Synthèse de chimio-enzymatique des N- glycans pour le développement de la baie et anticorps anti-VIH de profilage

L’objectif global de cette méthodologie est de développer une approche chimio-enzymatique modulaire pour la synthèse des N-glycanes en construisant une nouvelle puce à glycanes sur une lame de verre recouverte d’oxyde d’aluminium pour détecter la liaison des anticorps anti-VIH aux hétéroglycanes. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés en glycobiologie pour l’identification de glycanes spécifiques aux virus cellulaires pour une grande partie du développement. Le principal avantage de cette méthode est de détecter une liaison faible et d’identifier un mélange de sucres qui se lient à une protéine telle qu’un anticorps de patient atteint du VIH.

Les implications de cette technique s’étendent au diagnostic des infections grippales, car les cellules épithéliales des voies respiratoires humaines sont courantes lorsque les symptômes sont courants. Par conséquent, le glycoarray sera un outil idéal pour déterminer la spécificité des sous-types sauvages. Bien que cette méthode puisse fournir à l’intérieur des spécificités glycanes des anticorps anti-VIH, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que le diagnostic de divers cancers basés sur le modèle de liaison des anticorps sériques humains envers les antigènes sériques spécifiques de l’homme imprimés sur la surface.

Pour commencer cette procédure, ajoutez 2 à 5 micromoles de glycane préalablement préparé et une fiole à fond rond de cinq millilitres. Ajoutez un barreau magnétique dans le ballon et couvrez-le d’un septum en caoutchouc. Ajoutez 400 microlitres de DMF fraîchement séché et 10 à 25 micromoles de l’acide phosphonique dans le flacon.

Ensuite, remuez le mélange réactionnel à 800 tr/min pendant cinq heures. Une fois la réaction terminée, évaporez le solvant à l’aide d’un évaporateur rotatif à une pression de vide de cinq à 10 millibars et à 40 degrés Celsius. Ensuite, dissolvez le mélange réactionnel séché et 0,5 millilitre d’eau et chargez-le sur un lit de gel de polyacrylamide.

Éluer les produits à l’aide d’eau et recueillir des fractions d’un à deux millilitres. Pour vérifier les fractions collectées par CCM, repérez chaque fraction sur une plaque CCM et trempez la plaque dans 0,25 molaire de molybdate de cérium et d’ammonium. Chauffez la plaque tachée avec une plaque chauffante pour visualiser le produit.

Après avoir combiné le produit contenant des fractions et congelé la solution, biofoliez pour obtenir le produit souhaité sous forme de poudre blanche. Ensuite, dissolvez le produit séché dans deux millilitres d’eau et ajoutez de l’hydroxyde de palladium. Fixez un ballon contenant de l’hydrogène dans le ballon et remuez le mélange réactionnel à 800 tr/min pendant 15 heures sous atmosphère d’hydrogène.

Une fois la réaction terminée, filtrez le mélange à travers un lit de célite et lavez-le avec deux millilitres de méthanol et deux millilitres d’eau distillée déminéralisée. Ensuite, évaporez le solvant à l’aide d’un évaporateur rotatif à une pression de vide de 300 millibars et 40 degrés Celsius. Ensuite, dissolvez le mélange cru dans environ un millilitre d’eau et chargez-le sur un lit de gel de polyacrylamide.

Éluez le produit avec de l’eau et recueillez des fractions d’un à deux millilitres. Après avoir combiné le produit contenant des fractions et congelé la solution, biofoliez pour obtenir le produit souhaité sous forme de poudre blanche. Une fois le produit sec, caractérisez-le par spectroscopie de masse en utilisant l’oxyde de deutérium comme solvant.

Pour l’anodisation de surface, réglez un incubateur à température contrôlée à quatre degrés Celsius. Transférez ensuite une solution aqueuse d’acide oxalique de 0,3 molaire préalablement préparée dans un bécher de 500 millilitres contenant une barre d’agitation magnétique. Placez une tige de platine de 10 centimètres de long comme cathode dans la solution.

Continuez à remuer l’acide oxalique à 300 tr/min tout au long du processus d’anodisation. Dans le logiciel de traçage de laboratoire, cliquez sur le bouton de configuration, puis sur le choix de la fonction Tension de balayage. Réglez la tension de démarrage et d’arrêt sur 25,8 volts.

Le nombre de points est supérieur à 100, la conformité à un et le délai de balayage est de 1200 millisecondes. Cliquez ensuite sur OK. Fixez une glissière en verre recouvert d’aluminium vers la cathode.

Cliquez sur le bouton Exécuter le test et observez la mesure actuelle. Après l’anodisation de surface, lavez soigneusement la lame de verre avec de l’eau double distillée et purgez-la avec de l’azote gazeux. Conservez la lame de verre dans une chambre à 30 % d’humidité relative jusqu’à nouvel ordre.

Pour la fabrication, préparez des solutions de 100 microlitres de tous les glycanes monovalents dans de l’éthanol glycol à une concentration de 10 millimolaires. Diluez les solutions de glycanes avec un tampon d’impression pour obtenir 100 solutions micromolaires. Pour l’étude sur l’hétéroligand, ajoutez cinq microlitres de MAN-5 Glycane à cinq microlitres de chaque solution de glycane.

Transférez les glycanes préparés dans la microplaque à 384 puits pour l’étape d’impression de microarray. Après avoir inséré une microplaque sur la technologie de l’imprimante, imprimez des microréseaux à l’aide d’une broche robotisée en déposant 0,6 nanolitre de solutions de glycanes sur chaque lame de verre recouverte d’aluminium. Préparez ensuite 70 microlitres d’anticorps primaires PG-9 et un tampon PTSB contenant 3 % de BSA.

Préparez ensuite 120 microlitres d’anticorps fluorescent secondaire Donkey et d’immunoglobuline G anti-humaine et un tampon PBST contenant 3 % BSA dans l’obscurité. Mélangez PG9 et l’anticorps fluorescent secondaire dans un rapport de 1:1. Ensuite, incubez les anticorps prémélangés pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.

Après l’incubation, chargez une lame en verre recouvert d’aluminium dans la chambre d’incubation de la lame, qui est divisée en 16 puits. Transférez 100 microlitres d’anticorps prémélangés dans le réseau de glycanes. Après une incubation à quatre degrés Celsius pendant 16 heures, retirez les anticorps prémélangés de la matrice de glycanes à l’aide d’une pipette, puis retirez la chambre d’incubation de la lame.

Lavez la lame de verre dans un tampon PBST et de l’eau déminéralisée. Ensuite, essorez la lame de verre à 2000 fois la gravité. Ensuite, ouvrez le logiciel d’analyse d’images de microarray.

Insérez la lame de verre séché dans le scanner de réseau avec les caractéristiques du réseau vers le bas. Cliquez sur le menu des paramètres. Réglez la résolution de l’image sur cinq micromètres par pixel.

Et réglez la longueur d’onde à 635 nanomètres avec PMT 450 et la puissance à 100 %Cliquez sur le bouton de balayage pour commencer à imager la lame. Enfin, cliquez sur l’icône du fichier pour enregistrer l’image numérisée au format TIF pour l’analyse de l’image. Dans cette étude, un large éventail de N-glycanes a été synthétisé à l’aide d’une stratégie enzymatique de chimiothérapie modulaire.

Pour démontrer l’efficacité de la stratégie, une structure isométrique biantennaire a été synthétisée par des méthodes chimioenzymatiques. La galactosylation enzymatique du disaccharide 1 suivie de la fucosylation du trisaccharide 2 a permis d’obtenir le tétrasaccharide 3 souhaité. Par satylation et réduction des modifications finales des blocs de construction deux et trois, permis de désirer les molécules quatre et cinq.

La troisième O-glycosalyation stéréosélective du module quatre du trisaccharide six a fourni l’hexasaccharide sept. La déprotection et la réaction avant le module cinq ont donné le dédécasaccharide, neuf. La détection globale a permis d’obtenir le glycane 10 qui a été caractérisé par l’enimar et la spectroscopie de masse.

Les glycanes contenant une queue de pentylamine à l’extrémité réductrice ont été modifiés avec des liants d’acide phosphonique et fixés à la surface recouverte de verre d’aluminium par la chimie des phospinides. L’anticorps neutralisant largement le VIH-1 PG9 a été testé pour sa spécificité glycane à l’aide de réseaux d’homo et d’hétéroglycanes afin de démontrer pour la première fois son inétéraction avec des hétéroglycanes adjacents dans la boucle V1/V2 de la surface de HIV1 PG120. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 24 heures de l’immobilisation du glycane à l’analyse bêta si elle a été réalisée correctement.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser une lame de verre recouverte d’aluminium fraîchement anodisé pour Glycane 10. Pour la pose de cette procédure sont les lames med techs. La détermination de la constante corporelle peut être effectuée afin de quantifier les interactions de liaison entre les glucides et les protéines d’intérêt.

Après le développement de cette technique, elle a ouvert la voie aux chercheurs pour mieux comprendre le rôle des glucides dans les maladies infectieuses au Kenya et aider à développer de nouvelles thérapies contre les maladies. N’oubliez pas que travailler avec des agents toxiques peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de vêtements, de lunettes et de masques doivent toujours être prises lors de la réalisation d’expériences.