Une méthode d’isolement roman de Grade clinique pour les cellules stromales de rein humain périvasculaires

L'objectif général de cette méthode d'isolement de qualité clinique est d'isoler des cellules stromales périvasculaires rénales humaines, ou kPSC, pour le traitement thérapeutique cellulaire de diverses maladies rénales. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la médecine régénérative, telles que l'adéquation des kPSC humaines pour la thérapie cellulaire rénale et la transplantation. Les principaux avantages de cette technique sont qu'elle est clinique et qu'elle permet de générer un nombre suffisant de kPSC à des fins de thérapie cellulaire.

Ellen Lievers, une technicienne de notre laboratoire, démontrera le test fonctionnel des kPSCs. Avant de commencer la procédure d'isolement des cellules rénales, reliez un plateau de perfusion stérilisé à un bain-marie en position verticale. Une fois que le plateau de perfusion a été réchauffé par l'eau, placez-le en position horizontale, tout en le maintenant connecté au bain-marie, puis insérez un tube L/S 25 dans la pompe.

Placez les pinces de culture à une extrémité du tube et laissez le tube reposer sur le fond du plateau. Placez une compresse stérile au-dessus du tube pour éviter tout obstruction, puis fixez un raccord luer à l'autre extrémité du tube. Ajoutez ensuite environ 100 millilitres de milieu dans le plateau et commencez à rincer le tube L/S 25 à une vitesse de pompe de 100 millilitres par minute. Pour isoler les cellules rénales, transférez le rein des sacs stériles doubles sur le plateau de perfusion stérile, puis utilisez des ciseaux et une déchirure douce pour retirer le tissu adipeux péri-rénal et la capsule rénale.

Une fois l'artère rénale localisée sur le patch aortique, utilisez la pointe accessoire pour canuler l'artère rénale, puis fixez la pointe à l'aide d'une bride stérilisée. Avec la pompe en marche, reliez l'extrémité du tube de la pompe au raccord luer. Rincez ensuite le rein avec le milieu contenu dans le plateau à un débit de 100 millilitres par minute.

Ajoutez ensuite 20 millilitres de collagénase et 2,5 millilitres de DNAsé dans le plateau de perfusion, et laissez les enzymes digérer le rein, en retournant doucement l'organe de temps en temps à la main jusqu'à ce qu'il devienne mou et que le liquide de perfusion commence à devenir trouble. La durée de la digestion par la collagénase est critique : une durée trop courte entraînera des agrégats cellulaires, tandis qu'une durée trop longue provoquera la mort cellulaire. À la fin de la perfusion enzymatique, massez doucement le rein jusqu'à obtention d'une suspension cellulaire, puis retirez les matières non digérées et l'embout.

Ajoutez 50 millilitres de sérum humain normal à la suspension cellulaire, puis, avec la pompe à faible débit, placez le tube raccordé au rein au-dessus de plusieurs tubes de collecte de 50 millilitres afin de permettre à la suspension cellulaire de s'écouler du plateau de perfusion vers les tubes de collecte. Une fois toutes les cellules recueillies, centrifugez les suspensions cellulaires et lavez les culots deux fois avec le milieu de lavage, enrichi de 10 % de sérum humain normal. Après le deuxième lavage, resuspendez les culots dans un volume égal de milieu de culture cellulaire par rapport au volume des culots cellulaires.

Pour cultiver les cellules rénales brutes, ajoutez environ un millilitre de suspension cellulaire à 24 millilitres de milieu de culture cellulaire alpha-MEM contenant 5 % de lysat plaquettaire par flacon de culture cellulaire T 175, puis incubez les flacons à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après deux jours, retirez le surnageant et les débris cellulaires, puis nourrissez les cellules avec 25 millilitres de milieu de culture cellulaire frais. Lorsque les cellules sont confluentes, isolez la fraction positive pour NG2 par séparation magnétique des cellules, selon les protocoles standard.

Ensuite, ensemencer quatre fois 10 à la puissance trois cellules NG2 positives par centimètre carré dans un flacon de culture cellulaire de taille appropriée, puis placer le flacon dans l'incubateur de culture cellulaire. Lorsque les cellules atteignent une confluence de 90 à 100 %, recueillir le surnageant et laver les cellules adhérentes deux fois dans du PBS. Détacher les cellules avec le volume approprié de trypsine selon la taille du flacon, puis arrêter la réaction avec le surnageant réservé après cinq minutes.

Resuspendre délicatement les cellules, puis transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de taille appropriée pour la centrifugation, et resemencer les cellules à une densité de quatre fois dix puissance trois cellules par centimètre carré. Parfois, après l'enrichissement en NG2, les cellules cessent de proliférer ou commencent à croître sous forme de structures tridimensionnelles. Ce problème peut être résolu en trypsinisant les cellules et en les resemant.

Après quatre à cinq passages, ensemencer les kPSC dans une plaque à six puits à raison de deux fois 10 à la puissance cinq cellules par deux millilitres de milieu par puits, et ensemencer cinq fois 10 à la puissance cinq cellules épithéliales tubulaires proximales dans deux millilitres de milieu pour cellules épithéliales tubulaires proximales par puits dans une plaque à six puits séparée. Placer les deux plaques dans l'incubateur de culture cellulaire pendant 48 heures, puis récolter le surnageant des kPSC à la fin de l'incubation, retirer le surnageant des cellules épithéliales tubulaires proximales et utiliser une pipette jaune pour réaliser une estafilade dans la monocouche cellulaire au fond de chaque puits. Laver les cellules rayées avec du PBS, puis ajouter le milieu conditionné provenant des cultures de cellules stromales vasculaires rénales.

Ensuite, observer le sillon aux temps de quatre, huit, 12 et 24 heures au même emplacement marqué sur un microscope inversé en contraste de phase afin d’évaluer le pourcentage de fermeture au fil du temps. Les cellules stromales périvasculaires rénales sont des cellules adhérentes au plastique, de forme fusiforme, positives pour les marqueurs des cellules stromales et périvasculaires, et négatives pour les marqueurs CD31, CD34, CD45 et HLA-DR. Généralement, une population homogène de cellules stromales périvasculaires rénales peut être obtenue au quatrième passage, les cellules atteignant la sénescence vers le neuvième à dixième passage.

Dans cet essai représentatif de rayure de plaie, destiné à évaluer la capacité fonctionnelle des kPSC, lorsque le milieu conditionné provenant d'une culture de cellules stromales périvasculaires rénales a été ajouté, la plaie s'est refermée significativement plus rapidement que dans les puits cultivés avec le milieu témoin. Une fois la technique d'isolement primaire maîtrisée, celle-ci prendra environ deux heures ; il faudra de un à deux mois pour obtenir une population homogène de kPSC. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important d'arrêter le traitement à la collagénase dès que le rein devient mou et que les fluides deviennent moins transparents.

En complément des procédures démontrées ici, ces techniques pourraient également être utilisées pour l'isolement de cellules stromales périvasculaires provenant d'autres organes solides. Les kPSC isolées à l'aide de cette technique peuvent être utilisées pour étudier le potentiel régénératif de ces cellules dans plusieurs modèles différents de maladies rénales et de transplantation. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure d'isoler et de cultiver les kPSC de manière conforme aux normes cliniques.

N'oubliez pas que le travail avec des échantillons humains comporte un risque de transmission virale ; prenez toujours des précautions telles que le dépistage du VIH, de l'hépatite B et de l'hépatite C lors de la réalisation de cette procédure.