Induction de la différenciation cellulaire et de l'imagerie cellulaire unique Swimmer and Swarmer Cells

L’objectif global de cette méthode est d’induire la différenciation cellulaire de la bactérie Vibrio parahaemolyticus et la formation d’une population de cellules d’essaim différenciées facilement disponibles pour l’analyse de cellules uniques par microscopie à fluorescence. Cette méthode aidera les scientifiques à comprendre comment les bactéries régulent l’organisation intracellulaire au cours de la différenciation cellulaire et de la morphogenèse. Étant donné que l’imagerie des cellules au sein des communautés bactériennes peut être difficile, le principal avantage de cette technique est qu’elle produit une population de cellules d’essaim différenciées qui existent dans une seule couche cellulaire facilement disponible pour l’analyse en microscopie à cellule unique.

Les implications de cette technique s’étendent à une meilleure compréhension de la façon dont les bactéries régulent les changements dans le cycle cellulaire, la morphologie cellulaire et l’organisation intracellulaire au cours de la différenciation cellulaire. La démonstration de cette méthode est essentielle car il est difficile d’obtenir une induction fiable de la différenciation cellulaire et la formation de cellules disponibles pour l’analyse de cellules uniques. Pour préparer la solution de gélose pour la fabrication de plaques d’essaimage, suspendez quatre grammes de perfusion cardiaque, ou de poudre de gélose H.I., et 100 millilitres d’eau distillée doublement.

Faites bouillir soigneusement la solution de gélose H.I.a.agar dans un four à micro-ondes, en secouant la bouteille de temps en temps jusqu’à ce que la poudre soit dissoute. Autoclavez la solution de gélose à 121 degrés Celsius pendant 20 minutes, refroidissez la solution de gélose à 60 t0 65 degrés Celsius en agitant constamment. L’étape suivante consiste à manipuler du 2,2'Bipyridyl, qui est très toxique, de sorte que des gants et des lunettes de sécurité doivent être portés.

Ajouter du 2,2'Bipyridyl à une concentration finale de 50 micromolaires. Ajouter du chlorure de calcium à une concentration finale de quatre millamolaires. Inoculez une petite quantité de cellules de V. parahaemolyticus du bord d’une seule colonie dans 5 millilitres de bouillon LB.

Incuber la culture à 37 degrés Celsius dans un incubateur à agitateur jusqu’à ce qu’elle atteigne une densité optique à 600 nanomètres de 0,8. Cela prend généralement environ deux à trois heures. Pendant que la culture cellulaire se développe, pipetez 30 à 35 millilitres de la solution finale de gélose H.I. dans une boîte de Pétri ronde de 150 millimètres, et laissez la gélose se solidifier.

Juste avant de repérer la culture cellulaire, séchez la plaque de gélose à la verticale avec un couvercle ouvert à 37 degrés Celsius pendant au moins 10 minutes, ou jusqu’à ce que tout résidu liquide ait disparu, mais pas plus. Repérez un microlitre de culture cellulaire au centre de la plaque d’essaimage H.I.agar et laissez sécher la tache. Scellez la plaque avec du ruban adhésif en plastique transparent, en prenant soin d’éviter la formation de bulles d’air et les plis sur le ruban.

Incuber l’assiette à 24 degrés Celsius pendant la nuit. Cela se traduira par la formation d’une colonie d’essaim de V. Parahaemolyticus avec des éruptions d’essaim s’étendant du centre de la colonie, comme le montre ce clip vidéo en accéléré. La première étape de cette procédure consiste à préparer des lames d’agarose pour la microscopie.

Ajoutez un gramme d’agarose à 100 millilitres d’une solution de bouillon à 20 % PBS et à 10 % LB. Faites bouillir soigneusement la solution au micro-ondes pour dissoudre l’agarose, puis laissez-la refroidir à 65 à 70 degrés Celsius tout en mélangeant avec un agitateur magnétique. Placez une lame de microscope propre sur une section parfaitement plane d’un établi.

Fixez la lame à la paillasse en recouvrant les deux extrémités de la lame avec deux couches de ruban d’étiquetage de laboratoire à usage général. La distance entre les deux morceaux de ruban adhésif doit être d’environ trois centimètres. Pipeter environ 250 microlitres de la solution d’agarose préalablement préparée sur la surface en verre non couverte.

Placez une deuxième lame de microscope dans la même orientation que la lame inférieure sur le dessus et appuyez légèrement pour que l’agarose résiduelle puisse s’écouler sur les côtés. Laissez l’agarose se solidifier pendant une à deux minutes. À l’aide d’un scalpel, coupez toute agarose résiduelle qui est attachée aux côtés de la lame de microscope.

Lorsque l’agarose s’est solidifiée, retirez lentement la glissière supérieure en verre de la glissière inférieure dans un mouvement horizontal. Retirez lentement le ruban adhésif des extrémités de la lame de microscope. La lame d’agarose doit être utilisée dès que possible, car elle commencera lentement à se dessécher.

Immédiatement avant le transfert des cellules de l’essaim sur la lame du microscope, utilisez un scalpel pour couper le ruban plastique de la plaque de l’essaim préalablement préparée. Lors de l’excision de la gélose en essaim, il est important de diriger la coupe de l’extérieur vers l’intérieur de la colonie en essaim pour éviter de contaminer les éruptions d’essaimage avec des cellules provenant du milieu de la colonie. À l’aide d’un scalpel frais, découpez un morceau de gélose en essaim de trois millimètres sur 10 millimètres du bord le plus extérieur d’une colonie en essaim, en vous assurant de diriger les coupes de l’extérieur du bord de la colonie en essaim vers l’intérieur de la colonie.

Transférez le morceau de gélose d’essaimage sur la lame d’agarose du microscope avec les cellules faisant face au tampon d’agarose pour imprimer les cellules d’essaimage sur le tampon d’agarose. Après avoir attendu environ 30 secondes, retirez délicatement le morceau de gélose du tampon d’agarose. Placez une lamelle en verre sur le tampon d’agarose où les cellules ont été imprimées.

Les cellules sont maintenant prêtes pour la microscopie à fluorescence. L’imagerie stéréo-microscopique d’une colonie d’essaim de V. parahaemolyticus à grossissement croissant montre des éruptions d’essaim s’étendant de la périphérie de la colonie d’essaim. Les cellules des éruptions sont regroupées en mono ou bicouches uniquement, tandis que les cellules au milieu de la colonie d’essaim sont empilées en plusieurs couches.

L’imagerie par microscopie DIC a révélé que les éruptions ne consistent qu’en une population entièrement différenciée de cellules d’essaim, tandis que les cellules du milieu de la colonie d’essaim sont nettement plus courtes et représentent probablement un mélange de cellules nageuses et d’essaim. Comme preuve de principe, l’imagerie par microscopie DIC et fluorescence a été réalisée sur des cellules nageuses et essaimeuses de V. Parahaemolyticus de type sauvage, exprimant de manière ectopique une protéine essentielle de chimiotaxie, YFP-CheW. Dans les cellules nageuses, YFP-CheW se localise de manière unipolaire et bipolaire, mais dans les cellules plus essaimeuses, YFP-CheW est toujours localisé bipolairement et forme également des grappes positionnées de manière aléatoire sur la longueur de la cellule.

Des changements dans le modèle de localisation de YFP-CheW au cours de la différenciation des cellules du nageur à l’essaim ont également été mis en évidence par des affichages de la distribution des foyers et des analyses démographiques des profils d’intensité de fluorescence. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie des cellules microbiennes pour explorer comment la bactérie Vibrio parahaemolyticus régule son organisation interne au cours de ses états différenciés distincts de cellules nageuses et d’essaim. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’induire la différenciation cellulaire de la bactérie Vibrio parahaemolyticus et comment préparer une population de cellules d’essaim différenciées pour l’analyse de cellules uniques par microscopie à fluorescence.

N’oubliez pas que Vibrio parahaemolyticus est un agent pathogène humain et que des procédures et réglementations appropriées sur la façon de gérer les agents pathogènes BSL 2 dans votre région doivent être appliquées.