Dimensions des tissus conçus alignement Astrocyte réseaux pour récapituler les mécanismes du développement et de faciliter la régénération du système nerveux

Ce protocole vise à guider la fabrication de faisceaux tridimensionnels auto-assemblés de somates astrocytaires alignés longitudinalement et de processus à l’intérieur d’une micro-colonne d’hydrogel de la taille d’un micron pour une utilisation comme modèle neurobiologique in vitro ou comme thérapie neurorégénérative. Les traumatismes et les maladies neurodégénératives sont particulièrement préjudiciables aux patients en raison de la capacité neurogène restreinte dans un environnement inhibiteur qui limite la régénération dans le système nerveux central. Les faisceaux astrocytaires modifiés répondent aux limites des stratégies de traitement actuelles en tentant de reproduire les principales caractéristiques neuroanatomiques et les mécanismes de développement médiés par la glie pour favoriser la migration cellulaire ciblée et la recherche de voies axonales.

L’architecture de ces échafaudages astrocytaires s’inspire principalement des processus astrocytaires alignés dans les tubes gliaux du flux migratoire rostral. Commencez par préparer une solution d’agarose à 3 % en poids par volume et du DPBS dans un bécher stérile. Maintenez le chauffage et l’agitation pour éviter que la solution ne se solidifie prématurément.

Insérez une aiguille d’acupuncture dans l’ouverture inférieure du distributeur de poires. Placez un tube capillaire sur l’aiguille exposée et fixez les deux en introduisant une partie de celle-ci dans la section en caoutchouc du cylindre du distributeur de bulbes. Boucher le cylindre pour terminer l’assemblage.

Transférez un millilitre d’agarose liquide à la surface d’une boîte de Pétri vide. Tout en pinçant le capuchon en caoutchouc du distributeur d’ampoules, insérez une extrémité du tube capillaire dans l’agarose et relâchez la pression sur le capuchon pour aspirer l’agarose dans le tube. Placez le bulbe, le tube et l’aiguille sur une boîte de Pétri et laissez l’agarose se solidifier à l’intérieur des tubes capillaires pendant 5 minutes.

Ensuite, retirez l’aiguille du tube capillaire, en laissant la micro-colonne toujours autour de l’aiguille. Utilisez les pointes des préceps pour pousser la micro-colonne jusqu’à l’extrémité de l’aiguille, puis tenez l’aiguille au-dessus d’une boîte de Pétri ouverte contenant du DPBS et poussez la micro-colonne dans le DPBS. Pour fabriquer des bateaux à micro-colonnes, qui facilitent la manipulation ultérieure de ces constructions, commencez par préparer une solution d’agarose à 4 % en poids par volume, et maintenez la solution chauffée et agitée.

À l’aide d’une pince, déplacez une micro-colonne vers une boîte de Pétri vide. Ensuite, tout en travaillant sous un stéréoscope, utilisez un micro-scalpel pour couper les micro-colonnes à la longueur souhaitée, avec les extrémités coupées à un angle de 45 degrés. Après avoir coupé trois autres micro-colonnes, alignez les quatre colonnes en parallèle.

Chargez une pipette de 50 microlitres de solution d’agarose à 4 % et distribuez une ligne de liquide sur le réseau de micro-colonnes pour connecter et regrouper les constructions dans un bateau. Laisser refroidir 1 à 2 minutes pour permettre la gélification de l’agarose à 4 %. Ensuite, à l’aide d’une pince fine, saisissez le bateau à micro-colonnes par le pont d’agarose de liaison.

Et déplacez-le dans une boîte de Pétri contenant du DPBS. Transférez le bateau à micro-colonne dans une enceinte de biosécurité et stérilisez-le en l’exposant à la lumière ultraviolette pendant trente minutes. À l’intérieur d’une enceinte de biosécurité, préparez une solution de 1 milligramme par millilitre de collagène de queue de rat de type 1 dans un milieu de co-culture.

Et puis placez-le sur de la glace. Ajustez le pH de la solution ECM avec de l’acide ou de la base si nécessaire jusqu’à ce que le pH soit stable dans la plage de 7,2 à 7,4. Transférez le bateau à micro-colonne dans une boîte de Pétri de 35 ou 60 ml à l’aide d’une pince.

À l’aide du stéréoscope, placer l’extrémité de 10 mL d’une micropipette à une extrémité de chaque microcolonne et aspirer pour vider la lumière des DPBS et des bulles d’air. Chargez une micropipette P10 avec la solution de collagène. Placez l’embout de 10 ml contre une extrémité de chaque micro-colonne et déposez suffisamment de solution pour remplir la lumière.

Ensuite, pipetez un réservoir d’ECM à chaque extrémité de la micro-colonne. Une fois que toutes les colonnes ont été remplies, pipetez le milieu de coculture en anneau autour de la boîte de Pétri pour éviter que les colonnes ne se dessèchent. Incuber la boîte contenant les micro-colonnes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant au moins une heure pour favoriser la polymérisation du collagène avant d’ajouter des cellules.

Ensuite, placez l’extrémité d’une micropipette P10 à l’une des extrémités d’une microcolonne et transférez environ 5 ml de solution cellulaire dans la lumière pour la remplir. Après avoir placé toutes les micro-colonnes dans un bateau, incubez-le à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 1 heure pour favoriser la fixation des astrocytes à l’ECM. Après la période d’incubation, remplissez soigneusement les boîtes contenant les micro-colonnes assises avec 3 ou 6 ml de milieu de coculture, pour des boîtes de Pétri de 35 ou 60 ml respectivement.

Maintenez les micro-colonnes plaquées et la culture à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pour favoriser l’auto-assemblage de l’alignement des faisceaux astrocytaires, qui devraient former une structure en forme de câble après six à dix heures. Une heure après le placage, les astrocytes sont de forme sphérique et se dispersent dans toute la construction. Cinq heures après le placage, les astrocytes amorcent l’extension et la contraction du processus.

Huit heures après le placage, les astrocytes se sont alignés et se sont contractés. Dans les 24 heures suivant le placage, un faisceau dense de processus astrocytaires s’est formé dans cet exemple. Ce faisceau astrocytaire entièrement formé, 24 heures après le placage, montre l’effet de fermeture éclair, où les extrémités du câble se fixent à des extrémités distinctes de la paroi de la lumière.

Cette vidéo montre l’empaquetage en action, 3 à 10 heures après le placage. L’immuno-marquage des échafaudages astrocytaires démontre l’alignement longitudinal des processus astrocytaires. Dans cette image confocale d’un faisceau astrocytaire, le marqueur astrocytaire GFAP est lu.

Et les noyaux sont visibles en bleu. Ce grossissement plus élevé du faisceau permet de visualiser la cyto-architecture des astrocytes à l’intérieur des micro-colonnes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure de fabriquer des échafaudages vivants constitués de faisceaux astrocytaires alignés longitudinalement avec une cytoarchitecture d’inspiration biologique au sein d’un enrobage de biomatériau.

À la suite de cette procédure, une stratégie de transplantation peut être conçue pour administrer les faisceaux astrocytaires avec ou sans l’enveloppe de biomatériau dans le tissu cérébral lésé afin de favoriser la migration cellulaire dirigée des régions neurogènes et d’agir sur le guidage vers le microenvironnement limitant du SNC. De plus, cette technique peut être étendue en tant que phénomène neurobiologique médié par la glie de la plate-forme de modélisation biofidélique bénéficiant du mimétisme de l’environnement tridimensionnel natif et du contrôle expérimental inhérent des systèmes in vitro.