Dimensions des tissus conçus alignement Astrocyte réseaux pour récapituler les mécanismes du développement et de faciliter la régénération du système nerveux

Ce protocole vise à guider la fabrication de faisceaux tridimensionnels auto-assemblés, composés de somas et de prolongements astrocytaires alignés longitudinalement, au sein d'une micro-colonne hydrogel de taille micrométrique, destinée à servir de modèle neurobiologique in vitro ou de thérapie neuro-régénérative. Les traumatismes et les maladies neurodégénératives sont particulièrement dommageables pour les patients en raison de la capacité neurogénique limitée dans un environnement inhibiteur qui restreint la régénération au sein du système nerveux central. Les faisceaux astrocytaires conçus permettent de surmonter les limites des stratégies thérapeutiques actuelles en cherchant à reproduire des caractéristiques neuroanatomiques clés ainsi que des mécanismes développementaux médiés par les cellules gliales, afin de favoriser une migration cellulaire ciblée et le guidage des axones.

L'architecture de ces échafaudages astrocytaires s'inspire principalement des prolongements astrocytaires alignés présents dans les tubes gliaux du courant migrant rostral. Commencez par préparer une solution d'agarose à 3 % poids par volume et du DPBS dans un bécher stérile. Maintenez le chauffage et l'agitation afin d'empêcher la solution de se solidifier prématurément.

Insérez une aiguille d'acupuncture dans l'ouverture inférieure du distributeur à pompe. Placez un tube capillaire sur l'aiguille exposée et fixez les deux éléments en insérant une partie du tube dans la section en caoutchouc du cylindre du distributeur. Boucher le cylindre pour terminer l'assemblage.

Transférez un millilitre d'agarose liquide à la surface d'une boîte de Pétri vide. En pinçant le bouchon en caoutchouc du distributeur à poire, insérez une extrémité du tube capillaire dans l'agarose, puis relâchez la pression sur le bouchon afin d'aspirer l'agarose dans le tube. Placez les ensembles poire, tube et aiguille sur une boîte de Pétri et laissez l'agarose durcir à l'intérieur des tubes capillaires pendant 5 minutes.

Ensuite, retirez l'aiguille du tube capillaire, en laissant la micro-colonne toujours entourant l'aiguille. Utilisez les extrémités de la pince pour pousser doucement la micro-colonne jusqu'à l'extrémité de l'aiguille, puis tenez l'aiguille au-dessus d'une boîte de Pétri ouverte contenant du DPBS et poussez la micro-colonne dans le DPBS. Pour fabriquer des radeaux micro-colonnaires, qui facilitent la manipulation ultérieure de ces assemblages, commencez par préparer une solution d'agarose à 4 % poids par volume, et maintenez la solution chauffée et agitée.

Utilisez une pince pour déplacer une micro-colonne vers une boîte de Pétri vide. Ensuite, tout en travaillant sous un stéréomicroscope, utilisez un scalpel microchirurgical pour couper les micro-colonnes à la longueur souhaitée, en biseautant les extrémités à un angle de 45 degrés. Après avoir taillé trois autres micro-colonnes, alignez les quatre colonnes en parallèle.

Prélevez avec une pipette 50 microlitres de solution d'agarose à 4 %, puis déposez une ligne de liquide sur le réseau de microcolonnes afin de relier et regrouper les constructions en une embarcation. Laissez refroidir pendant 1 à 2 minutes pour permettre la gélification de l'agarose à 4 %. Ensuite, utilisez une pince fine pour saisir l'embarcation de microcolonnes par le pont d'agarose qui les relie.

Puis transférez-le dans une boîte de Pétri contenant du DPBS. Transférez le bateau à microcolonnes dans une cabine de sécurité biologique et stérilisez-le par exposition à la lumière ultraviolette pendant trente minutes. À l’intérieur d’une cabine de sécurité biologique, préparez une solution de collagène de type 1 de queue de rat à 1 milligramme par millilitre dans le milieu de co-culture.

Puis placez-le sur de la glace. Ajustez le pH de la solution de MEC à l’aide d’un acide ou d’une base selon les besoins, jusqu’à ce que le pH soit stable entre 7,2 et 7,4. Transférez le bateau micro-colonne dans une boîte de Pétri de 35 ou 60 mL à l’aide de pinces.

À l’aide du stéréoscope comme guide, positionner l’embout de 10 mL d’une micropipette à une extrémité de chaque microcolonne et aspirer afin de vider la lumière de DPBS et des bulles d’air. Charger une micropipette P10 avec la solution de collagène. Placer l’embout de 10 mL contre une extrémité de chaque microcolonne, puis délivrer suffisamment de solution pour remplir la lumière.

Ensuite, pipeter un réservoir de matrice extracellulaire à chaque extrémité de la micro-colonne. Une fois toutes les colonnes remplies, ajouter à l’aide d’une pipette du milieu de co-culture en forme d’anneau autour de la boîte de Pétri afin d’éviter que les colonnes ne s’assèchent. Incuber la boîte contenant les micro-colonnes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant au moins une heure afin de favoriser la polymérisation du collagène avant d’ajouter les cellules.

Ensuite, placer la pointe d'une micropipette P10 à une extrémité d'un micro-colonne et transférer environ 5 mL de solution cellulaire dans la lumière pour la remplir. Après avoir positionné toutes les micro-colonnes dans un bac, incuber celui-ci à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 1 heure afin de favoriser l'attachement des astrocytes à la MEC. À la fin de la période d'incubation, remplir délicatement les boîtes contenant les micro-colonnes fixées avec 3 ou 6 mL de milieu de co-culture, selon que les boîtes de Pétri sont de 35 ou 60 mL respectivement.

Conserver les micro-colonnes ensemencées en culture à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone afin de favoriser l'auto-assemblage des faisceaux astrocytaires alignés, qui doivent former une structure groupée en forme de câble après six à dix heures. Une heure après l'ensemencement, les astrocytes présentent une forme sphérique et se dispersent dans toute la structure. Cinq heures après l'ensemencement, les astrocytes commencent l'extension et la contraction de leurs prolongements.

Huit heures après le semis, les astrocytes se sont alignés et ont rétréci. Vingt-quatre heures après le semis, un faisceau dense de prolongements astrocytaires s'est formé dans cet exemple. Ce faisceau astrocytaire complètement formé, 24 heures après le semis, présente l'effet de fermeture éclair, où les extrémités du câble s'attachent à des extrémités distinctes de la paroi de la lumière.

Ce vidéo montre le regroupement en action, de 3 à 10 heures après la mise en culture. Le marquage immunohistochimique des supports astrocytaires démontre l'alignement longitudinal des prolongements astrocytaires. Sur cette image confocale d'un faisceau astrocytaire, le marqueur astrocytaire GFAP est détecté.

Et les noyaux apparaissent en bleu. Ce grossissement plus élevé du faisceau permet de visualiser l'architecture cytoplasmique des astrocytes au sein des micro-colonnes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure de fabriquer des échafaudages vivants composés de faisceaux d'astrocytes alignés longitudinalement, présentant une architecture cytoplasmique inspirée du vivant, le tout inclus dans une matrice biomatériaux.

À la suite de cette procédure, une stratégie de transplantation peut être conçue afin de délivrer les faisceaux d'astrocytes avec ou sans enrobage en biomatériau vers un tissu cérébral lésé, pour favoriser une migration cellulaire dirigée en provenance de régions neurogéniques et agir comme un guide dans le microenvironnement limitant du système nerveux central. De plus, cette technique peut être étendue en tant que plateforme de modélisation biofidèle des phénomènes neurobiologiques médiés par la glie, grâce à la reproduction de l'environnement tridimensionnel natif et au contrôle expérimental inhérent aux systèmes in vitro.