Name: Examen échocardiographique et histologique de morphologie cardiaque chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Découvrez une méthode économique d'échocardiographie et d'analyse histologique pour évaluer la morphologie cardiaque chez la souris. Ce protocole permet d'étudier la fonction cardiaque dans divers modèles transgéniques.

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Le travaux ont été subventionnés par le gouvernement Français (Agence nationale de la recherche, ANR) grâce au programme « Investissements pour l’avenir » LABEX SIGNALIFE (référence ANR-11-LABX-0028-01) et de grâce à des subventions et K. d. W. de l’Association pour la Recherche sur le Cancer, Fondation de France et le Plan Cancer Inserm. D. B. et V. a. reçu des bourses de la Fondation pour la Recherche Médicale et de la ville de Nice, respectivement. Les échographies cardiaques et le capteur ont été gracieusement fournies par Philips. Nous remercions A. Borderie, S. Destrée, M. Cutajar-Bossert, A. Landouar, Martres A., A. Biancardini et S. M. Wagner pour leur aide technique qualifié.

les expériences décrites ici ont été effectuées en conformité avec les lois pertinentes bien-être animal institutionnels et Français, lignes directrices et politiques. Ils ont été approuvés par le Comité d’éthique Français (Comité Institutionnel d &#39; l Ethique Pour &#39; Animal de Laboratoire ; numéro RCE/2012-106).
 1. échocardiographie <ol><li>déterminer le poids du corps de la souris à l’aide d’une balance de laboratoire standard en le tenant par la queue légèrement pour assurer un positionnement correct.</li>
	<li>Anesthésier l’animal par l’injection intrapéritonéale (i.p.) de 50 mg/kg pentobarbital 25 , 26. 
	NOTE : Tout autre type d’anesthésie peut être utilisé si le même protocole est utilisé tout au long de l’étude. Avantages et inconvénients seront analysés ci-dessous.</li>
	<li>Remettre la souris dans sa propre cage et attendre jusqu'à ce qu’il ne répond pas, il montre une respiration régulière, et les réflexes du pied arrière sont absents. Pour tester ceci, presser un pied légèrement et observer si la jambe se rétracte toujours.</li>
	<li>Raser le côté gauche du thorax et de l’aisselle gauche à l’aide d’un rasoir commercial de rodent. 
	Remarque : L’utilisation d’un rasoir rongeur dédié permet l’élimination complète des poils de souris fine pour éviter toute interférence dans l’évaluation échocardiographique. Crèmes dépilatoires commerciales ou des solutions il faut éviter, car ils sont généralement parfumées, qui perturberont l’animal après qu’il se réveille. Éviter le rasage excessive, car cela augmente la perte de chaleur.</li>
	<li>Mettre l’animal dormant sur une dalle chaude située à 40-42 ° C en position côté gauche peu profonde, avec la tête à 12 o &#39; horloge et la queue à 6 o &#39; horloge. Fixer le bras gauche, jambe gauche et la queue avec du ruban.</li>
	<li>Appliquer préchauffée échocardiographie gel sur la poitrine rasée et la tête du capteur de.</li>
	<li>Place le transducteur parasternale gauche, orientez vers le côté droit du cou pour obtenir une vue d’axe à deux dimensions (2D) parasternale au niveau du muscle papillaire. Tourner le transducteur de 90° vers la droite pour obtenir une vue d’axe court au niveau du muscle papilary. Utiliser un réglage de profondeur minimale et un zoom pour maximiser la qualité et la cadence image. Régler la vitesse de balayage au maximum.
	<ol><li>Pour obtenir ces paramètres, le zoom différents et la définition des options de profondeur peut-être être utilisé, selon la machine et les logiciels. Images de mode M Records guidage 2D en court axe voir 27. Reportez-vous à la Figure 1 a et B 27. 
		Remarque : prendre soin de ne pas appliquer une pression excessive sur la poitrine, car cela peut entraîner une bradycardie.</li>
	</ol></li> <li>Série record au moins 3 de 3 boucles de cine battement de coeur pour chaque animal. 
	Remarque : Pour le logiciel d’un échocardiographe utilisé dans cette étude, appuyez sur la &#34; Acquire/Save &#34; bouton une seule fois. Cette méthodologie est spécifique pour les échographies cardiaques avec ce logiciel particulier. Autres logiciels peuvent être utilisés avec des machines différentes.</li>
	<li>Après le gel de bons enregistrements, essuyer l’échocardiographie du thorax de la souris, coussin chauffant et transducteur. Retirer le ruban de membres et queue.</li>
	<li>Laissez la souris sous observation sur le coussin chauffant, recouvert de tissu afin d’éviter d’inutiles exposition et chaleur perte de lumière, jusqu'à ce qu’il réveille vers le haut</li>
	<li>Remettre l’animal dans sa cage.</li>
	<li>Analyse des images de mode M vue court-axe parasternale pour déterminer la fonction et les dimensions ventriculaires gauches de (LV) enregistrées. Mesurer l’épaisseur de la paroi antérieure de LV en systole et diastole (LVAWs et LVAWd), les LV télésystoliques et télédiastoliques diamètres internes (LVIDs et LVIDd) et l’épaisseur de paroi postérieure de LV (LVPW) dans la systole et la diastole (LVPWs et LVPWd) en utilisant le identification de l’interface sang-tissus sur les images stockées.</li>
	<li>Mesurer les dimensions diastoliques au moment de l’apparentes dimensions diastoliques maximales de LV et LV télésystolique dimensions lors de l’excursion systolique plus antérieure de la paroi postérieure de la LV. Touchez l’écran tactile sur le &#34; Analyze &#34; icône et ensuite sur la &#34; LVAWd &#34; icône. Positionner le pied à coulisse électronique sur l’interface entre la cavité ventriculaire droite et de la paroi antérieure de LV en diastole.</li>
	<li>Placer le pied à coulisse électronique sur l’interface entre la paroi antérieure du LV et la cavité de LV pour obtenir l’épaisseur de paroi antérieure diastolique LV ; le logiciel passera directement à la fin de diastole mesure interne du LV.</li>
	<li>Placer l’étrier sur l’interface entre la cavité de LV et la paroi postérieure du LV pour obtenir le diamètre télédiastolique interne LV ; le logiciel basculera sur la mesure d’épaisseur de paroi postérieure LV.</li>
	<li>Placer l’étrier sur l’interface entre la paroi postérieure de la LV et le péricarde pour obtenir l’épaisseur de paroi postérieure diastolique LV. Pour les dimensions systoliques LV, touchez l’écran tactile sur le &#34; LVAWs &#34; icône et position le pied à coulisse électronique sur l’interface entre la cavité ventriculaire droite et de la paroi antérieure de LV en systole.</li>
	<li>Placer le pied à coulisse électronique sur l’interface entre la paroi antérieure du LV et la cavité de LV pour obtenir l’épaisseur de paroi antérieure systolique LV. Répétez le processus tel que décrit ci-dessus pour le diamètre télésystolique interne LV et l’épaisseur de paroi postérieure systolique LV. Utiliser la pointe convention adoptée par l’American Society of Echocardiography pour tracer les frontières endocardiques et épicardique 13 , 27. 
	NOTE : Paramètres de la fonction contractile LV seront automatiquement calculées à l’aide de mesures antérieures. La fraction de raccourcissement (FS) LV est défini comme FS (%) = [(LVIDd-LVIDs)/LVIDd] x 100. La fraction d’éjection de LV (EF) est calculée avec la formule modifiée de Teicholz, où Fe (%) = [(LVIDd3-LVIDs3)/LVIDd 3] x 100 12. Se référer à la Figure 1 a et B.</li>
	<li>Stocker les données sur les disques compacts ou les clés USB et de faire des copies de sauvegarde.</li>
	<li>Import, analyser et exporter les données en utilisant le logiciel approprié. 
	Remarque : Après ces mesures de référence, l’expérience peut être suspendue. Si vous effectuez une comparaison directe entre animaux knock-out et de type sauvage, procéder à des analyses histologiques 6. Pour Cre-ERT2 ; lignées de souris LOX/lox, continuer le lendemain avec induction de tamoxifène par injection intrapéritonéale, décrit 5 ,, 24. Si l’induction expérimentale de l’infarctus du myocarde par la ligature de l’artère coronaire gauche 5 , 28, la chirurgie peut être effectuée directement après les mesures échocardiographiques, quand les souris sont sous anesthésie. Dans le cas contraire, un délai minimum d’une semaine entre deux tours de l’anesthésie devrait être maintenu afin de limiter le taux de létalité post-opératoire.</li>
</ol> 2. Préparation des échantillons de coeur pour une évaluation histologique <ol><li>sacrifier les animaux par dislocation cervicale. Mesurer leurs poids corporel. Désinfecter la poitrine et l’abdomen à l’aide d’un tampon imbibé d’alcool 70 %.</li>
	<li>Faire une incision transversale dans la peau 1 cm distal au sternum. Avec une pincette émoussé, retirer la peau du thorax, se déplaçant dans la direction de la tête. Maintenez le sternum légèrement avec une pince fine et ouvrir le diaphragme en insérant l’extrémité arrondie de ciseaux fines.</li>
	<li>Couper la cage thoracique sur les deux côtés parallèles au sternum. Déplacez le sternum en direction de la tête. Localiser le coeur dans le thorax. Tenez le tronc vasculaire du cœur avec la pince fine et coupe ci-dessous à l’aide des ciseaux.</li>
	<li>Ouvrir le coffre et le coeur entier hors de la cage thoracique de l’accise, mesurer le poids du cœur et d’établir un cœur-à-corps poids ratio 4 , 5 , 6 , 23 , 29 , 30 
	<li>Fix coeur dans 2 mL de solution de 10 % de formol tamponné neutre dans des tubes de 15 mL durant la nuit à 4 ° C. 
	ATTENTION : Danger ! Travail avec des solutions de formol doit être effectué sous une hotte chimique ; porter des gants et des lunettes de sécurité. 
	Remarque : Étant donné que la composition du tampon pour les solutions de formol varie avec les différents fournisseurs, utilisez le même fournisseur tout au long de l’étude.</li>
	<li>Le lendemain, découper les cœurs dans le plan transversal, au milieu et transférez-les dans cassettes pour l’enrobage de paraffine, qui est effectuée dans le laboratoire de pathologie à l’aide d’un appareil automatisé encastrement.</li>
	<li>Effectuer sectionnement.
	<ol><li>Paraffine section bloque sur une épaisseur de 3 µm à l’aide d’un microtome et flotteur contenant l’eau distillée de bain dans une eau à 40 ° C.</li>
		<li>Transférer les sections sur les diapositives. Laisser les lames sécher jusqu’au lendemain dans un incubateur à 37 ° C et les stocker à 4 ° C jusqu’au prêt à l’emploi. 
		Remarque : Le protocole peut être suspendu ici jusqu'à ce que l’utilisateur est prête pour la coloration (étape 3).</li>
	</ol></li> <li>Deparaffinize et réhydrater le tissu glisse.
	<ol><li>Déposer les lames dans la coloration des pots avec des insertions de verre dans un four à 55 ° C pendant 10 min faire fondre de la paraffine.</li>
		<li>Déparaffiner les diapositives de deux changements de 200 mL de xylène ou substitut du xylène de 5 min chacun. 
		ATTENTION : Très inflammable et toxique ! Travailler sous une hotte chimique ; porter des gants et des lunettes de sécurité.</li>
		<li>Transférer les lames à 200 mL d’alcool à 100 %. Apporter deux modifications pendant 3 min chaque et transférer une fois par le biais de 200 mL d’alcool à 95 % pour 3 min. 
		ATTENTION : Inflammable ! Tenir à l’écart des sources d’inflammation ; ne pas fumer.</li>
		<li>Rincer deux fois dans 200 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de 5 min chacun et passez à l’étape 3, 4 ou 5.</li>
	</ol></li></ol> 3. L’hématoxyline et éosine coloration <ol><li>rincer les lames avec leurs sections dans l’eau distillée.</li>
	<li>Tacher les noyaux avec solution hématoxyline pendant 8 min.</li>
	<li>Rincer à l’eau courante pendant 10 min.</li>
	<li>Tache avec la solution d’éosine pendant 2 min.</li>
	<li>Dehydrate trois fois pendant 2 min à 100 % d’éthanol (EtOH). Effacer trois fois pendant 2 min dans le xylène ou substitut du xylène. Montage sur un support de montage à base de xylène.</li>
	<li>Photographier les diapositives et mesurer le diamètre du cardiomyocyte au niveau du noyau dans des coupes longitudinales du septum interventriculaire. Mesurer au moins 100 cellules par section et trois sections par cœur.</li>
</ol> 4. WGA coloration <ol><li>Incuber les lames obtenues à l’étape 2.7 avec tétraméthylrhodamine (ou autres colorants fluorescents)-conjugué WGA (1/100 dans du PBS) pendant 60 min à température ambiante dans une chambre humide.</li>
	<li>Laver trois fois avec du PBS pour chaque 5 min.</li>
	<li>Mont avec fluorescence montage média contenant DAPI. Conserver à 4 ° C dans l’obscurité avant analyse. 
	ATTENTION : Porter des lunettes de protection et des gants résistant aux produits chimiques compatibles.</li>
	<li>Photographier les diapositives.
	<ol><li>Utiliser un microscope à fluorescence épi-illumination et filtre définit pour DAPI et tétraméthylrhodamine (voir la Table des matières). Réglez l’ouverture à la valeur maximale et la luminosité d’auto-exposition.</li>
		<li>Acquire séparer les images à un grossissement de x 400 pour les canaux rouges et bleu. Ouvrez les images dans ImageJ. Ajuster la luminosité et de contraste si nécessaire (Image &#62; Adjust &#62; luminosité/contraste).</li>
		<li>La valeur chaque image 8 bits (Image &#62; Type &#62; 8-bit). Superposer les images DAPI et WGA. Utiliser la couche bleue pour DAPI et le canal rouge pour WGA ; régler les canaux verts et gris None (Image &#62; couleur &#62; fusionner canaux) 31.</li>
	</ol></li> <li>Déterminer les diamètres de cardiomyocyte au niveau du noyau dans des sections transversales du septum interventriculaire.
	<ol><li>Définir l’échelle des images dans ImageJ. À cette fin, photographier un objet de taille connue (par exemple, une chambre hémocytomètre au même grossissement que les sections de coeur ; étape 4.4).</li>
		<li>Utiliser l’outil linéaire pour tracer une ligne du début à la fin de la structure connue (Analyze &#62; définissez échelle). 
		Remarque : La distance en pixels s’affichera automatiquement ; l’unité de longueur et de distance connue devra figurer. Aller de l’avant avec les mesures du cardiomyocyte au niveau du noyau.</li>
		<li>Tracer une ligne droite de la membrane de WGA-positifs par le noyau DAPI-positifs sur le site en face de la membrane cellulaire de WGA-positive (Analyze &#62; mesure). Dans la fenêtre de résultats, vérifiez que les valeurs de longueur ont un nombre significatif de chiffres après la virgule (Analyze &#62; définir les mesures &#62; décimales).</li>
		<li>Mesurer au moins 100 cellules par section et trois sections par cœur. Exporter les résultats vers Excel (cliquez sur résultats &#62; fichier &#62; enregistrer sous &#62; .csv) 6 , 31.</li>
	</ol></li></ol> 5. Immunomarquage PECAM-1 <ol><li>effectuer antigène démasquant.
	Tampon <ol><li>Ajouter 1 600 mL de citrate de sodium (citrate de sodium 10 mM, 0,05 % de Tween 20, pH 6,0) dans un autocuiseur. Placer la cocotte sur la plaque chauffante et tourner à pleine puissance. Ne montez pas le couvercle de la marmite à pression, à ce stade ; Posez-le simplement sur le dessus. 
		ATTENTION : Chaud !</li>
		<li>Une fois que le tampon citrate de sodium est en ébullition, transférer les lames de l’étape 2.5 dans l’autocuiseur. Fixez le couvercle de la marmite à pression. Dès que la cuisinière a atteint la pleine pression, attendre pendant 7 min. 7 min révolues, éteignez la plaque de cuisson et placez la cocotte dans un évier vide. Activer la vanne de décharge, puis exécutez l’eau froide l’auto-cuiseur. Une fois qu’il a dépressurisé, ouvrez le couvercle et faites couler l’eau froide dans le cuiseur pendant 5 min Place les diapositives dans 200 mL de PBS. 
		NOTE : Alternativement, micro-ondes antigène démasquer pourrait être utilisé, bien que le risque de surchauffe augmente.</li>
	</ol></li> <li>Emploi 0,3 % de peroxyde d’hydrogène dans le méthanol à activité peroxydasique endogène bloc pendant 5 min. Rincer les lames pour chaque 200 mL dans du PBS, trois fois pendant 2 min. 
	ATTENTION : Inflammable et toxique !</li>
	<li>Incuber les lames pendant 15 min en normal blocage du sérum dilué (5 % de sérum de chèvre normal dans du PBS) qui contient également un bloc avidine (4 gouttes dans 1 mL).</li>
	<li>Soigneusement taper le liquide provenant des sections et les incuber avec Pecam-1 anticorps de lapin, dilués 01:50 dans du PBS contenant 2,5 % de sérum de chèvre normal et 4 gouttes de bloc de biotine par mL. Incuber les lames pendant la nuit dans une chambre humide à 4 ° C.</li>
	<li>Laver les lames trois fois de 5 min chacun dans 200 mL de PBS. Incuber les sections avec biotinylé chèvre anti-lapin IgG anticorps dilué 1 : 200 en PBS contenant 2,5 % de sérum de chèvre normal pendant 1 h à température ambiante. Laver les lames trois fois de 5 min chacun dans 200 mL de PBS.</li>
	<li>Incuber tsections de He avec un système basé sur l’avidine/biotine peroxydase pendant 20 min (réactif A et réactif B doivent être combinés 30 minutes avant utilisation). Laver les lames trois fois de 5 min chacun dans 200 mL de PBS.</li>
	<li>Dissoudre 1 3,3 &#39;-diaminobenzidine (DAB) et 1 urée peroxyde d’hydrogène comprimé dans 5 mL d’eau bidistillée. Incuber les sections avec DAB solution pendant environ 3 min, soigneusement suivi de l’évolution de la couleur. Arrêter la réaction de la couleur en lavant délicatement les diapositives dans 200 mL de PBS. 
	ATTENTION : Cancérigènes ; porter des gants résistant aux produits chimiques !</li>
	<li>Contre-coloration les noyaux pendant 6 min avec l’hématoxyline. Rincer à l’eau du robinet pendant 2 min. Dehydrate trois fois pendant 2 min de chaque en cours d’exécution dans 200 mL d’alcool à 100 %. Effacer trois fois pendant 2 min chaque dans 200 mL de xylène ou un substitut de xylène. Montage sur un support de montage à base de xylène.</li>
	<li>Photographier les diapositives (au moins dix champs au grossissement x 40 le septum interventriculaire de chaque cœur) et de mesurer la densité de zone Pecam-1 à l’aide de logiciels ImageJ librement disponibles 31. Utiliser le plugin de 32 de déconvolution de couleur pour DAB et l’hématoxyline et ajuster le contraste de l’image au même niveau. 
	Remarque : dans le cas où la couleur marron et violet/bleu ont un chevauchement important spectral, qui risquent d’entraîner des difficultés avec la déconvolution de couleur, on pourrait essayer différentes marques de solution de l’hématoxyline pour obtenir une coloration nucléaire clair et bleu clair. Alternativement, immunofluorescence ou comptage manuel des capillaires pourrait être réalisée.</li>
</ol>

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<li>Ayoub, A. E., Salm, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+morphological+diversity+of+microglia+in+the+activated+hypothalamic+supraoptic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Increased morphological diversity of microglia in the activated hypothalamic supraoptic nucleus.</a> J Neurosci. 23 (21), 7759-7766 (2003).</li>
<li>Maddox, D. E., Shibata, S., Goldstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+macrophages+express+a+new+glycoprotein+receptor+reactive+with+Griffonia+simplicifolia+I-B4+isolectin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Stimulated macrophages express a new glycoprotein receptor reactive with Griffonia simplicifolia I-B4 isolectin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (1), 166-170 (1982).</li>
<li>dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+versus+venous+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Arterial versus venous endothelial cells.</a> Cell Tissue Res. 335 (1), 5-16 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Différentes méthodes ont été développées pour évaluer la structure cardiaque et la fonction chez les souris, y compris l’échocardiographie, renforcement du contraste MRI, micro CT et PET scan. En raison de son rapport coût/efficacité et simplicité, échocardiographie est la technique plus largement utilisée pour l’analyse fonctionnelle de souris11. En général, en raison de la petite taille du cœur et la haute fréquence de la fréquence cardiaque chez les souris, les transducteurs avec une fréquence ...

Il existe une grande variété de modèles de souris génétiquement modifiées, et le nombre d’études pharmacologiques chez la souris est élevée1,2. Échographie et l’IRM sont des méthodes couramment utilisées pour la caractérisation phénotypique de la fonction cardiaque et de la morphologie chez ces souris modèles3. Le protocole présenté vise à analyser la fonction cardiaque et la morphologie chez la souris adulte. Il combine échocardiographiques, histologiques et immunohistochemical des mesures. L’examen échocardiographique est employé couramment dans la souris4,5,6,7,8,9,10,11, 12. Pachon et al. 11 identifié 205 études publiées dans Circulation, Circulation Research, American Journal of Physiology - coeur et la physiologie circulatoireet Recherche cardiovasculaire entre 2012 et 2015 qui a utilisé un examen échocardiographique chez les animaux.
L’échocardiographie est utilisé pour identifier des phénotypes cardiaques chez les souris génétiquement modifiées5,6,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22, ainsi qu’analyser la fonction cardiaque chez l’hypertrophie chronique induite par la surcharge, l’ischémie myocardique et les modèles de cardiomyopathie chez la souris (évaluées à12). Équipement d’échocardiographie améliorée permet à la la mesure standard du ventricule gauche (LV) systoliques et diastoliques dimensions, Doppler tissulaire, échographie de contraste myocardique et l’évaluation de la fonction régionale de LV et réserve coronarienne 12. idéalement, l’examen échocardiographique doit être effectué chez des souris conscientes afin d’éviter les effets négatifs de l’anesthésie sur la fonction contractile, système nerveux autonome contrôle réflexe, et11la fréquence cardiaque. Néanmoins, cette approche est limitée par l’obligation de former les animaux ; difficultés à maintenir la température du corps stable ; artefacts de mouvement ; stress ; très hautes fréquences cardiaques ; et l’exigence d’au moins deux chercheurs réaliser l’expérience, en particulier si un grand nombre d’animaux est incriminés. Fait intéressant, une étude récente a indiqué aucune différence des paramètres échocardiographiques chez des animaux entraînés et inexpérimentées de19. Nous effectuons des mesures échocardiographiques chez les souris anesthésiés. Protocoles d’anesthésie différents seront discutés ci-dessous.
Bien que l’échocardiographie résolution standard (&#62; 10 MHz) est suffisante pour mesurer LV systolique et diastoliques dimensions et la fonction cardiaque chez la souris adulte, la méthode est limitée dans sa description des phénomènes structurels sous-jacents. Ainsi, nous combinons les mesures in vivo avec histologique et immunohistological analyses pour mesurer, par exemple, densité de diamètre et navire cardiomyocyte. Autres études histologiques et immunohistological, telles que la détermination de la prolifération, l’examen de l’apoptose, mesures de taille d’infarctus, détermination de la fibrose et l’expression des marqueurs spécifiques, peuvent également être effectuées sur le même type de traité des tissus mais ne font pas l’objet du présent protocole. La combinaison de in vivo l’examen échocardiographique avec analyse histologique permet de mieux comprendre supplémentaires altérations structurelles sous-jacentes. Dans une étape supplémentaire, nous pouvons compléter ces mesures par des études moléculaires et ultra-structurale. Des analyses histologiques non seulement terminer l’examen échocardiographique mais également devient indispensables lorsque la résolution de l’échocardiographie n’est pas suffisante. C’est particulièrement le cas dans les modèles de souris génétiquement modifiées qui sont embryonnaires létale23,24.

<table><tbody><tr><td>Tétraméthylrhodamine conjuguée à l’agglutinine de germe de blé (WGA)</td> Life <td>Technologies, Sondes moléculaires</td><td>W849</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre biotinylée Anti-Rabbit IgG</td><td>Anticorps Vectorlabs</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>Kit de blocage avidine/biotine</td><td>Vectorlabs</td><td>SP-2001</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxydase, Standard)</td><td>Vectorlabs</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Medium de montage avec DAPI</td><td>Vectorlabs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine</td><td>comprimés Sigma</td><td>D4168</td><td></td></tr><tr><td>Solution de peroxyde d’hydrogène</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Pecam-1 (CD31) Anticorps</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td></td></tr><tr><td>Gel de transmission d’ultrasons, Gel Aquasonic 100</td><td>Parker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonde à ultrasons linéaire, échocardiographe Philips Healthcare L15-7io</td><td></td>, microscope Philips Healthcare <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>IE33 xMATRIX</td></tr><tr><td>, Leica DMi8</td>, <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Filterset DAPI</td>, <td>Leica</td><td>11525304</td><td></td></tr><tr><td>Filterset TxR</td><td></td><td></td>, Leica 11525310 <td></td></tr> Digital <tr><td>Camera, SPOT RT3 Color Slider</td><td>Spot Logiciel d’imagerie d’imagerie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, SPOT 5.2 Logiciel avancé et de base</td><td>Ordinateur d’imagerie</td><td></td><td></td>Spot</tr><tr><td>Ciseaux</td> de précision <td>Dell</td><td></td> Outils de sciences fines 14028-10 <td></td></tr><tr><td>Grands ciseaux</td><td>Outils de sciences fines</td><td>14501-14</td><td></td></tr><tr><td>Lames de scalpel</td><td>Outils de sciences fines</td><td>10023-00</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11650-10</td><td></td></tr><tr><td>Rasoir pour rongeurs</td><td>Harvard Apparatus</td><td>34-0243</td><td></td></tr><tr><td>Cassettes pour l’enrobage de paraffine</td><td>Sakura</td><td>4155F</td><td></td></tr> neutre <tr><td>tamponné Formalin</td><td>Sakura</td><td>8727</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sakura</td><td>8733</td><td></td></tr><tr><td>Paraffine TEK III</td><td>Sakura</td><td>4511</td><td></td></tr><tr><td>appareil d’enrobage automatisé,</td> station d’enrobage de paraffine Tissue-Tek VIP <td>Sakura</td><td>6032</td><td></td></tr>, lames de microtome <tr><td>Tissue-Tek TEC 5</td><td>Sakura</td><td>5229</td><td></td></tr>, lames de <tr><td>microscopie Accu-Edge S35</td><td>Sakura</td><td>4685</td><td></td></tr><tr><td>, lamelles de protection Tissue-Tek</td><td>Sakura</td><td>9533</td><td></td></tr><tr><td>, Tissue-Tek</td><td>Sakura</td><td>9582</td><td></td></tr><tr><td>Support de montage Tissue-Tek</td><td>Sakura</td><td>1408</td><td></td></tr><tr><td>boîtes à lames</td><td>Sakura</td><td>3958</td><td></td></tr><tr><td>solution d’éosine</td><td>Sakura</td><td>8703</td><td></td></tr><tr><td>solution hématoxyline</td><td>Sakura</td><td>8711</td><td></td></tr><tr><td>microtome, RM2125RT</td><td>Leica</td><td>720-1880 (VWR)</td><td></td></tr><tr><td>bain-marie, Leica HI1210</td><td>Leica</td><td>720-0113(VWR)</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>VWR</td><td>ACRO444220050</td><td></td></tr><tr><td>tubes de 15 ml</td><td>VWR</td><td>734-0451</td><td></td></tr><tr><td>plat en verre teinté</td><td>VWR</td><td>MARI4220004</td><td></td></tr><tr><td>pots de coloration</td><td>VWR</td><td>MARI4200005</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Binder</td><td>9010-0012</td><td></td></tr><tr><td>Comprimés de peroxyde d’hydrogène DAB et urée, SIGMAFAST 3,3&prime ;-Diaminobenzidine comprimés</td><td>Sigma</td><td>D4293</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td></td></tr></tbody></table>

examen échocardiographique et histologique de morphologie cardiaque chez la souris

Echocardiographic and Histological Examination of Cardiac Morphology in the Mouse

Un nombre croissant de modèles de souris génétiquement modifiées sont apparues ces dernières années. En outre, le nombre d’études pharmacologiques réalisées chez la souris est élevé. Caractérisation phénotypique de ces modèles murins nécessite également l’examen de la fonction cardiaque et de la morphologie. L’échocardiographie et l’imagerie par résonance magnétique (IRM) sont des méthodes couramment utilisées pour caractériser la fonction cardiaque et la morphologie chez la souris. Échocardiographiques et IRM des équipements spécialisés pour utilisation dans les petits rongeurs est coûteuse et nécessite un espace dédié. Ce protocole décrit les mesures cardiaques chez des souris en utilisant un système échocardiographique clinique avec une sonde vasculaire humaine de 15 MHz. Des mesures sont effectuées sur des souris adultes anesthésiés. Au moins trois séquences d’images sont enregistrées et analysées pour chaque animal en mode M dans la vue de court-axe parasternale. Par la suite, un examen histologique cardiaque est effectué et cardiomyocyte diamètres sont déterminés sur l’hématoxyline-éosine - ou germe de blé agglutinine (WGA)-paraffine coupes colorées. Densité de navire est déterminée morphométrique après immunomarquage Pecam-1. Le protocole a été appliquées avec succès à des études pharmacologiques et différentes génétiques des modèles animaux en conditions basales, ainsi qu’après infarctus expérimental par la ligature permanente de la gauche (d’artère coronaire descendante antérieure DAL). Dans notre expérience, étude échocardiographique est limitée aux animaux anesthésiés et est réalisable chez la souris adulte pesant au moins 25 g.

Dans la Figure 1, représentant échocardiographiques enregistrements démontrent l’utilité de l’échocardiographie pour identifier des phénotypes cardiaques chez des souris génétiquement modifiées. La différence entre une souris avec une fonction cardiaque normale (Figure 1 a) et un animal avec un ventricule gauche dilaté et la fonction ventriculaire réduite (Figure 1 b) peut facilement être identifiée....

L’examen échocardiographique est fréquemment utilisée chez les souris. Appareils à ultrasons à haute résolution coûteux ont été développés à cet effet. Ce protocole décrit une procédure échocardiographique abordable combinée avec histologique morphométrique des analyses pour déterminer la morphologie cardiaque.

Examen échocardiographique et histologique de morphologie cardiaque chez la souris

An increasing number of genetically modified mouse models has become available in recent years. Moreover, the number of pharmacological studies performed ...

L'objectif général de cet examen échocardiographique combiné à des investigations histologiques est d'évaluer la fonction cardiaque et la morphologie chez différents modèles de souris transgéniques dans des conditions basales et pathophysiologiques. Pour commencer, tout en tenant légèrement une souris par la queue, utilisez une balance de laboratoire standard pour déterminer la masse corporelle de l'animal. Après avoir anesthésié la souris conformément au protocole décrit, serrez doucement une patte arrière et observez si la jambe se rétracte.Utilisez un rasoir électrique pour rongeurs afin de raser le côté gauche du thorax et l'aisselle gauche. Placez l'animal sur un tapis chauffant réglé entre 40 et 42 degrés Celsius, en position latérale gauche légèrement inclinée, la tête orientée à 12 heures et la queue à 6 heures. Fixez ensuite le bras gauche, la jambe gauche et la queue à l'aide de ruban adhésif.Appliquer du gel d'échocardiographie préalablement réchauffé sur la poitrine rasée et sur la tête du transducteur. Ensuite, placer le transducteur d'échocardiographie en position para-sternale gauche, en l'orientant vers le côté droit du cou afin d'obtenir une vue longitudinale para-sternale bidimensionnelle au niveau du muscle papillaire. Puis tourner le transducteur de 90 degrés dans le sens horaire pour obtenir une vue transversale.Établir un réglage de profondeur minimale et un zoom afin de maximiser la qualité d'image et la fréquence d'images. Régler la vitesse de balayage au maximum. Enregistrer des images en mode M guidées en 2-D selon une vue d'accès court.Enregistrez au moins trois séries de trois semi-boucles cardiaques pour chaque animal. Après avoir obtenu des enregistrements réussis, retirez le ruban adhésif des membres et de la queue. Essuyez le gel d'échocardiographie sur le thorax du souris, le coussin chauffant et le transducteur.Laisser la souris en observation sur le coussin chauffant, recouverte de tissu pour éviter une exposition inutile à la lumière et une perte de chaleur, jusqu'à son réveil. Ensuite, remettre l'animal dans sa cage. Analyser les images en mode M enregistrées en vue d'accès court pour déterminer les dimensions et la fonction du ventricule gauche ou VG.À l’aide de l’identification de l’interface tissu-sang sur les images stockées, mesurez l’épaisseur de la paroi antérieure du VG en systole et en diastole, les diamètres internes du VG en fin de systole et en fin de diastole, ainsi que l’épaisseur de la paroi postérieure du VG en systole et en diastole. Mesurez les dimensions diastoliques au moment où les dimensions diastoliques maximales apparentes du VG sont observées, et les dimensions en fin de systole du VG à la fin de l’excursion systolique la plus antérieure de la paroi postérieure du VG. Appuyez sur l’icône analyser à l’écran tactile, puis sur l’icône LVAWd.Placer le pied à coulisse électronique à l'interface entre la cavité du ventricule droit et la paroi antérieure du VG en diastole. Ensuite, placer le pied à coulisse électronique à l'interface entre la paroi antérieure du VG et la cavité du VG pour obtenir l'épaisseur diastolique de la paroi antérieure du VG. Placer le pied à coulisse à l'interface entre la cavité du VG et la paroi postérieure du VG pour obtenir le diamètre interne et diastolique du VG.Positionnez le pied à coulisse à l’interface entre la paroi postérieure du VG et le péricarde pour obtenir l’épaisseur diastolique de la paroi postérieure du VG. Pour les dimensions systoliques du VG, appuyez sur l’icône LVAWs de l’écran tactile et positionnez le pied à coulisse électronique à l’interface entre la cavité du ventricule droit et la paroi antérieure du VG en systole. Positionnez le pied à coulisse électronique à l’interface entre la paroi antérieure du VG et la cavité du VG pour obtenir l’épaisseur systolique de la paroi antérieure du VG.Positionner le pied à coulisse à l'interface entre la cavité du VG et la paroi postérieure du VG pour obtenir le diamètre interne et systolique du VG. Positionner le pied à coulisse à l'interface entre la paroi postérieure du VG et le péricarde pour obtenir l'épaisseur systolique de la paroi postérieure du VG. Après avoir sacrifié les animaux conformément au protocole décrit, mesurer leurs masses corporelles.Ensuite, utilisez un tampon d’alcool à 70 % pour désinfecter la poitrine et l’abdomen. Pratiquez une incision transversale dans la peau, à un centimètre en dessous du sternum. Puis, à l’aide de pinces contondantes, retirez la peau du thorax en vous déplaçant vers la tête.Avec des pinces fines, tenir légèrement le sternum et ouvrir le diaphragme en insérant l'extrémité émoussée de ciseaux fins. Couper la cage thoracique des deux côtés parallèlement au sternum. Ensuite, déplacer le sternum vers la tête.Localisez le cœur dans la cavité thoracique. À l’aide de pinces fines, saisissez le tronc vasculaire du cœur et utilisez des ciseaux fins pour couper sous l’organe. Ensuite, mesurez la masse cardiaque et établissez le rapport masse du cœur sur masse corporelle.Transférez le cœur dans deux millilitres de solution de formol tamponné neutre à 10 % dans un tube de 15 millilitres et fixez l'organe à quatre degrés Celsius toute la nuit. Pour effectuer la coloration par agglutinine de germe de blé (WGA), placez les lames préparées précédemment dans de la WGA conjuguée à la tétraméthylrhodamine et incubez les échantillons à température ambiante dans une chambre humide pendant soixante minutes. Utilisez du PBS pour laver les échantillons trois fois pendant cinq minutes chacune.Ensuite, utilisez un milieu de montage fluorescent contenant du DAPI pour monter les sections. Conservez-les à quatre degrés Celsius à l'abri de la lumière avant l'analyse. Ces enregistrements échocardiographiques représentatifs démontrent l'utilité de l'échocardiographie pour identifier les phénotypes cardiaques chez les souris génétiquement modifiées.La différence entre une souris présentant une fonction cardiaque normale et un animal présentant un ventricule gauche dilaté ou VG et une fonction du VG réduite peut être facilement identifiée. On montre ici une comparaison des mesures du diamètre des cardiomyocytes chez des animaux sans et avec hypertrophie cardiaque, à l’aide de coupes cardiaques en paraffine colorées à l’H&E et de mesures de sections longitudinales de tissu cardiaque. Cette figure illustre la mesure des diamètres transversaux des cardiomyocytes à l’aide de coupes en paraffine colorées au WGA provenant de cœurs de souris témoins et d’animaux présentant une hypertrophie cardiaque.Ces panneaux illustrent l'utilité de l'immunohistochimie de la PECAM1 sur des sections cardiaques pour déterminer la densité vasculaire des tissus cardiaques normaux et des cœurs présentant une angiogenèse accrue.

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L'échocardiographie transthoracique propose une méthode non invasive pour l'évaluation de la fonction cardiaque chez la souris. Une combinaison de l'échographie Doppler et les modalités d'imagerie peuvent être utilisées pour obtenir des mesures dimensionnelles du cœur et la circulation sanguine intracardiaque, qui, ensemble, fournissent une évaluation de la performance cardiaque et systolique diastolique.

L&#39;échocardiographie transthoracique chez la souris

Cette vidéo montre l'utilisation d'un rail à haute fréquence sonde échographique pour réaliser une échocardiographie d'une souris anesthésiée. Les méthodes de décrire à la fois des mesures conventionnelles à deux dimensions et en mode M de la fonction cardiaque, en plus de nouvelles, des outils plus puissants tels que le Doppler couleur, analyse des contraintes, ainsi que l'imagerie de contraste générales et ciblées.

L&#39;échocardiographie et l&#39;imagerie par ultrasons murin

Cette vidéo décrit un protocole permettant d’effectuer une échocardiographie sur une souris de laboratoire.

L’échocardiographie chez la souris : une technique non invasive pour évaluer la morphologie cardiaque

Cet article fournit un protocole pour l'évaluation échocardiographique de la taille du ventricule droit et l'hypertension pulmonaire chez la souris. Les applications comprennent la détermination du phénotype et évaluation de série en modèles transgéniques et de souris induite par la toxine de myocardiopathie et une maladie vasculaire pulmonaire.

Évaluation échocardiographique du cœur droit chez la souris

L'objectif de ce protocole est d'évaluer de manière non invasive des changements structurels et fonctionnels cardiaques dans un modèle murin de maladie cardiaque créée par constriction aortique transverse, en utilisant B et M-Mode échocardiographie et la couleur / impulsion Doppler imagerie.

Évaluation des cardiaques morphologiques et fonctionnelles changements dans le modèle de souris de Transverse Aortic Constriction par échocardiographie Imaging

Ce protocole fournit une description détaillée de l’approche échocardiographique pour le phénotypage complet du cœur et de la fonction valvulaire cardiaque chez la souris.

Approches et protocoles échocardiographiques pour Comprehensive Caractérisation phénotypique de la maladie valvulaire chez les souris

Le protocole suivant décrit la méthodologie pour l'acquisition et l'analyse des images échocardiographiques utilisées pour obtenir le volume auriculaire gauche (VBL), Aorte (Ao) de diamètre, et l'artère pulmonaire (PA) de diamètre chez la souris. Cette technique est une procédure non invasive, non-terminal qui permet l'évaluation de la fonction cardio-pulmonaire.

Murine échocardiographie de gauche Atrium, Aorte, et l&#39;artère pulmonaire

Ici, nous décrivons et comparons deux positions pour obtenir la vue apical à quatre chambres chez les souris. Ces positions permettent la quantification de la fonction ventriculaire droite, fournissent des résultats comparables, et peuvent être utilisées de façon interchangeable.

Mesure échocardiographique des paramètres diastoliques ventriculaires droits dans la souris

Dans ce protocole, nous décrivons des procédures pour analyser qualitativement et quantitativement des phénotypes développementaux chez les souris associées aux défauts congénitaux de coeur.

Analyse des malformations cardiaques congénitales chez les embryons de souris à l’aide de méthodes histologiques qualitatives et quantitatives

Le présent protocole décrit l’évaluation échocardiographique de la morphologie, de la fonction et du débit sanguin coronaire du ventriculaire gauche chez des souris nouveau-nées âgées de 7 jours.

Caractérisation échocardiographique de la structure, de la fonction et du flux coronaire ventriculaire gauche chez les souris nouveau-nées

Cet article détaille les méthodes de diagnostic des cardiopathies congénitales (CHD) murines utilisant l’échocardiographie fœtale, la nécropsie et la capture d’images de fluorescence épiscopique (EFIC) à l’aide de la microscopie confocale épiscopique (ECM) suivie d’une reconstruction tridimensionnelle (3D).

Un pipeline pour caractériser les malformations cardiaques structurelles chez la souris fœtale

Découvrez une méthode économique d'échocardiographie et d'analyse histologique pour évaluer la morphologie cardiaque chez la souris. Ce protocole permet d'étudier la fonction cardiaque dans divers modèles transgéniques.

Examen échocardiographique et histologique de morphologie cardiaque chez la souris

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