au SCT/T pour 3 x 15 min.</li>
		<li>Sonde la membrane avec une dilution de 1/20 000 de la fluorescent proche infrarouge secondaires anticorps marqués en BB/T pendant 60 min à température ambiante dans l’obscurité sur l’agitateur. Rincer la membrane pour 3 x 10 min dans SCT/T et 2 x 5 min dans les directives du SCT.</li>
		<li>Scan la membrane à l’aide d’un système à la longueur d’onde d’excitation appropriée (p. ex. 700 nm (canal rouge) pour le colorant infrarouge 680 chèvre anti-souris IgG (H + L) secondaire à 800 nm (couche verte) pour teinture infrarouge 790 âne anti-lapin IgG (H + L d’imagerie infrarouge ) secondaire).</li>
		<li>Utiliser le logiciel d’imagerie pour quantifier les intensités du signal et d’effectuer des mesures de densitométrie selon le fabricant &#39; instructions s, assurant le réglage auto-document d’information est défini sur moyen tout l’arrière-plan.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+Proteins+in+Neurodegenerative+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease.</a> Science. 296 (5575), 1991(1991).</li>
<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).</li>
<li>Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+exploration+of+the+influence+of+the+protein+stability+on+amyloid+fibril+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).</li>
<li>Hamley, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Amyloid+Beta+Peptide%3A+A+Chemist%27s+Perspective.+Role+in+Alzheimer%27s+and+Fibrillization%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">The Amyloid Beta Peptide: A Chemist's Perspective. Role in Alzheimer's and Fibrillization.</a> Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).</li>
<li>Diner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+Properties+of+the+Small+Nuclear+Ribonucleoprotein+U1-70K+in+Alzheimer+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease.</a> J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).</li>
<li>Gozal, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+Analysis+Reveals+Novel+Components+in+the+Detergent-Insoluble+Subproteome+in+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer's Disease.</a> J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).</li>
<li>Hales, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+detergent-insoluble+brain+proteome+linked+to+amyloid+and+tau+in+Alzheimer%27s+Disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS%22%5BJournal%5D)">Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer's Disease progression.</a> PROTEOMICS. , (2016).</li>
<li>Julien, C., Bretteville, A., Planel, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJulien%2C+C+%22Amyloid+Proteins%3A+Methods+and+Protocols%22">Amyloid Proteins: Methods and Protocols</a>. Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. , Humana Press. 473-491 (2012).</li>
<li>Nizhnikov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Screening+for+Amyloid+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Proteomic Screening for Amyloid Proteins.</a> PLoS ONE. 9 (12), e116003(2014).</li>
<li>Seyfried, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+detergent-insoluble+brain+proteome+in+frontotemporal+lobar+degeneration+using+SILAC+internal+standards%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards.</a> J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).</li>
<li>Woltjer, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+determination+of+widespread+detergent+insolubility%2C+including+A%CE%B2+but+not+tau%2C+early+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including Aβ but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> FASEB J. , (2005).</li>
<li>Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+Characterization+of+the+Core+Structure+of+%CE%B1-Synuclein+Filaments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biochemical Characterization of the Core Structure of α-Synuclein Filaments.</a> J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).</li>
<li>Hasegawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylated+%CE%B1-Synuclein+Is+Ubiquitinated+in+%CE%B1-Synucleinopathy+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylated α-Synuclein Is Ubiquitinated in α-Synucleinopathy Lesions.</a> J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).</li>
<li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitinated+TDP-43+in+Frontotemporal+Lobar+Degeneration+and+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Science. 314 (5796), 130(2006).</li>
<li>Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. <a target="_blank" href="http://www.fasebj.org/content/29/1_Supplement/712.3">An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association.</a> FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).</li>
<li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1759558">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).</li>
<li>Noguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Patient-derived%2C+Toxic%2C+High+Mass+Amyloid+%CE%B2-Protein+%28A%CE%B2%29+Assembly+from+Alzheimer+Disease+Brains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid β-Protein (Aβ) Assembly from Alzheimer Disease Brains.</a> J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li>
<li>Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+%CE%B2-Amyloid+Protein+Is+Covalently+Modified+when+Dissolved+in+Formic+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's β-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid.</a> J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).</li>
<li>Yang, L. -S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+Released+from+Paired+Helical+Filaments+with+Formic+Acid+or+Guanidine+Is+Susceptible+to+Calpain-Mediated+Proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis.</a> J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li>
<li>Hales, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+small+nuclear+ribonucleoproteins+%28snRNPs%29+aggregate+in+Alzheimer%27s+disease+due+to+autosomal+dominant+genetic+mutations+and+trisomy+21%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer's disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21.</a> Mol Neurodegener. 9 (1), 15(2014).</li>
<li>Xiong, L. -W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+change%2C+aggregation+and+fibril+formation+induced+by+detergent+treatments+of+cellular+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein.</a> J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).</li>
<li>Mirra, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Consortium+to+Establish+a+Registry+for+Alzheimer%27s+Disease+%28CERAD%29.+Part+II.+Standardization+of+the+neuropathologic+assessment+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease.</a> Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Guo, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+pathological+tau+conformers+from+Alzheimer%27s+brains+transmit+tau+pathology+in+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Unique pathological tau conformers from Alzheimer's brains transmit tau pathology in nontransgenic mice.</a> J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).</li>
<li>Matveev, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+subfraction+of+A%CE%B2+is+responsible+for+the+high-affinity+Pittsburgh+compound+B-binding+site+in+Alzheimer%27s+disease+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer's disease brain.</a> J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans les présentes, nous introduisons et discuter d’un protocole de détergent-fractionnement seule étape abrégé qui s’applique à un large éventail d’applications expérimentales allant d’analyse basé sur la spectrométrie de masse protéomique d’une protéine fonctionnelle mauvais repliement des essais et transfert Western. 5 , 6 , 7 , 10 cette méthodologie est peut-être plus efficace lorsqu’il est...

Les maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer (ma), maladie de Parkinson (MP), maladie de Huntington (MH), sclérose latérale amyotrophique (SLA) et les maladies de prion étroitement apparentées sont proteinopathies caractérisée par l’accumulation progressive de agrégats de protéine insoluble dans le détergent dans le cerveau avec accompagnement cognitives déclinent. 1 , 2 cette caractéristique pathologique partagée est censée jouer un rôle central dans l’étiologie et la physiopathologie de ces maladies neurodégénératives. 2 ces agrégats sont composés de polymères fibres amyloïdes, qui sont composées d’unités de protéines mal repliées montrant Croix βrépétitives-structure. 1 , 2 , 3 , 4 biochimiquement, agrégats amyloïdes sont très résistants à la dénaturation chimique ou thermique et solubilisation,3 qui présente des difficultés particulières pour leur purification, analyse et étudient via des techniques biochimiques classiques. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 sans surprise, la fraction des protéines insolubles dans un détergent a fait l’objet de nombreuses recherches dans la physiopathologie des maladies neurodégénératives impliquant l’accumulation de protéines mal repliées. 6 , 12 , 13 , 14
Les techniques de fractionnement biochimique ont souvent été utilisés pour enrichir la fraction insoluble dans le détergent d’homogénats de cerveau post-mortem. 6 , 12 , 13 , 14 une des méthodes plus courantes consiste à l’extraction séquentielle des homogénats de tissus avec des tampons et des détergents d’accroître la rigueur, suivi par ultracentrifugation pour partitionner les fractions solubles et insolubles. Un fractionnement séquentiel couramment utilisés protocole6,14 implique l’homogénéisation des échantillons de tissus congelés dans un tampon sans tensioactifs hyposodé (LS) et les pellets insolubles qui en résultent sont extraites puis séquentiellement avec tampons contenant du sel élevé, détergents non ioniques, saccharose élevé, détergents ioniques et enfin chaotropes comme urée. 6 , 14 un inconvénient évident de ces protocoles de fractionnement séquentiel un est beaucoup de temps et engagement de travail nécessaire pour les terminer. Y compris l’homogénéisation et l’ultracentrifugation, un protocole typique cinq étapes fractionnement peut prendre plusieurs heures, voire jours pour compléter. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 en outre, agrégats de protéine pathologique autant restent insolubles dans tous, mais les plus dures conditions19,20 la plupart des fractions générées sont d’une utilité limitée. Ainsi, les mesures moins rigoureuses fractionnement utilisant de fortes concentrations en sel et détergents non ioniques sont largement redondants.
Des études antérieures ont montré que le détergent ionique N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) est un excellent candidat pour un protocole simplifié seule étape détergent fractionnement. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 comme un détergent dénaturation, sarkosyl est suffisamment strict pour solubiliser la grande majorité des protéines nativement repliées dans le cerveau sans la solubilisation des agrégats de protéines mal repliées composés de protéine bêta-amyloïde (Aß),6,11 tau phosphorylée (pTau),6 protéines de liaison à l’ADN de goudron 43 (TDP-43),14 alpha-synucléine, tremblante de12,13 ,23 ou U1 petites ribonucléoprotéines nucléaires (snRNP U1) tels que U1 - 70 K. 5 , 21 , 22 Sarkosyl étant moins rigoureux que le dodécylsulfate de sodium de détergent anionique omniprésent (SDS), elle conserve moins robustes formes oligomères d’agrégats de protéines mal repliées qui ne peut pas résister aux traitement de SDS. 9
Auparavant, nous avons décrit un protocole de détergent-fractionnement abrégé qui a obtenu des résultats comparables aux méthodes de fractionnement séquentiel plus laborieux. 5 en omettant les étapes de fractionnement moins rigoureux, nous avons pu développer un protocole facile seule étape fractionnement pour l’enrichissement des agrégats de protéine insoluble dans le détergent du cerveau humain post-mortem. 5 ce protocole détaillé décrit ci-après est bien adapté pour un large éventail d’applications expérimentales allant de Western Blot et basé sur la spectrométrie de masse protéomique fonctionnelle repliement et ensemencement d’agrégation des analyses. 5 , 6 , 21

<table><tbody><tr><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase, sans EDTA (100X)</td><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase</td> <td>Thermo Fisher</td><td>78441</td></tr><tr><td>Système de dismembrateur sonique (ultrasonateur)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>FB505110 ultrasoniseur à micropointes</td></tr><tr><td>Optimax TLX Ultracentrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>361545</td><td>rotor réfrigéré</td></tr><tr><td>TLA120.1</td><td>Rotor d’ultracentrifugeuse</td> <td>Beckman Coulter</td><td>362224</td></tr><tr><td>Tubes en polycarbonate 500 ul (8 x 34 mm), tube</td> d’ultracentrifugeuse <td>Beckman Coulter</td><td>343776</td> paroi épaisse <td>pour rotor TLA120.1</td></tr><tr><td>Tampon d’échantillon SDS 4X Solution d’échantillon</td><td>SDS-PAGE</td><td>TCEP faite maison</td><td></td></tr><tr><td>, pH neutre</td> Tampon de blocage de l’agent <td>réducteur</td> <td>Thermo Fisher</td><td>77720</td></tr> <tr><td>Thermo</td><td>Fisher</td><td>37542</td><td>tampon bloquant</td></tr> <tr><td>(TBS) tampon bloquant + 0,05 % Tween 20</td><td>Thermo Fisher</td><td>37543</td><td>tampon bloquant et diluant anticorps</td></tr><tr><td>4-12 % gels Bolt Bis-Tris Plus, 10 puits Thermo</td><td>Fisher</td><td>NW04120BOX</td><td>gels préfabriqués SDS-PAGE</td></tr><tr><td>MES Tampon de fonctionnement SDS (20X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>B0002</td><td>Tampon de fonctionnement SDS-PAGE</td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sel de sodium (sarkosyl)</td><td>Sigma Détergent Aldrich</td><td>L5777-50G</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-Tau-2 (pan tau)</td><td>Anticorps Chemicon</td><td>MAB375</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-phospho-thréonine 231 Anticorps Tau</td><td>Millipore</td><td>MAB5450</td><td>Anticorps</td></tr><tr><td>anti-phospho-séroïne 202 et thréonine 205 Anticorps Tau (AT8)</td><td>Anticorps Thermo Fisher</td><td>MN1020</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-antigène endosomique précoce 1 (EEA1)</td><td>abcam</td><td>Anticorps ab2900</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 Anticorps secondaires IgG (H+L) anti-souris Anticorps Thermo</td><td>Fisher</td><td>A21058</td><td>Anticorps</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 790 anti-IgG (H+L) âne Anticorps Thermo</td><td>Fisher</td><td>A11374</td><td>Anticorps</td></tr><tr><td>iBlot2 Système de transfert sec Thermo</td><td>Fisher</td><td>IB21001</td><td>Gel</td>Stacks</tr><tr><td>, nitrocellulose, mini</td><td>Transfert de gel Thermo Fisher</td><td>IB23002</td><td></td></tr></tbody></table>

enrichissement des agrégats de protéine insoluble dans le détergent du cerveau post-mortem humain

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Dans cette étude, les auteurs décrivent un protocole abrégée seule étape fractionnement pour l’enrichissement des agrégats de protéine insoluble dans le détergent du cerveau humain de post-mortem. Le détergent ionique N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) solubilise efficacement les protéines nativement repliées dans le tissu cérébral, ce qui permet l’enrichissement des agrégats de protéine insoluble dans le détergent parmi un large éventail de proteinopathies neurodégénératives, telles que La maladie d’Alzheimer (ma), la maladie de Parkinson et la sclérose latérale amyotrophique et maladies à prions. Contrôle de l’homme et les tissus du cerveau post-mortem AD ont été homogénéisés et sédimentée par ultracentrifugation en présence de sarkosyl pour enrichir les agrégats de protéines insolubles dans un détergent dont la protéine tau phosphorylée pathologique, le composant principal d’enchevêtrements enchevêtrements dans AD. Western blot ont démontré la solubilité différentielle des agrégés-tau phosphorylée et la protéine soluble dans un détergent, Endosome précoce Antigen 1 (EEA1) dans le contrôle et le cerveau. Analyse protéomique a également révélé l’enrichissement des β-amyloïde (Aß), tau, snRNP70 (U1 - 70 K) et de l’apolipoprotéine E (APOE) dans les fractions sarkosyl insoluble du cerveau par rapport à celles du contrôle, compatible avec les stratégies précédentes de fractionnement tissulaire . Par conséquent, ce protocole simple enrichissement est idéal pour un large éventail d’applications expérimentales allant de Western Blot et protéine fonctionnelle épreuves agrégation Co à basé sur la spectrométrie de masse protéomique.

Le protocole abrégée seule étape sarkosyl-fractionnement a été utilisé pour enrichir les agrégats de protéines insolubles dans un détergent de contrôle et de cerveau post-mortem (Figure 1). Les protéines des fractions TH-S, S1, S2 et P2 ont été résolus par SDS-PAGE, fixée pendant 15 min dans le bleu de Coomassie bleu tampon fixateur suivie d’une coloration douce avec du tampon de coloration bleu de Coomassie brillant bleu G-250. L’étape de remise en suspensio...

Un protocole de fractionnement abrégée pour l’enrichissement des agrégats de protéine insoluble dans le détergent du cerveau post-mortem humain est décrite.

Enrichissement des agrégats de protéine insoluble dans le détergent du cerveau post-mortem humain

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

L'objectif général de ce protocole de fractionnement est d'enrichir les agrégats protéiques insolubles dans les détergents à partir de tissu cérébral humain post-mortem. Cette méthode peut donc aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurodégénérescence, telles que l'identification et la caractérisation des agrégats protéiques mal repliés dans les maladies. Le principal avantage de cette technique réside dans l'enrichissement rapide et efficace des agrégats protéiques insolubles dans les détergents issus du tissu cérébral, permettant leur isolement en un court laps de temps.Tram Nguyen, une technicienne de mon laboratoire, démontrera cette procédure. Obtenez des tissus cérébraux post-mortem congelés provenant de sujets témoins sains et de cas d'AD confirmés par examen pathologique. Utilisez une pince et une lame de rasoir pour prélever environ 250 milligrammes de matière grise à partir de chaque échantillon de tissu. Laissez le fragment cérébral décongeler pendant une minute.À présent, découpez un morceau de tissu en morceaux d'environ deux millimètres cubes au fur et à mesure de son dégel. Transférez-les dans un tube d'homogénéisateur Dounce de deux millilitres prérefroidi, placé sur de la glace. N'oubliez pas d'éviter la matière blanche et tout vaisseau sanguin de grande taille.Travaillez rapidement et placez le tissu sur des barquettes jetables TARE. Veillez à empêcher le tissu de dégeler en plaçant fréquemment la barquette contenant le tissu cérébral dans des récipients en polystyrène contenant de la glace sèche. Après avoir disséqué et pesé toutes les parties de tissu nécessaires, retirez une barquette contenant un morceau de tissu de la glace sèche.Ensuite, ajoutez cinq millilitres de tampon froid à faible teneur en sel, contenant un cocktail d'inhibiteurs de protéase et de phosphatase, par gramme de tissu, et homogénéisez sur glace en effectuant environ 10 mouvements avec le pilon A à grand jeu et 15 mouvements avec le pilon B à faible jeu. Utilisez ensuite une pipette Pasteur en verre de neuf pouces pour transférer chaque homogénat dans un tube en polypropylène de deux millilitres préalablement étiqueté. Répartissez l'homogénat restant en aliquotes dans des tubes supplémentaires de 1,5 millilitre, également étiquetés, de manière similaire, pour stockage à moins 80 degrés Celsius. Pour poursuivre la fractionation, ajoutez 100 microlitres de chlorure de sodium à cinq molaire et 100 microlitres de sarkosyl à 10 pour cent à chaque aliquot de 0,8 millilitre.Mélanger soigneusement par retournement. Puis incuber sur de la glace pendant 15 minutes. Après l'incubation, utiliser un sonicateur équipé d'une sonde à micro-pointe pour appliquer trois impulsions de cinq secondes à une amplitude de 30 pour cent.Après avoir déterminé les concentrations en protéines des homogénats par la méthode à l'acide bicinchoninique, ajouter du tampon sark froid avec des inhibiteurs de protéase et de phosphatase à chaque échantillon pour obtenir une concentration finale de 10 milligrammes par millilitre. Ensuite, transférer 500 microlitres de chaque échantillon dans des tubes d'ultracentrifugation en polycarbonate de 500 microlitres. Placer les tubes dans un rotor prérefroidi et effectuer l'ultracentrifugation à 180 000 ×g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.Après la centrifugation, transférez les surnageants solubles dans le sarkosyl (S1) dans des tubes de 1,5 millilitre et conservez-les à moins 80 degrés Celsius. Ajoutez 200 microlitres de tampon sark aux tubes d'ultracentrifugation contenant les fractions P1 insolubles dans le détergent, puis utilisez la pointe de pipette pour détacher les culots du fond des tubes d'ultracentrifugation. Ensuite, transférez les culots P1 resuspendus dans de nouveaux tubes d'ultracentrifugation de 500 microlitres, équilibrez-les par paire et centrifugez-les à 180 000 ×g pendant 30 minutes supplémentaires à quatre degrés Celsius.Jetez le surnageant S2. Ensuite, ajoutez 50 à 75 microlitres de tampon urée contenant un cocktail d'inhibiteurs de protéases et de phosphatases aux culots insolubles dans la sarkosyl et incubez pendant 30 minutes à température ambiante afin de solubiliser le culot P2. Après l'incubation, transférez les culots P2 resuspendus dans des tubes de 0,5 millilitre étiquetés et solubilisez complètement les culots à l'aide d'une sonication brève d'une seconde avec une microsonde à une amplitude de 20 pour cent.Déterminez les concentrations en protéines des fractions solubles et insolubles dans le sarkosyl à l'aide de la méthode de dosage BCA. Préparez des échantillons de 40 microgrammes des fractions S1 solubles dans le sarkosyl et P2 insolubles dans le sarkosyl du homogénat total dans un tampon d'électrophorèse SDS-PAGE de Laemmli 1x contenant du TCEP à cinq millimolaire à pH sept. Incubez les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes.Déposer les échantillons sur des gels préfabriqués de SDS-PAGE Bis-Tris à 10 puits et à gradient de 4 à 12 pour cent. Réaliser l'électrophorèse à 80 volts pendant le premier centimètre, puis à 120 volts pendant environ une heure, ou jusqu'à ce que le colorant marqueur atteigne le bas du gel. Plonger les cassettes de gel préfabriquées dans de l'eau distillée, puis utiliser une lame de rasoir neuve et un couteau à gel pour les ouvrir.Couper délicatement les peignes et la partie inférieure de chaque gel à l’aide d’une lame de rasoir neuve. Transférer sur des membranes de nitrocellulose de 0,2 micron par méthode de transfert sec à l’aide d’un appareil de transfert. Après le transfert, bloquer les membranes dans une solution de blocage sans Tween-20 pendant 30 minutes, puis dans une solution de blocage contenant 0,5 pour cent de Tween-20 pendant 30 minutes.Après le blocage, rincer les membranes dans du TBS contenant 0,1 % de Tween-20 pendant cinq minutes afin d'éliminer l'excès de solution de blocage. Préparer des dilutions 1 :1 000 des anticorps primaires dans la solution de blocage contenant 0,5 % de Tween-20. Les anticorps dirigés contre la protéine Tau phosphorylée (pT231) et EEA1 sont utilisés ici.Incuber les membranes dans la solution d'anticorps primaire toute la nuit à quatre degrés Celsius avec agitation circulaire. Le lendemain, rincer les membranes dans du TBS contenant 0,1 pour cent de Tween-20, trois fois pendant 15 minutes chacune. Provoquer les membranes avec une dilution 1:20 000 de l'anticorps secondaire marqué par fluorescence infrarouge et du tampon de blocage contenant 0,5 pour cent de Tween-20 pendant 60 minutes à température ambiante à l'abri de la lumière sur un agitateur.Après l'incubation, rincer la membrane trois fois pendant 10 minutes dans du TBS contenant 0,1 % de Tween-20, puis deux fois dans du TBS pendant cinq minutes chacune. Analyser la membrane à l'aide d'un système d'imagerie infrarouge, en utilisant la longueur d'onde d'excitation appropriée pour l'anticorps secondaire utilisé. Ce gel coloré au bleu de Coomassie montre 20 µg de protéine provenant des fractions TH-S, S1, S2 et P2.L'analyse par immunotransfert montre clairement que, dans le cerveau des patients atteints de la maladie d'Alzheimer (AD), la protéine Tau phosphorylée de haut poids moléculaire s'agrège sous une forme insoluble dans la sarkosyl, et très peu de Tau phosphorylé reste dans les fractions solubles à la sarkosyl. L'EEA1 a été utilisée comme marqueur général de la plupart des protéines natives non pathologiques, qui sont naturellement solubles dans la sarkosyl et se retrouvent dans la fraction S1, tant dans les cerveaux témoins que dans ceux atteints de la maladie d'Alzheimer. Notamment, le signal de l'EEA1 était légèrement moins intense dans la fraction soluble par rapport à la fraction TH-S, indiquant qu'une petite fraction de l'EEA1 est probablement insoluble dans la sarkosyl, mais en dessous de la limite de détection par immunotransfert avec cet anticorps particulier.Cette figure montre l'analyse protéomique des protéines pathologiques de la maladie d'Alzheimer (AD) à l'aide d'un protocole de fractionnement en une seule étape ou en plusieurs étapes. La technique de fractionnement en une seule étape peut présenter un avantage pour les protéines peu abondantes, car les pertes globales d'échantillon sont considérablement réduites. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'exciser autant que possible la substance blanche du tissu cérébral.Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la protéomique basée sur la spectrométrie de masse peuvent être réalisées afin d'identifier et de caractériser les composants protéiques centraux des agrégats pathologiques dans leurs maladies dégénératives.

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