Tuning dans la bande Hippocampal Theta In Vitro: Méthodologies pour l'enregistrement à partir du circuit de Septohippocampal de Rongeur isolé

Ici, nous présentons un protocole pour l'enregistrement du réseau neuronal rythmique theta et les oscillations gamma à partir d'une préparation isolée de l'hippocampe entier. Nous décrivons les étapes expérimentales de l'extraction de l'hippocampe aux détails des enregistrements de pince à lames, à l'unité et à l'ensemble des cellules, ainsi qu'à la stimulation optogénétique du rythme theta.

L’objectif général de ce protocole est de présenter des procédures pour extraire l’ensemble de la préparation hippocampique et d’explorer la génération de réseau neuronal rythmique à l’aide d’enregistrements de champ, unitaires et patch-clamp ainsi que de stimulation optogénétique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences de l’apprentissage et de la mémoire en facilitant grandement l’étude des mécanismes cellulaires et synaptiques qui sous-tendent les oscillations rythmiques dans l’hippocampe. Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise une préparation optimisée pour étudier les circuits dans des oscillations détaillées, qui jouent un rôle crucial dans l’information de la mémoire dépendante de l’hippocampe.

Pour commencer cette procédure, placez le cerveau sur la boîte de dissection en position verticale, retirez le cervelet avec une lame de rasoir, puis coupez le cerveau en deux le long du plan sagittal moyen et ramenez les deux hémisphères isolés dans la chambre de maintien. Ensuite, placez le cerveau unique hémisecté à la verticale sur la boîte de dissection. Faites pivoter la parabole jusqu’à ce que les structures sagittales moyennes fassent face à l’expérimentateur et que le contour intégré du complexe septal soit visible sous la forme d’une fine couche de tissu en forme de poire à l’intérieur du thalamus.

Ensuite, insérez une spatule enduite sous le septum et déplacez la pointe vers le bas jusqu’à ce que la boîte de dissection soit atteinte, coupez cordialement les fibres qui relient cordialement la zone septale. Maintenant, répétez la même opération le long du bord antérieur du septum et coupez les fibres qui se connectent à la partie frontale du cerveau. Avec la spatule tenant légèrement la partie interne du cortex juste au-dessus de l’hippocampe en position verticale, utilisez la microspatule pour tirer doucement vers le bas les noyaux thalamique, hypothalamique et le reste du tronc cérébral.

Ensuite, utilisez la spatule pour couper et retirer le tissu retiré. Ensuite, insérez la spatule enduite dans le ventricule latéral sous l’extrémité rostrale de l’hippocampe dorsal. Tenez la spatule horizontalement, alignée avec le plan mi-sagittal du cerveau hémiqué et faites-la glisser à travers le contour lisse des parois ventriculaires, jusqu’à ce que la pointe émerge cordialement.

Tenez la spatule sous l’hippocampe et appuyez légèrement sur les fibres de connexion le long de la couche intérieure où l’hippocampe se joint au cortex sus-jacent, puis appliquez la microspatule sur le côté externe de cette couche et pressez-la contre la spatule enduite pour trancher les fibres de connexion. Pour terminer l’extraction, tournez la coupelle de dissection et insérez la spatule enduite sous l’hippocampe ventral. Tenez légèrement l’hippocampe avec la spatule et coupez les connexions endocriniennes à l’aide d’un mouvement de tranchage contre la spatule.

Une fois l’isolement terminé, gardez l’hippocampe au repos sur la parabole et ajoutez une goutte de solution de saccharose glacée pour le garder au frais. Coupez soigneusement le cortex et les fibres restants et séparez l’hippocampe du septum en appliquant doucement une lame de rasoir sur le fornix. Après cela, transférez la préparation dans une solution de saccharose à température ambiante et laissez-la récupérer pendant 15 à 30 minutes avant de la transférer dans la chambre d’enregistrement.

Dans cette étape, configurez le système de perfusion alimenté par gravité pour permettre une vitesse élevée continue en flux d’ACSF oxygéné. Ensuite, arrêtez le flux ACSF et transférez l’hippocampe dans la chambre d’enregistrement, à l’aide de l’extrémité large d’une pipette en verre. Laissez la préparation saturée de saccharose couler et se déposer au fond.

Placez la préparation au centre de la chambre d’enregistrement, avec la surface lisse de CA1 et le subiculum sur le dessus. Stabilisez l’hippocampe avec de petits poids des extrémités septales et temporales et redémarrez le flux ACSF. Dans cette procédure, abaissez l’électrode LFP à la surface de l’hippocampe.

Faites avancer l’électrode LFP à travers la couche de paramètres et observez l’augmentation de l’activité de pic extracellulaire à mesure qu’une décharge unitaire des neurones individuels est détectée. Abaissez davantage l’électrode et notez que les pointes commencent à s’estomper à nouveau lorsque la pointe traverse le radiatome. Observez qu’une oscillation du réseau clairement visible dans la gamme de fréquences thêta devient apparente et atteint son amplitude maximale lorsque l’emplacement d’enregistrement est abaissé à travers le radiatome.

Pour tester les propriétés spatiales des oscillations thêta spontanées dans la région CA1, placez une deuxième électrode LFP dans un site CA1 et observez que les oscillations thêta CA1 se synchronisent sur de grandes distances. Pour tester les propriétés des oscillations thêta à travers les couches de l’hippocampe, laissez une électrode LFP de référence dans un site de radiatome CA1. En partant juste au-dessus de la couche orienne, abaissez une deuxième électrode dans la couche de cellule de paramètre et à travers le radiatome.

Observez une inversion progressive du signal LFP sur la couche de paramètres. Pour tester les oscillations gamma et le couplage thêta gamma dans l’hippocampe intact, placez une électrode de champ au bord du subiculum CA1 et abaissez-la jusqu’à ce qu’elle se trouve à l’interface entre le paramètre et les couches moléculaires. À ce niveau, un potentiel de champ affichant des oscillations gamma claires avec des changements d’amplitude que la phase verrouillée sur le rythme thêta local peut être enregistré.

Ensuite, ajustez l’échelle pour observer l’échelle de temps lente du couplage thêta gamma. Notez que les sursauts gamma se produisent dans deux bandes de fréquences distinctes qui peuvent être révélées par bande pendant le signal LFP en cours, dans la gamme gamma lente et rapide. Pour l’enregistrement par patch clamp de cellules entières pendant les oscillations thêta de l’hippocampe in vitro, utilisez la microscopie vidéo à fluorescence avec un grossissement faible et élevé pour visualiser les interneurones positifs tdTomato situés près de la surface d’une préparation hippocampique à partir d’une souris mâle PV.

Sous une vue à faible grossissement de l’hippocampe, placez une électrode LFP dans le subiculum CA1 pour surveiller les oscillations thêta tout en vous préparant aux expériences de patch clamp. Ensuite, passez à un grossissement de 40x et immergez l’objectif sur la région cible. Abaissez-le jusqu’à ce que les couches supérieures deviennent visibles, sous la microscopie à fluorescence, sélectionnez la cellule photovoltaïque fluorescente et approchez-la avec une pipette patch remplie de solution intercellulaire standard.

Une fois dans la configuration de la cellule entière, examinez les propriétés physiologiques de la cellule PV identifiée lors des oscillations spontanées de l’hippocampe. Observez l’enregistrement du potentiel de la membrane intercellulaire des cellules PV qui sont caractérisées par un comportement de pic rapide et des rafales de potentiels d’action synchronisés avec le rythme thêta du subiculum CA1 en cours. Dans cette procédure, placez une électrode LFP dans la zone du subiculum CA1 et patchez une cellule de paramètre voisine dans l’hippocampe isolé d’une souris, exprimant l’opcine excitatrice sensible à la lumière bleue, CHR2 dans les interneurones PV.

Placez un guide de lumière à fibre optique au-dessus de la préparation de l’hippocampe et centrez-le sur la région enregistrée. Utilisez la lumière bleue d’une source LED pour la stimulation génétique optique, qui consiste en des impulsions lumineuses de 10 à 20 millisecondes ou des commandes de tension d’onde de péché délivrées à des fréquences thêta. Dans la pince de courant, caractérisez l’activité de la cellule enregistrée lors des oscillations thêta spontanées.

Ensuite, démarrez le protocole de stimulation et enregistrez les réponses lumineuses. Observez que les oscillations de champ et l’activité synaptique ainsi que le neurone enregistré deviennent de plus en plus synchronisés au cours de la stimulation optogénétique et que la stimulation rythmique des cellules PV entraîne un contrôle robuste de la fréquence et de la puissance des oscillations thêta. On voit ici l’activité électrophysiologique enregistrée à partir d’une cellule de paramètres pendant les oscillations thêta.

Les traces de pince de courant montrent une décharge spontanée mais non rythmique au repos et des potentiels post-synaptiques inhibiteurs qui n’étaient pas clairement synchronisés avec l’oscillation LFP qui émergeait lentement. Les enregistrements par pince de tension montrent que les courants post-synaptiques inhibiteurs correspondants ont un potentiel d’inversion d’environ moins 70 millivolts. Et ici, c’est l’activité électrophysiologique enregistrée à partir d’un interneurone PV fluorescent à impulsion rapide pendant les oscillations thêta.

Dans la pince de courant, cette cellule se déclenchait spontanément au repos et était fortement entraînée par des potentiels post-synaptiques excitateurs rythmiques qui étaient verrouillés par phase avec l’oscillation stable LFP. Dans les enregistrements par pince de tension, le potentiel d’inversion du courant post-synaptique excitateur était d’environ zéro millivolts. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à trois heures, tout en tentant cette procédure, il est important de se rappeler d’oxygéner vigoureusement une solution et d’utiliser un système de perfusion permettant un écoulement rapide mais régulier de l’ACSF armé sur la préparation pendant les enregistrements électrophysiologiques.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la stimulation optogénétique ou le silençage de populations de types cellulaires spécifiques, peuvent être utilisées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’identification des sous-types cellulaires qui forment les oscillateurs thêta dans l’hippocampe. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer systématiquement la dynamique des oscillations thêta à travers l’axe temporel septal de l’hippocampe in vitro. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’extraire une préparation complète de l’hippocampe afin d’explorer la fonction des réseaux neuronaux rythmiques à l’aide d’enregistrements de terrain, d’unités et de patchs clamps, ainsi que de la stimulation optogénétique.