Cartographie génomique des interactions protéine-ADN avec ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

L’objectif global de cette procédure est de générer des cartes à l’échelle du génome des interactions protéine-ADN in situ avec une haute résolution et un faible bruit de fond, sans avoir besoin de réticulation du formaldéhyde, de solubilisation de la chromatine ou d’anticorps. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la transcription, telles que l’association de divers facteurs régulateurs avec la chromatine, par rapport aux régions de régulation des gènes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit des cartes de liaison génomique à haute résolution avec un bruit de fond négligeable, et évite les limitations associées aux protocoles standard ChEC-seq.

Sebastian Grunberg, mon collègue du Centre de recherche sur le cancer Fred Hutchinson, fera la démonstration de la procédure. Dans l’après-midi ou le soir de la veille de l’expérience, commencer une pré-culture de la souche expérimentale. Inoculer trois millilitres de peptone dextrose usagé, ou un milieu sélectif approprié, avec une seule colonie de la souche, portant le facteur marqué MNase.

Incuber cette culture pendant la nuit dans un incubateur à 30 degrés Celsius. Le lendemain matin, diluez la culture de nuit dans 50 millilitres de milieu à une densité optique de 600 nanomètres de 0,2 à 0,3. Incuber la culture dans l’incubateur jusqu’à ce qu’elle atteigne une densité optique à 600 nanomètres de 0,5 à 0,7.

Préparez la quantité nécessaire de tampon A plus d’additifs et maintenez-la à température ambiante pendant la procédure. Préparer les tubes de microfuge pour le prélèvement d’échantillons. Pour chaque nouveau facteur analysé, prélever des échantillons sans ajout de calcium et ajouter 30 secondes, une minute, 2,5 minutes, 5 minutes et 10 minutes après l’ajout de calcium.

À chaque tube, ajoutez 90 microlitres de solution d’arrêt et 10 microlitres de 10 % SDS. Lorsque la culture a atteint une densité optique à 600 nanomètres de 0,5 à 0,7, décantez la culture dans un tube conique de 50 millilitres et centrifugez-la à 1 500 fois g pendant une minute à température ambiante. Retirez le surnageant, remettez soigneusement les cellules en suspension dans un millilitre de tampon A et transférez les cellules remises en suspension dans un tube de microfuge.

Granulez les cellules remises en suspension dans un microfuge à raison de 1 500 fois g pendant 30 secondes à température ambiante. Aspirez le surnageant et remettez complètement les cellules en suspension dans un millilitre de tampon A en pipetant de haut en bas. Granulez les cellules remises en suspension à 1 500 fois g pendant 30 secondes à température ambiante.

Retirez le surnageant, remettez les cellules en suspension dans un millilitre de tampon A et centrifugez-les à nouveau. Après avoir retiré le surnageant, remettez soigneusement les cellules en suspension dans 570 microlitres de tampon A. Ajoutez 30 microlitres de 2 % de digitonine pour faciliter la perméabilisation des cellules et retournez pour mélanger. Perméabiliser les cellules dans un bloc de chaleur à 30 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Pipetez la réaction de haut en bas pour assurer une répartition uniforme des cellules. En tant que témoin négatif, transférez 100 microlitres d’aliquote de cellules perméabilisées dans un tube de microfuge contenant une solution d’arrêt et un SDS, et agitez brièvement le vortex pour mélanger. Avant de commencer le cours temporel, il est essentiel d’avoir les tubes de solution d’arrêt, la pipette, les pointes de pipette et une minuterie à côté des blocs de chaleur afin que les premiers points temporels puissent être collectés efficacement.

Pour commencer le cours chronologique, ajoutez 1,1 microlitre de chlorure de calcium à une molaire aux cellules perméabilisées pour activer la MNase, et retournez plusieurs fois rapidement pour mélanger. Rétablissez immédiatement la réaction mixte à 30 degrés Celsius et démarrez une minuterie. À chaque point temporel à collecter, pipetez la réaction de haut en bas pour assurer une distribution uniforme des cellules, puis prélevez une aliquote de 100 microlitres de cellules perméabilisées dans un tube de microfuge contenant une solution d’arrêt et une SDS.

Vortex brièvement pour mélanger. Une fois que tous les points temporels ont été collectés, ajoutez quatre microlitres de 20 milligrammes par millilitre de protéinase K à chaque échantillon. Agitez brièvement pour mélanger et incubez à 55 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ajoutez 200 microlitres d’alcool phénol :chloroforme :isoamylique à chaque échantillon, agitez vigoureusement pour mélanger et centrifugez à vitesse maximale pendant cinq minutes à température ambiante. Retirer la phase aqueuse dans un nouveau tube. Ajoutez 30 microgrammes de glycogène et 500 millilitres d’éthanol à 100 %.

Agitez vigoureusement pour mélanger et précipitez sur de la glace sèche pendant 10 minutes, ou jusqu’à ce que la solution soit visqueuse. Granulez l’ADN précipité en le centrifugeant à vitesse maximale et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Décantez le surnageant et lavez chaque granulé avec un millilitre d’éthanol à température ambiante à 70 %.

Décantez l’éthanol et retirez le reste en l’inversant et en tapotant doucement les tubes sur une serviette en papier. Faites tourner brièvement les échantillons à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse, puis utilisez une pipette pour éliminer l’ehtanol résiduel, en prenant soin de ne pas déranger la pastille. Faites sécher les granulés à l’air libre à température ambiante pendant cinq minutes.

Pendant que les granulés d’ADN sèchent, faites un mélange maître de tampon Tris et de RNase A pour remettre les granulés en suspension une fois qu’ils sont secs, et vortex pour mélanger. Ajoutez 30 microlitres de solution de RNase A à chaque pastille d’ADN séchée, vortex pour mélanger et incubez à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes pour digérer l’ARNa. Après 20 minutes, mélangez un microlitre de colorant de charge d’ADN 6X avec cinq microlitres de chaque échantillon, et utilisez un gel d’agarose à 1,5 % à 120 volts pendant 40 minutes.

Commencez la procédure de sélection de la taille en ajoutant à chaque échantillon, 75 microlitres de billes SPRI dans une solution de polyéthylène glycol. Pipetez de haut en bas 10 fois pour mélanger les billes et le mélange d’ADN, puis incubez à température ambiante pendant cinq minutes. Pendant l’incubation des billes SPRI, préparez des tubes de microfuge contenant 96 microlitres de Tris pH 8,0 millimolaires et quatre microlitres de chlorure de sodium à cinq molaires pour chaque échantillon.

Placez les tubes contenant les billes et le mélange d’ADN dans un support magnétique pendant deux minutes pour recueillir les billes sur le côté du tube, puis transférez chaque surnageant dans un nouveau tube contenant du Tris et du chlorure de sodium. Ajoutez 200 microlitres d’alcool phénol :chloroforme :isoamylique à chaque échantillon, vortex à mélanger et centrifugez à vitesse maximale à température ambiante pendant cinq minutes. Retirez chaque phase aqueuse dans un nouveau tube, ajoutez 30 microgrammes de glycogène et 500 microlitres d’éthanol à 100 %.

Faites précipiter l’ADN sur de la glace sèche pendant 10 minutes, ou jusqu’à ce que la solution soit visqueuse. Granulez l’ADN précipité en le centrifugant à vitesse maximale et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Décantez le surnageant et lavez chaque granulé avec un millilitre d’éthanol à 70 %.

Décantez l’éthanol en retirant le reste en inversant et en tapotant doucement les tubes sur une serviette en papier. Faites tourner brièvement les échantillons à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse et utilisez une pipette pour éliminer l’éthanol résiduel, en prenant soin de ne pas déranger la pastille. Faites sécher les granulés à l’air libre à température ambiante pendant cinq minutes.

Remettre en suspension chaque granulé séché dans 25 microlitres de Tris pH 8. Déterminez la concentration de chaque échantillon à l’aide d’un test à haute sensibilité. L’électrophorèse sur gel d’agarose de l’ADN à partir d’une analyse de clivage endogène de la chromatine de Reb1, un facteur de régulation général qui se lie aux régions appauvries en nucléosomes, révèle une augmentation dépendante du calcium de la fragmentation de l’ADN au fil du temps, comme l’indique le maculage et la digestion complète de l’ADN génomique.

La visualisation des extrémités de fragments d’une expérience de séquençage du clivage endogène de la chromatine Reb1 révèle un enrichissement robuste de Reb1 sur le fond, dérivé de la souche libre MNase après 30 secondes de traitement au calcium. De même, un clivage substantiel de l’ADN a été observé par une fusion de la sous-unité médiatrice Med8 avec la MNase, mais pas de la MNase libre induite par le promoteur Med8 une minute après l’ajout de calcium. Pour comparer les données de séquençage du clivage endogène de la chromatine Reb1 aux données d’immunoprécipitation de la chromatine et de séquençage à haut débit, 1 992 pics Reb1 déterminés par la méthode organique ont été centrés sur le motif, et le nombre moyen de fragments à chaque position de base dans une fenêtre de 100 paires de bases autour du point médian du motif a été déterminé.

Une asymétrie et un clivage frappants ont été observés, la majorité des extrémités des fragments libérés par Reb1-MNase se connectant au côté amont du motif. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une journée de travail complète, si elle fonctionne correctement. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier de limiter le nombre d’échantillons analysés en parallèle, afin de garantir des temps de pipetage et de manipulation précis.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la transcription pour, pour la première fois, caractériser sans ambiguïté l’association génomique d’un complexe protéique de la taille d’un mégadalton dans la levure. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon d’effectuer la méthode ChEC-Seq pour la cartographie à l’échelle du génome des sites de liaison aux protéines dans le génome de la levure en bourgeonnement.