Name: Lapproche déchantillonnage à 4 navires pour les études intégratives de la physiologie du plaidoyer humain In vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Découvrez la méthode d'échantillonnage sanguin à quatre vaisseaux pour étudier la physiologie placentaire humaine in vivo. Cette approche intégrative permet d'analyser le transfert et le métabolisme materno-fœtal.

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D&#39;abord et avant tout, nous remercions sincèrement les mères qui ont participé à ce projet. Ensuite, nous reconnaissons tout le personnel qui a aidé et facilité la procédure d&#39;échantillonnage, l&#39;anesthésiste, l&#39;infirmière anesthésiste et les infirmières chirurgicales. Le projet n&#39;aurait pas été possible sans le financement de l&#39;Autorité régionale de la santé du Sud-Est de la Norvège et de l&#39;Unité consultative norvégienne sur la santé des femmes, de l&#39;Université d&#39;Oslo et du financement local fourni par l&#39;Hôpital universitaire d&#39;Oslo.

L&#39;étude a été approuvée par les responsables de la protection des données à l&#39;Hôpital universitaire d&#39;Oslo et le Comité régional pour l&#39;éthique de la recherche médicale et de la santé, Southern Norway 2419/2011. Tous les participants ont signé un consentement éclairé par écrit à l&#39;inclusion. 1. Préparations REMARQUE: une chronologie pour les procédures est décrite dans la figure 1 . <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55847/55847fig1.jpg" /> Figure 1 : diagramme décrivant le calendrier et le personnel impliqué dans la procédure d&#39;échantillonnage à 4 navires. Une seule couleur représente une personne. La description détaillée de la méthode est donnée dans le protocole. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55847/55847fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <ol><li> Personnel <ol><lI&gt; Assurez-vous que tout le personnel requis est disponible: un spécialiste de la médecine du foetus hautement qualifié qui effectue les mesures de l&#39;échographie, deux obstétriciens qui effectuent la chirurgie, l&#39;un des obstétriciens et deux infirmières qui collectent les échantillons, un assistant qui manipule les analyses de gaz sanguins et un assistant qui manipule le D&#39;autres échantillons consécutivement et immédiatement après la collecte. NOTE: Dans le cas d&#39;une collecte plus avancée du tissu placentaire, une personne supplémentaire est requise. </li></ol></li><li> Équipement <ol><li> Préparez l&#39;équipement, 50 ml de solution salée tamponnée au phosphate 1 M (PBS), 25 ml de solution stabilisatrice d&#39;ARN froide et 5 x 0,5 ml de composé de température de coupe optimal (OCT). Étiquetez les aspirateurs et les tubes. Voir la liste provisoire de l&#39;équipement. </li></ol></li></ol> 2. Caractéristiques de la mère <ol><li> Notez les caractéristiques cliniques et non cliniques maternelles à l&#39;inclusion et répétez les questions pertinentes et moiLes précautions, y compris le poids, au moment de la livraison. Notez la durée de la période de jeûne avant la césarienne et tous les épisodes hypotensifs se produisant pendant la chirurgie. Note: Inclure l&#39;ensemble minimal de données cliniques maternelles signalé dans une publication récente de CoLaboratory Global de Grossesse (COLAB). Cet article comprend également des aspects très importants dans le choix des populations étudiées et devrait être abordé lors de la planification de l&#39;étude 18 . </li><li> Envisager d&#39;enregistrer les caractéristiques paternelles, y compris l&#39;appartenance ethnique, l&#39;âge et l&#39;indice de masse corporelle (IMC). </li></ol> 3. Echographie <ol><li> Effectuez l&#39;échographie Doppler le jour de la livraison, avec les femmes en état de jeûne. Effectuer l&#39;examen pendant une période de quiescence foetale, avec la femme en position semi-supine, incliné légèrement latéralement en face de la région d&#39;intérêt afin d&#39;éviter la compression de l&#39;aorte et de la veine cave. Surveiller la sortie dansLa tension par les indices mécaniques et thermiques sur l&#39;affichage. </li><li> Veine ombilicale <ol><li> Visualiser la veine ombilicale dans une transitoire sagittale ou oblique de l&#39;abdomen fœtal. Mesurer le diamètre interne du vaisseau dans la partie droite de la veine ombilicale intra-abdominale, avant toute branche visible. Utilisez le mode B régulier et visualisez le vaisseau dans un angle d&#39;insonction perpendiculaire pour les mesures du diamètre et gardez plusieurs cadres optimaux pour des mesures ultérieures pour minimiser l&#39;effet des changements de diamètre pulsatile. <ol><li> Répétez les mesures de cinq à dix fois 19 . </li></ol></li><li> Sur le même site, utilisez l&#39;échographie Doppler et ajustez la sonde pour obtenir un angle d&#39;insonance le plus bas possible (toujours &lt;30 °) afin de mesurer la vitesse maximale moyenne en temps (TAMX). Obtenir la vitesse sur une période de 3 à 5 s (débit non pulsé). </li></ol></li><li> Artère utérine <ol><li> Utiliser DopplerÉchographie pour visualiser l&#39;artère utérine alors qu&#39;elle traverse l&#39;artère iliaque externe, immédiatement après qu&#39;elle se ramifie de l&#39;artère iliaque interne. Réglez la sonde sur ce site pour obtenir un faible angle d&#39;insonance (toujours &lt;30 °) et mesurez TAMX. Obtenez la vitesse comme vitesse moyenne de trois cycles cardiaques. </li><li> Étant donné qu&#39;il est peu probable d&#39;avoir un angle perpendiculaire au même endroit que le TAMX, il faut suivre le vaisseau distalement pour obtenir un angle correct pour des mesures de diamètre aussi proches des sites de mesures de diamètre que possible. Exclure les mesures du diamètre si des vaisseaux visibles s&#39;écoulent avant ce site comme évalué par échographie Doppler couleur. <ol><li> Utilisez le mode B régulier et visualisez le vaisseau dans un angle d&#39;insonction perpendiculaire pour les mesures du diamètre et gardez plusieurs cadres optimaux pour des mesures ultérieures pour minimiser l&#39;effet des changements de diamètre pulsatile. </li><li> Répétez les mesures de cinq à dix fois 19 . </li></ol></<html> Li&gt; </ol></li><li> Notez la position du placenta. </li></ol> 4. Échantillonnage de sang à 4 vaisseaux REMARQUE: la chronologie des procédures est décrite à la figure 1 et une vue d&#39;ensemble des échantillons est illustrée à la figure 2 . <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55847/55847fig2.jpg" /> Figure 2 : Illustration schématique de la vasculature placentielle et des sites d&#39;échantillonnage. Dans la méthode d&#39;échantillonnage à 4 vaisseaux, des échantillons de sang sont tirés de la veine utérine, de l&#39;artère radiale (en tant que vecteur de l&#39;artère utérine) et des artères et des veines ombilicales. Le flux sanguin dans l&#39;artère utérine et la veine ombilicale est mesuré par ultrasons. Des échantillons de tissus provenant du placenta sont collectés. Illustration: Øystein H. Horgmo, Université d&#39;Oslo.5847fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. <ol><li> Les procédures de sécurité <ol><li> Fournir tout le personnel dans l&#39;opération théâtre avec des gants, des combinaisons chirurgicales, des masques et des couvre-chefs. </li><li> Fournir aux chirurgiens et au personnel de recherche en contact avec le champ d&#39;opération avec des combinaisons chirurgicales, des masques, des couvre-chefs, des robes et des gants doubles. Les lunettes sont facultatives. </li><li> Fournir au personnel qui manipule les échantillons de sang avec des gants. </li><li> Fournir au personnel qui manipule les échantillons de placenta avec des gants et un masque chirurgical. L&#39;homogénéisation nécessite l&#39;utilisation de hottes. </li></ol></li><li> Préparation à l&#39;opération Théâtre <ol><li> Donner un briefing et remettre l&#39;équipement à tout le personnel qui aidera l&#39;échantillonnage avant le début de la chirurgie. </li><li> S&#39;adresser à l&#39;infirmière anesthésiologiste et anesthésiste qui aidera à l&#39;accès artérielle et veineuse périphérique nécessaire et veillera à ce queAucun liquide n&#39;est administré par voie intraveineuse avant l&#39;échantillonnage. </li><li> Donner trois seringues (10 mL) sans aiguilles à la personne aidant avec l&#39;échantillon de veine antecubitale et deux seringues (une 20 mL et une 10 mL) et une seringue à sang (avec l&#39;héparine) à l&#39;aide de l&#39;artère radiale. </li><li> Préparez deux seringues stériles (20 mL), cinq seringues stériles (10 mL), trois &quot;aiguilles papillons&quot; et deux seringues à gaz pour le champ d&#39;opération. </li></ol></li><li> Accès aux vaisseaux sanguins. <ol><li> Suivez la procédure standard avant la césarienne pour assurer l&#39;accès intraveineux périphérique (iv). NOTE: La veine antecubitale est préférable car il est plus facile de prélever des échantillons sur ce site. </li><li> Localiser l&#39;artère radiale au poignet par ultrasons ou par palpation. Après 0,5 ml d&#39;analgésie sous la lidocaïne sous-cutanée, placez une ligne artérielle dans l&#39;artère radiale. Abandonnez l&#39;échantillonnage de ce site en cas de trois insertions échouées, ouSi la femme éprouve de la douleur lors de l&#39;insertion. REMARQUE: effectuer la procédure chirurgicale de la césarienne selon la procédure standard. Seuls les ajustements nécessaires à la procédure d&#39;échantillonnage sont soulignés ci-dessous. </li></ol></li><li> Échantillons de sang maternel NOTE: Obtenez les trois échantillons de sang maternel (veine utérine, artère radiale et veine antecubitale) simultanément avant l&#39;incision utérine. <ol><li> Pour la veine utérine, après avoir ouvert la cavité abdominale, utilisez un rétracteur pour soulever la paroi abdominale et exposez les branches principales des veines utérines sur les côtés antérolégéraux de l&#39;utérus. Obtenir du sang dans les branches de la veine utérine du même côté que le placenta chaque fois que possible ou utiliser le plexus veineux le plus important si le placenta est situé dans la ligne médiane utérine. <ol><li> Insérez une aiguille de papillon sur une seringue de sang dans la veine utérine à un angle d&#39;environ 30 degrés et collectez le sang par aspiration douce pour éviterL&#39;hémolyse. Tout en garantissant soigneusement la position iv de l&#39;aiguille papillon, remplacez la seringue à gaz remplie par une seringue de 20 mL et 10 mL consécutivement. REMARQUE: L&#39;accès optimal est mieux assuré lorsqu&#39;il est debout sur le côté contralateral de la veine utérine choisie. </li></ol></li><li> Pour l&#39;artère radiale, aspirer à partir de la ligne intra-artérielle. Jeter les premiers 5 mL, puis aspirer 3 mL dans la seringue d&#39;héparine pour les analyses de gaz sanguins, puis 3 mL dans deux seringues (20 + 10 mL). </li><li> Pour la veine antecubitale, aspirer doucement du cathéter intraveineux. Jeter les premiers 5 mL, puis aspirer 30 mL dans trois seringues (10 mL). </li><li> Effectuer une inspection finale du site d&#39;échantillonnage sur la veine utérine avant de commencer à fermer l&#39;abdomen. </li></ol></li><li> Échantillons de sang fœtal <ol><li> Lorsque l&#39;enfant est né, aspirer immédiatement le sang de l&#39;artère ombilicale, sans serrer le cordon ombilical ou administrer le placenta. Commencez l&#39;espritH la seringue pour l&#39;analyse des gaz sanguins et suivre avec trois seringues de 10 mL si possible. </li><li> Lorsque les échantillons artériels sont sécurisés, serrer le cordon et remettre l&#39;enfant à la sage-femme avant l&#39;échantillonnage de la veine ombilicale (gaz de sang et 20 + 10 mL de seringues). REMARQUE: Obtenez tous les échantillons ombilicaux en quelques secondes de l&#39;accouchement et avec le placenta in situ à moins qu&#39;il ne soit détaché spontanément. </li><li> Suivez les recommandations norvégiennes sur le serrage du cordon tardif. Dans le cas d&#39;un enfant en difficulté, serrez et coupez le cordon immédiatement et laissez l&#39;enfant à la sage-femme et au néonatologue. </li></ol></li><li> Manipulation des échantillons de sang <ol><li> Mettez les seringues de gaz sanguins sur de la glace tout en préparant le reste des échantillons de sang et analysez-les dans un analyseur de gaz sanguin dans les 5 minutes. </li><li> Transférer immédiatement les échantillons de sang aux vacutainers et placer les tubes de plasma sur un rocker pendant 1 à 2 minutes avant de les mettre sur de la glace. Laissez les tubes de sérum sur le travailUn banc de règlement pour s&#39;établir pendant 30 minutes. REMARQUE: Il s&#39;agit d&#39;une étape critique dans la procédure qui nécessite une attention particulière car les échantillons des cinq sites doivent être préparés simultanément pour assurer une bonne qualité. </li><li> Centrifuger les échantillons de plasma dès que possible et dans les 30 minutes, à 6 ° C, 2 500 xg pendant 20 min. </li><li> Après 30 min, centrifuger les échantillons de sérum à température ambiante pendant 10 min à 2 500 x g. </li><li> Aliquotez les surnageants avec soin dans 2 mL de tubes cryo, en laissant 0,5 mL du surnageant au-dessus de la pastille pour assurer un plasma exempt de plaquettes. </li><li> Conservez les échantillons à -80 ° C. </li></ol></li></ol> 5. Collecte de tissu plaquettaire <ol><li> Placez le placenta à plat vers le bas sur un plateau de dissipation refroidi par glace dès que possible après avoir été livré. Photographiez et mesurez le plus long diamètre et le diamètre à 90 degrés. </li><li> Peser le placenta. </li><li> Notez le poids, les deux diamètres, tout gLa pathologie de Ross, le nombre de vaisseaux dans le cordon et l&#39;intervalle de temps entre la livraison et le moment où le placenta a été placé sur de la glace. REMARQUE: Envoyer le placenta à l&#39;examen pathologique s&#39;il est indiqué cliniquement. </li><li> Placez le placenta avec la surface maternelle vers le haut et identifiez 4 à 5 sites d&#39;échantillonnage situés au hasard dans chaque quadrant du placenta, en évitant les zones de pathologie franche. Retirez la décidua à l&#39;aide de ciseaux pour couper 3 à 5 mm de la surface maternelle. Recueillir un morceau de tissu vilain de 1 à 2 cm 3 de chaque site. </li><li> Lavez doucement le tissu récolté dans 50 ml de PBS froid 1 M. Diviser en plusieurs pièces de chaque site d&#39;échantillonnage et une aliquote. Remarque: La taille des pièces du placenta dépend des analyses planifiées. </li><li> Ajouter des aliquotes de 0,1 à 0,5 cm 3 échantillons de tissus à 5 tubes cryo et congélation instantanée dans de l&#39;azote liquide. </li><li> Ajouter de petits morceaux de 0,1 à 0,2 cm 3 au tube avec 25 ml de solution de stabilisation d&#39;ARN. Magasin à 46; C pendant 24 h, jeter la solution de stabilisation d&#39;ARN et la remplacer. Gel. </li><li> Ajouter des morceaux de 0,5 cm 3 aux 5 tubes cryo avec 0,5 ml d&#39;OCT, compléter avec OCT, mélanger et congeler. </li><li> Conservez les échantillons à -80 ° C jusqu&#39;à l&#39;analyse. NOTE: Burton et al. Fournit un excellent aperçu des aspects pratiques de l&#39;échantillonnage du placenta en fonction des analyses prévues. 20 Considérez préparer le tissu restant pour l&#39;isolement des membranes microvillées et basales, et pour collecter le tissu décalé par technique d&#39;aspiration sous vide. 21 , 22 </li></ol> 6. Caractéristiques néonatales <ol><li> Enregistrez les caractéristiques néonatales, y compris le score Apgar (1, 5 et 10 min), le sexe, le poids, la longueur, l&#39;âge gestationnel et l&#39;admission à l&#39;Unité de soins intensifs du nouveau-né (durée et résultat du séjour). </li><li> Envisager de mesurer la composition du corps néonatal par des mesures anthropométriques, déplacer l&#39;airPléthysmographe ou double absorptiométrie des rayons X. 23 , 24 </li></ol> 7. Calculs <ol><li> Supposons une composition sanguine similaire dans l&#39;artère radiale et utérine et calculez la différence de concentration artérioveineuse uteroplacentale. Différence de concentration artérioveineuse uteroplacentaire = C A - C V Différence de concentration artérielle veineuse - artérielle = C v - C a Lorsque C est la concentration avec les indices: A, l&#39;artère radiale; V, la veine utérine; V la veine ombilicale et a, l&#39;artère ombilicale. </li><li> Calculer le débit sanguin du volume, mL / min (Q): <img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/55847/55847eq1.jpg" /> Lorsque D est le diamètre du navire (cm), TAMX est la vitesse maximale moyenne en temps et h est le coefficient pour le profil spatial de la vitesse du sang. Utilisez 0,5 comme coefficient pour la veine ombilicale et0,6 pour l&#39;artère utérine 25 , 26 . </li><li> Calculez l&#39;absorption et la libération du placenta selon le principe de Fick: Capture uteroplacentale = ( C A - C V ) x Qm Absorption fœtale = ( C v - C a ) X Q f Sous-rubriques: m, maternelle et f, foetale. </li></ol>

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<li>Cetin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+transport+of+amino+acids+in+normal+and+growth-restricted+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Obstet+Gynecol+Reprod+Biol%22%5BJournal%5D)">Placental transport of amino acids in normal and growth-restricted pregnancies.</a> Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 110, Suppl 1 50-54 (2003).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

<html> La méthode d&#39;échantillonnage du placenta à 4 navires est pertinente pour trois objectifs principaux. Tout d&#39;abord, il peut être utilisé pour étudier comment des substances spécifiques sont absorbées par le placenta du côté maternel et éventuellement transférées à la circulation ombilicale et au foetus, comme en témoignent nos études sur le glucose et les acides aminés. Deuxièmement, la méthode est très pertinente pour étudier les substances produites par le placenta et libérées dans les circulations matern...

Selon le National Institutes of Health, aux États-Unis, le placenta est l&#39;organe le moins compris dans le corps humain 1 , 2 , 3 . Il est difficile d&#39;accéder et d&#39;étudier le placenta humain in vivo sans imposer de contraintes éthiques sur la grossesse en cours. Les études de la fonction placentaire chez l&#39;humain reposent en grande partie sur des modèles in vitro et ex vivo . La majorité des études antérieures in vivo sur le transport du placenta et le métabolisme ont été réalisées chez les animaux 4 , 5 , 6 . Cependant, comme la structure et les fonctions du placenta varient considérablement d&#39;une espèce à l&#39;autre, l&#39;extrapolation des résultats des animaux aux humains doit être effectuée avec prudence. Seules quelques études humaines in vivo plus petites ont étudié l&#39;absorption et le transport du placenta et du fœtus dans des conditions physiologiques normalesToutes les conditions, et aucun n&#39;a exploré le transfert intégré de plusieurs composés 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Ces études fondamentales illustrent que les études in vivo du placenta humain sont réalisables et qu&#39;elles peuvent servir à plusieurs fins. Tout d&#39;abord, les concepts actuels de fonctions placentaires principalement dérivés d&#39;études in vitro , ex vivo et animales peuvent être testés dans un milieu humain et fournir ainsi une vision nouvelle et plus spécifique du placenta humain. Deuxièmement, les propriétés du placenta dysfonctionnel associé à la croissance aberrante du foetus, la prééclampsie, le diabète maternel, le syndrome métabolique et d&#39;autres troubles métaboliques maternels peuvent être mieux caractérisés. Troisièmement, les études humaines in vivo offrent l&#39;occasion de développer le diagnosticTic et les outils prédictifs de la fonction placentaire. Dans ce contexte, nous avons cherché à établir une collection complète de données physiologiques pour étudier la fonction placentaire humaine in vivo. Au cours d&#39;une césarienne planifiée, nous exploitons l&#39;accès intra-abdominal à la veine utérine pour recueillir des échantillons de sang provenant des vaisseaux entrants et sortants sur les côtés maternel et fœtal du placenta (la méthode d&#39;échantillonnage à 4 vaisseaux). Ces échantillons sont utilisés pour calculer les différences de concentration artérioveineuses appariées des nutriments et d&#39;autres substances 14 . En outre, nous mesurons le débit sanguin du volume des deux côtés du placenta par ultrasons. Par conséquent, l&#39;absorption placentaire et foetale de tout composé peut être quantifiée. En outre, il est possible de déterminer les substances libérées par le placenta aux circulations maternelle et fœtale 15 , 16 , 17 . Lorsqu&#39;on combineD avec des paramètres cliniques de la mère et de l&#39;enfant, et des analyses des tissus placentaires et d&#39;autres tissus pertinents, cette méthode a le potentiel excitant d&#39;intégrer de nombreux aspects des fonctions placentaires in vivo dans les mêmes paires mère-fœtus.

<table><tbody><tr><td><forte>Composition corporelle maternelle</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Échelle d’impédance</td><td>Tanita</td><td></td><td>ou similaire</td></tr><tr><td><forte>Mesures par ultrasons&nbsp ; Échographe </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sequoia 512</td><td>Acuson</td><td></td><td>équipé d’un transducteur incurvé avec Doppler à ondes de couleur et de pouls (bande passante de fréquence 2 - 6 MHz)</td></tr><tr><td>Échantillons de sang</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Canule aérielle</td><td>BD Medical</td><td>682245</td><td>ou similaire</td></tr><tr><td>Seringue Luer Tip excentrique de 20 cc sans aiguille</td><td>Termo</td><td>SS-20ES</td><td>ou similaire. 3 nécessaires.</td></tr><tr><td>Seringue Luer excentrique de 10 cc sans aiguille</td><td>Termo</td><td>SS-10ES</td><td>ou similaire. 9 nécessaires.</td></tr><tr><td>Seringue Luer 5 cc 6 % sans aiguille</td><td>Termo</td><td>SS-05S1</td><td>ou similaire. 2 nécessaires.</td></tr><tr><td>Seringue de gaz du sang artériel&nbsp ;</td><td>Radiomètre médical</td><td></td><td>ou similaire. 4 nécessaires.</td></tr><tr><td>Aiguille ailée stérile reliée à un tube flexible, calibre 21</td><td>Greiner Bio-One</td><td>450081</td> <td>(à usage unique).3 nécessaire.</td></tr><tr><td>Tube Vacutainer 6 mL EDTA&nbsp ;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>456043</td><td>ou similaire. Étiquette avec site d’échantillonnage. 10 nécessaires.</td></tr><tr><td>Tube Vacutainer 5 mL LH Séparateur d’héparine</td><td>au lithium Greiner Bio-One</td><td>456305</td><td>ou similaire. Étiquette avec site d’échantillonnage. 5 nécessaires.</td></tr><tr><td>Vacutainer tube 6 mL Activateur de caillots sériques&nbsp ;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>456089</td><td>ou similaire. Étiquette avec site d’échantillonnage. 5 nécessaires.</td></tr><tr><td>Vacutainer tube 3 mL&nbsp ; 9NC Citrate de sodium de coagulation 3,2 %</td><td>Greiner Bio-One</td><td>454334</td><td>ou similaire. Étiquette avec site d’échantillonnage. 5 nécessaires.</td></tr><tr><td>Flacons cryogéniques de 2,0 ml</td><td>de 430488</td><td>Corning</td><td>ou similaires. Étiquette avec le site d’échantillonnage, le sérum/type de plasma et ID. 90 nécessaire.</td></tr><tr><td>Plateaux marqués pour le transport des seringues</td><td></td><td></td><td>pour le transport des échantillons de sang dans la salle d’opération</td></tr><tr><td>Rocker</td><td></td><td></td><td>pour un mélange en douceur des échantillons</td></tr><tr><td>Glace</td><td></td><td></td><td>dans une boîte en polystyrène</td></tr><tr><td>Azote</td><td></td><td></td> liquide <td>dans le récipient approprié</td></tr> <tr><td><échantillons de placenta strong>Échantillons de placenta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal Plateau</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glace</td><td></td><td></td><td>dans une boîte en polystyrène</td></tr><tr>Échelle <td></td><td></td><td></td><td>calibrée</td></tr><tr><td>Règle</td><td></td><td></td><td></td>en métal</tr><tr><td>1 M Saline tamponnée</td><td>au phosphate Sigma</td><td>D1408</td><td>ou similaire. Diluer 10 M à 1 M avant utilisation</td></tr><tr><td>Solution de stabilisation d’ARN</td><td>Sigma</td><td>R0901-500ML&nbsp ;</td><td>ou similaire</td></tr><tr><td>Composé à température de coupe optimale (O.C.T.) VWR</td><td></td><td>361603E</td><td>ou</td></tr><tr><td>flacons cryogéniques similaires, 2,0 mL</td><td>430488</td><td>Corning</td><td>ou similaires. Étiquette avec site d’échantillonnage. contenu et ID. 10 nécessaires.</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger, fond conique 50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227,285</td><td>ou similaire. Étiqueter avec « ARN plus tard », site d’échantillonnage et ID. 2 nécessaires.</td></tr><tr><td>Azote</td><td></td><td></td> liquide <td>dans un récipient approprié</td></tr><tr><td><fort>composition corporelle fœtale</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Échelle <td></td><td></td><td></td><td>calibrée</td></tr><tr><td>Ruban</td><td></td><td></td><td></td> à mesurer</tr></tbody></table>

l&#39;approche d&#39;échantillonnage à 4 navires pour les études intégratives de la physiologie du plaidoyer humain<em&gt; in vivo</em

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

Le placenta humain est très inaccessible à la recherche alors qu&#39;il est encore in utero . La compréhension actuelle de la physiologie du placenta humain in vivo repose en grande partie sur des études sur les animaux, malgré la grande diversité des espèces en anatomie placentaire, l&#39;hémodynamique et la durée de la grossesse. La grande majorité des études sur le placenta humain sont des études de perfusion ex vivo ou des études de trophoblastes in vitro . Bien que les études in vitro et les modèles animaux soient essentiels, l&#39;extrapolation des résultats de ces études au placenta humain in vivo est incertaine. Nous avons visé à étudier la physiologie du placenta humain in vivo à terme et à présenter un protocole détaillé de la méthode. En exploitant l&#39;accès intra-abdominal à la veine utérine juste avant l&#39;incision utérine pendant la césarienne prévue, nous recueillons des échantillons de sang des vaisseaux entrants et sortants sur les côtés maternel et fœtal du placenta. En combinant conDes mesures de centration à partir d&#39;échantillons de sang avec des mesures du débit sanguin, nous sommes en mesure de quantifier l&#39;absorption du placenta et du fœtus et la libération de tout composé. En outre, les échantillons de tissus placentaires provenant des mêmes paires mère-foetus peuvent fournir des mesures de la densité et de l&#39;activité des transporteurs et d&#39;autres aspects des fonctions placentaires in vivo . Grâce à cette utilisation intégrative de la méthode d&#39;échantillonnage à 4 navires, nous sommes en mesure de tester certains des concepts actuels de transfert de nutriments placentaires et de métabolisme in vivo , à la fois chez les grossesses normales et pathologiques. En outre, cette méthode permet d&#39;identifier les substances sécrétées par le placenta à la circulation maternelle, ce qui pourrait être une contribution importante à la recherche de biomarqueurs de dysfonctionnement du placenta.

La méthode d&#39;échantillonnage à 4 navires s&#39;applique à la pratique clinique et nous avons réussi à obtenir des prélèvements sanguins provenant de 209 couples mère / nourrissons. Dans 128 d&#39;entre eux, nous avons également réalisé pour mesurer le débit sanguin du volume. L&#39;échantillonnage complet de 4 navires et les mesures de débit de qualité des vaisseaux maternels et fœtaux ont été obtenus dans 70 paires mère-foetus ( figure 3 ). De plus, nou...

Nous présentons une méthode détaillée pour étudier la physiologie du placenta humain in vivo à terme. La méthode combine l&#39;échantillonnage du sang des vaisseaux entrants et sortants sur les côtés maternel et fœtal du placenta avec des mesures ultrasonores du flux sanguin volumique et de l&#39;échantillonnage du tissu placentaire.

L&#39;approche d&#39;échantillonnage à 4 navires pour les études intégratives de la physiologie du plaidoyer humain<em&gt; In vivo</em

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore ...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier la fonction placentaire humaine in vivo à l'aide de plusieurs méthodes, qui ensemble permettent la collecte de données complètes et intégratives sur la physiologie fœto-placentaire humaine. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant la physiologie placentaire humaine, telles que le rôle du placenta dans l'interaction mère-fœtus. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet de tester in vivo chez l'humain les concepts actuels relatifs au transfert, à la captation et à la sécrétion placentaires.L'extrapolation des études expérimentales à l'humain est entravée par les grandes différences entre les animaux et les humains en matière d'anatomie placentaire, de durée de la grossesse et de complications pendant la grossesse. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le métabolisme placentaire et le transfert des nutriments, elle peut également être utilisée pour étudier la libération placentaire de composés, tant dans les grossesses saines que dans celles compliquées, comme l'hypertension gravidique. Cette méthode nécessite une coopération hautement coordonnée entre plusieurs spécialistes médicaux, infirmières et chercheurs.La clé du succès réside dans une planification rigoureuse tout en gardant constamment la mère et son bébé au centre des préoccupations. Ce tableau illustre le déroulement chronologique et le personnel nécessaire pour obtenir les échantillons. Chaque personne participant au prélèvement est représentée par une couleur différente.Ce protocole repose sur l'utilisation combinée de trois méthodes pour étudier la physiologie placentaire humaine. Premièrement, le débit sanguin volumétrique dans l'artère utérine et la veine ombilicale est mesuré par échographie. Deuxièmement, des échantillons sanguins sont prélevés à partir des vaisseaux entrants et sortants du côté maternel et du côté fœtal du placenta humain pendant une césarienne.Des échantillons de tissu placentaire sont recueillis en troisième étape pour analyse. Pour commencer, aidez la femme à s'installer en position semi-assise, légèrement inclinée latéralement du côté opposé à la région d'intérêt, afin d'éviter toute compression de l'aorte et de la veine cave. Pendant une période de quiescence fœtale, visualisez la veine ombilicale en coupe sagittale ou oblique du ventre fœtal et mesurez le diamètre interne du vaisseau sur un segment rectiligne de la veine ombilicale intra-abdominale, avant toute branche visible.Utilisez le mode B standard et visualisez le vaisseau sous un angle d'insonation perpendiculaire pour les mesures du diamètre, en conservant plusieurs images optimales pour des mesures ultérieures afin de minimiser l'effet des variations pulsatoires du diamètre. Répétez les mesures de cinq à dix fois. Au même emplacement, ajustez la sonde et utilisez l'échographie Doppler pour obtenir un angle d'insonation aussi faible que possible afin de mesurer la vélocité maximale moyennée dans le temps, ou TAMX.Obtenez la vitesse sur une période de trois à cinq secondes. Ensuite, utilisez l'échographie Doppler pour visualiser l'artère utérine au moment où elle croise l'artère iliaque externe, immédiatement après son origine à partir de l'artère iliaque interne. Ajustez la sonde à ce niveau afin d'obtenir un angle d'insonation faible et mesurez le TAMX.Obtenez la vitesse comme vitesse moyenne de trois cycles cardiaques. Suivez le vaisseau en direction distale pour obtenir un angle correct pour les mesures du diamètre, aussi proches que possible des sites de mesure de TAMX. Il est difficile de mesurer le débit sanguin volumique dans l'artère utérine, car il est peu probable d'obtenir un angle perpendiculaire au même endroit où la mesure de TAMX est effectuée.Les vaisseaux qui se ramifient entre les deux sites de mesure peuvent entraîner l'exclusion des mesures de diamètre. Pour effectuer un prélèvement sanguin sur quatre vaisseaux avant le début de la chirurgie, préparez les solutions, les tubes et le matériel. Ensuite, donnez des consignes et remettez le matériel à tout le personnel qui participera au prélèvement.Poser une ligne artérielle dans l'artère radiale en complément de l'accès intraveineux périphérique standard. La veine antécubitale est préférable car il est plus facile de prélever des échantillons à ce niveau. Ensuite, après ouverture de la cavité abdominale, utiliser un rétracteur pour soulever la paroi abdominale et exposer les branches principales des veines utérines sur les faces antérolatérales de l'utérus.Identifier une branche veineuse utérine du même côté que le placenta, si possible, ou le plexus veineux le plus important du placenta situé au niveau de la ligne médiane utérine. Une fois une veine utérine appropriée identifiée, demander au personnel assistant de prélever des échantillons sanguins à partir de l'artère radiale et de la veine antécubitale. Simultanément, insérer, selon un angle de 30 degrés, une aiguille papillon fixée à une seringue pour gaz du sang dans la veine utérine et recueillir le sang par aspiration douce.Tout en fixant soigneusement la position intraveineuse de l'aiguille papillon, demandez à un assistant de remplacer la seringue de gaz du sang remplie par une seringue de 20 millilitres. Suivez immédiatement avec une seringue de 10 millilitres. À partir de l'artère radiale, de la veine antécubitale, jetez les cinq premiers millilitres, puis aspirez trois millilitres dans une seringue héparinée pour les analyses des gaz du sang.Ensuite, aspirez 30 millilitres à partir de chaque site. Dès la naissance de l'enfant, commencez par une seringue destinée à l'analyse des gaz sanguins et aspirez immédiatement du sang de l'artère ombilicale sans pincer le cordon ombilical ni expulser le placenta. Continuez, si possible, avec trois seringues de 10 millilitres.Une fois les prélèvements artériels sécurisés, pincer et couper le cordon avant de prélever dans la veine ombilicale, en obtenant tous les échantillons ombilicaux avec le placenta en place. La méthode à quatre vaisseaux nécessite un prélèvement sanguin coordonné ainsi qu'une manipulation rapide des échantillons provenant simultanément de cinq sites différents. Veiller à la vigilance concernant l'artère ombilicale, qui est sujette à la contraction, à l'hémolyse et à la coagulation.Effectuez une inspection finale du site de prélèvement sur la veine utérine avant de commencer à refermer l'abdomen. Placez toutes les seringues pour gaz du sang sur de la glace et utilisez un analyseur de gaz sanguins pour analyser les échantillons dans les cinq minutes. Transférez immédiatement les échantillons sanguins dans des tubes sous vide et agitez doucement les tubes de plasma pendant une à deux minutes avant de les placer sur de la glace.Centrifuger les échantillons de plasma dès que possible et dans les 30 minutes suivant le prélèvement, à 2 500 × g et à six degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, prélever soigneusement les surnageants et les répartir en aliquotes dans des cryotubes de deux millilitres. Analyser les échantillons sanguins pour les substances souhaitées et effectuer les calculs de transfert placentaire conformément au protocole décrit dans le texte.Placer le placenta à plat sur un plateau de dissection refroidi à la glace dès que possible après son expulsion. Enregistrer le poids du tissu ainsi que le diamètre le plus long et le diamètre à 90 degrés par rapport à la première mesure. Noter ensuite toute pathologie macroscopique et le nombre de vaisseaux présents dans le cordon.Placer le placenta avec la surface maternelle vers le haut et identifier quatre à cinq sites d'échantillonnage situés aléatoirement dans chaque quadrant du placenta. Utiliser des ciseaux pour retirer la décidua, en découpant trois à cinq millimètres à partir de la surface maternelle. Ensuite, prélever un morceau de tissu villositaire d'un à deux centimètres cubes à partir de chaque site.Avec 50 millilitres de PBS froid à une molaire, laver délicatement le tissu recueilli. Ensuite, diviser le tissu en plusieurs morceaux provenant de chaque site d'échantillonnage et en faire des aliquotes. Ajouter des aliquotes de 0,1 à 0,5 centimètre cube d'échantillons de tissu dans cinq cryotubes et congeler rapidement les échantillons dans l'azote liquide.Ajouter de petits morceaux de 0,1 à 0,2 centimètre cube de taille dans des tubes préparés au préalable contenant 25 millilitres de solution de stabilisation de l'ARN. Pour les études histologiques, ajouter des morceaux de 0,5 centimètre cube dans cinq cryotubes contenant 0,5 millilitre d’OCT, compléter avec de l’OCT, puis mélanger le contenu des tubes. Congeler les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu'à analyse ultérieure.Des échantillons sanguins provenant de 209 paires mère-enfant ont été obtenus avec succès à l’aide de la méthode de prélèvement à quatre vaisseaux. Le débit sanguin volumétrique a été mesuré dans 128 des échantillons. Un prélèvement complet à quatre vaisseaux ainsi que des mesures de débit de bonne qualité pour les vaisseaux maternels et fœtaux ont été obtenus chez 70 paires mère-fœtus.L'approche à quatre vaisseaux a été utilisée pour étudier le transfert placentaire, comme illustré ici par le glucose. Des différences artério-veineuses significatives concernant le glucose ont été observées des deux côtés du placenta, démontrant une captation utéroplacentaire in vivo de 0,29 millimole par litre et une captation fœtale de 0,54 millimole par litre. Un débit médian dans la veine ombilicale de 196,2 millilitres par minute a été mesuré.En appliquant le principe de Fick, une prise médiane de glucose fœtal à partir de la circulation ombilicale de 0,10 millimole par minute a été calculée. À l’aide de la méthode à quatre vaisseaux, la prise placentaire d’acide glutamique a été étudiée, ce qui est important comme carburant dans les voies métaboliques et pour l’interconversion fœto-placentaire des acides aminés. Une prise placentaire d’acide glutamique provenant à la fois de la circulation ombilicale et maternelle a été observée.La libération in vivo de progestérone par le placenta au terme a également été mesurée, et une libération significative de progestérone dans la circulation maternelle a été observée, démontrant ainsi que la méthode d'échantillonnage placentaire à quatre vaisseaux peut être utilisée pour détecter les substances libérées par le placenta. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de souligner que les mesures du débit sanguin volumétrique doivent être effectuées par un spécialiste en médecine fœtale expérimenté dans ce type d'échographie afin d'obtenir des mesures précises. Après cette procédure, les échantillons sanguins peuvent être analysés pour étudier le transfert placentaire ainsi que la capture ou la libération de la substance d'intérêt, qu'il s'agisse de nutriments, de métabolites, de molécules de signalisation, d'exosomes, de composés de déchets, de médicaments ou de toxines.En outre, l'analyse des échantillons de placenta peut répondre à des questions supplémentaires concernant la régulation du transfert et le métabolisme placentaire. Dans son ensemble, ce protocole montre comment des prélèvements coordonnés de mesures du débit sanguin volumétrique, de prélèvements sanguins et d'échantillons tissulaires peuvent être réalisés afin d'obtenir un modèle in vivo intégratif pour l'étude de la physiologie placentaire humaine. Après avoir visionné cette vidéo, un obstétricien devrait bien comprendre comment prélever de manière sûre des échantillons sanguins artério-veineux des deux côtés du placenta humain pendant une césarienne.

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On présente ici un protocole de perfusion vasculaire fœtale ex vivo pour permettre l’administration d’un article d’essai dans la vascularisation maternelle et pour évaluer le transfert placentaire de particules xénobiotiques ou d’agents pharmacologiques en plus des altérations de physiologie placentaire.

Perfusion ex vivo du placenta de rongeurs

Voici un protocole pour la culture d’explants placentaires dans des conditions de débit constant. Cette approche améliore les systèmes traditionnels de culture de villes statiques en permettant la réplication d’environnements physiologiques dynamiques.

Ex Vivo Culture en flux d’explants placentaires - Imiter les conditions dynamiques in utero

Ce protocole décrit la préparation d’explants de tissu placentaire humain cultivés à une interface air-liquide pour l’étude des infections virales.

Ex vivo Culture d’explants placentaires humains pour l’étude de la transmission virale à travers l’interface mère-fœtale

De nombreuses études utilisant des modèles de rats de dérivation gastrique ont été récemment menées pour découvrir les mécanismes physiologiques sous-jacents de Roux-en-Y des opérations de pontage gastrique. Cet article vise à démontrer et discuter des détails techniques et expérimentales de notre modèle de dérivation gastrique du rat publié à comprendre les avantages et les limites de cet outil expérimental.

Roux-en-Y Opération Bypass gastrique chez le rat

Xénogreffes de tumeurs humaines sont vascularisées et infiltrés par des cellules d'origine murine pendant la phase de croissance in vivo. Pour contourner le biais causé par ces cellules contaminantes lors de l'analyse en aval, nous avons développé une méthode permettant l'épuisement complet de toutes les cellules de souris par tri magnétique des cellules.

Appauvrissement des cellules de souris de xénogreffes de tumeurs humaines améliore de manière significative l&#39;analyse en aval des cellules cibles

Découvrez la méthode d'échantillonnage sanguin à quatre vaisseaux pour étudier la physiologie placentaire humaine in vivo. Cette approche intégrative permet d'analyser le transfert et le métabolisme materno-fœtal.

L'approche d'échantillonnage à 4 navires pour les études intégratives de la physiologie du plaidoyer humain

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