Évaluations neurocomportementales dans un modèle murin de lésion cérébrale hypoxique-ischémique néonatale

L'objectif général de la chirurgie de lésion cérébrale hypoxique-ischémique néonatale, suivie de tests cognitifs et moteurs, est d'obtenir un modèle murin permettant d'étudier ces lésions et les dommages cérébraux associés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant les lésions cérébrales hypoxiques-ischémiques néonatales, notamment la manière dont ces lésions affectent les fonctions motrices et cognitives. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est bien établie et couramment utilisée.

Il s'agit également d'un modèle préclinique de la paralysie cérébrale et des accidents vasculaires cérébraux néonatals. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car l'artère carotide droite unilatérale est difficile à identifier. Yoon-Kyum Shin, étudiant diplômé de notre laboratoire, m'accompagnera pour la démonstration de la procédure.

Après avoir anesthésié au moins cinq souriceaux âgés de sept jours, placer un souriceau sous un microscope stéréo avec l'abdomen vers le haut. Ensuite, nettoyer le cou avec de l'alcool. Pour commencer la chirurgie, utiliser des ciseaux pour pratiquer une incision de 0,7 millimètre au niveau du cou.

Ensuite, retirez soigneusement le tissu adipeux à l’aide de pinces jusqu’à ce que l’artère carotide droite unilatérale soit exposée. Puis, à l’aide d’un fil 5-0, ligaturez l’artère carotide droite unilatérale. Fermez maintenant l’incision du cou avec du nylon 5-0 et stérilisez l’incision.

Ensuite, laissez le petit se rétablir dans une enceinte hypoxique à 37 degrés Celsius avec le couvercle ouvert pendant environ une heure. Placez une autre souris ayant subi une manipulation chirurgicale dans l'enceinte hypoxique pour qu'elle se rétablisse. Une fois que tous les petits sont complètement réveillés, fermez le couvercle de l'enceinte et réduisez les niveaux de gaz afin d'établir des conditions d'hypoxie.

Après 90 minutes d'hypoxie, remettez les petits présentant une lésion cérébrale dans leurs cages. Une semaine plus tard, préparez les petits pour la chirurgie, comme précédemment, afin de rechercher des signes de la lésion. Pratiquez une incision dans le cuir chevelu afin d'identifier la lésion cérébrale dans la région postérolatérale de l'hémisphère droit.

Examine le crâne semi-transparent à la recherche de signes de lésions corticales et de lésions hippocampiques. Ainsi, catégorise les petits comme étant blessés ou témoins non blessés. Après vérification, referme le cuir chevelu à l’aide de points de suture et stérilise l’incision.

Lorsque les souris ont six semaines, évaluez leur mémoire en fonction de l'apprentissage et de l'évitement d'un stimulus aversif. Utilisez un appareil commercial de type deux compartiments avec accès par marchepied pour le test d'évitement passif. Pour commencer, placez une souris dans le compartiment éclairé de la boîte pendant 30 secondes.

Ensuite, ouvrez la porte entre les compartiments et enregistrez la latence de l'animal à entrer dans le compartiment sombre. Accordez jusqu'à 300 secondes pour effectuer la tâche. Lorsque les quatre membres de la souris sont complètement à l'intérieur du compartiment sombre, fermez la porte.

Ensuite, appliquez une décharge électrique de 1/2 milliampère pendant deux secondes aux pattes postérieures de la souris, puis replacez-la dans sa cage. Vingt-quatre heures plus tard, répétez le test. Cette fois, laissez la souris disposer de 300 secondes complètes pour passer dans la chambre sombre, et n'administrez aucune décharge électrique.

Réalisez le test de marche sur échelle chez des souris âgées de six semaines afin de distinguer des troubles subtils de la fonction motrice, en utilisant des analyses à la fois qualitatives et quantitatives. Installez d'abord le dispositif en échelle, puis positionnez une caméra vidéo pour enregistrer les mouvements des membres d'une souris sur le dispositif. Ensuite, placez une souris sur le panneau de départ et commencez l'enregistrement avec la caméra vidéo.

S'assurer que la vidéo montre les pattes avec une bonne netteté. Lorsque la souris touche le dernier panneau de l'appareil en forme d'échelle, arrêter l'enregistrement. Ensuite, replacer la souris sur le panneau de départ et enregistrer à nouveau la traversée de l'appareil par la souris.

Effectuez cela un total de quatre fois par souris à chaque date d'essai. Par la suite, lors de l'analyse de la vidéo, comptez manuellement le nombre de glissades effectuées par chaque membre en lisant la vidéo à une vitesse de 1/10. Lorsqu'un membre glisse entre les barreaux, cela constitue une glissade.

Lorsque les souris ont six semaines, évaluez leur force de préhension. Utilisez un dynamomètre de traction/poussée équipé d'un fil triangulaire de deux millimètres de diamètre, le tout fixé sur un panneau. Placez la souris sur le panneau en la tenant par la queue.

Ensuite, laissez la souris atteindre simplement le fil métallique avec ses membres antérieurs. Dès que la souris saisit le fil, tirez doucement sur sa queue jusqu'à ce qu'elle lâche prise. L'appareil enregistre la force maximale exercée sur le fil en grammes.

Répétez ce test cinq fois avant de laisser la souris se reposer. Pendant le test de force de préhension, des mouvements caractéristiques de performances précises sont observables. Essayez de repérer ces mouvements au cours des cinq tentatives avant de laisser la souris au repos pendant au moins une minute afin de réduire sa fatigue musculaire.

Après avoir laissé la souris se reposer pendant au moins une minute, répétez à nouveau la série de cinq essais. Ensuite, accordez une autre pause à la souris et effectuez la série une dernière fois pour cette journée de test. À partir des données, utilisez la moyenne des trois meilleurs scores pour l'une des pattes antérieures ou pour les deux pattes antérieures afin de procéder à l'analyse.

Après avoir prélevé les cerveaux d'animaux âgés de 14 semaines ayant subi une lésion par hypoxie-ischémie, les cerveaux ont été évalués morphologiquement selon qu'ils présentaient aucune lésion corticale, une lésion légère ou une lésion sévère. Les mêmes animaux avaient été scannés par IRM une semaine plus tôt, ce qui s'était également révélé très informatif. Même le cerveau morphologiquement normal présentait une lésion légère dans l'hippocampe.

À l'âge de six semaines, soit cinq semaines après la lésion, les souris ont été évaluées à l'aide de diverses tâches comportementales. Les souris ayant subi une lésion par hypoxie-ischémie présentaient un déficit cognitif lors de la tâche d'évitement passif à 24 heures. Comme seul l'hémisphère droit était endommagé, les souris présentaient des troubles moteurs hémiparétiques.

Cela a été révélé par la différence dans le pourcentage de glissades sur les barreaux transversaux de l'échelle pour chaque membre antérieur. De plus, puisque la force de préhension implique le cortex moteur du cerveau, les groupes témoin normal et lésion corticale ont montré des différences en puissance de préhension. Aucune différence n'a été observée entre les témoins normaux et les souris non lésées, mais les souris lésées étaient clairement déficientes.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment ligaturer l'artère carotide droite unilatérale afin de générer des souriceaux néonatals présentant un accident ischémique-hypoxique, ainsi que comment réaliser une analyse comportementale de suivi. Il est important de noter que même en l'absence de lésion visible sur le cortex cérébral sept jours après la lésion, une IRM peut révéler une atteinte hippocampique. De plus, il est essentiel de manipuler les souriceaux avec douceur et de réaliser la chirurgie le plus rapidement possible.

Les petits ont une peau très fine et fragile, faites donc très attention.