L'isolement et la culture des neurones de la moelle épinière chez les souris néonatales

L’objectif global de cette procédure est de pouvoir isoler de manière répétée et cohérente les neurones de la moelle épinière qui peuvent être utilisés dans une variété d’expériences. Cette méthode peut nous permettre de mieux comprendre la biologie des neurones de la moelle épinière et, espérons-le, de comprendre leur réponse à une variété de facteurs de stress. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’isoler un nombre important de neurones, ce qui permet à ces neurones d’être utilisés dans une grande variété d’expériences.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car l’étape de trituration, où les neurones sont isolés mécaniquement du tissu, nécessite un certain temps de maîtrise, afin d’assurer une isolation saine des neurones, sans les tuer. Pour commencer cette procédure, séparez la tête du corps des bébés souris euthanasiés à l’aide de ciseaux. Ensuite, stabilisez la queue et les bras sur la table d’intervention avec le côté dorsal vers le haut.

Ensuite, coupez la peau à l’aide des ciseaux à iris incurvés. Après cela, coupez la moelle épinière de la région lombaire, juste au-dessus des hanches, puis coupez les deux côtés du thorax pour le séparer du corps. Lavez les échantillons séquentiellement dans trois boîtes de Pétri de 10 centimètres, contenant cinq millilitres de PBS stérilisé pendant 10 secondes chacune, pour éliminer l’excès de tissu.

Par la suite, insérez une aiguille de calibre 22 et une seringue remplie de cinq millilitres de PBS stérilisé dans l’extrémité caudale de la colonne vertébrale et rincez le crâne, permettant au cordon de sortir dans une quatrième boîte de Pétri. Transférez la moelle épinière dans un tube de 15 millilitres avec cinq millilitres de HABG sur de la glace. Évitez d’écraser la moelle épinière et répétez les procédures pour le reste des chiots.

Idéalement, ce processus ne devrait pas prendre plus de 30 minutes pour un groupe de chiots, afin d’assurer l’isolement des neurones. Pour préparer le gradient de densité, préparez chacune des quatre couches dans quatre tubes de 15 millilitres. Ensuite, ajoutez un millilitre de chaque couche dans un nouveau tube de 15 millilitres.

Commencez par la première couche en bas et ajoutez séquentiellement, jusqu’à ce que vous atteigniez la quatrième couche en haut. Évitez de déranger les couches lors de l’ajout et de tout mouvement vigoureux qui pourrait provoquer un mélange. Ensuite, ajoutez le milieu de digestion au tissu haché.

Placez l’échantillon dans un agitateur dans le bain-marie à 30 degrés Celsius. Ensuite, retirez le mouchoir du bain-marie et laissez-le reposer pendant quelques minutes. Pour effectuer la trituration, aspirez l’excès de milieu de digestion.

Suspendez le tissu dans deux millilitres de HABG, à l’aide d’une pipette à calibre étroit, triturez 10 fois en 45 secondes et évitez d’introduire de l’air, car cela diminuerait considérablement le rendement viable. La trituration est l’une des étapes les plus critiques de la procédure, le tissu doit être soigneusement aspiré et vidé de la pipette polie au feu, en évitant l’excès de vigueur qui peut entraîner la mort neuronale ou être trop doux, ce qui entraînerait un faible rendement. Ensuite, aspirez les deux premiers millilitres du surnageant et transférez-les dans un nouveau tube de 15 millilitres étiqueté collect.

Répétez les procédures de collecte deux fois de plus, pour obtenir six millilitres de surnageant. Ensuite, transférez lentement le contenu du tube de collecte dans le tube dégradé préparé précédemment. Éviter la perturbation de la pente.

Pour purifier les neurones, centrifugez le tube à gradient pendant 15 minutes à 800 fois G, à 22 degrés Celsius. Récupérez les couches souhaitées et transférez-les dans un nouveau tube de 15 millilitres. Pour une isolation neuronale de la plus grande pureté, prélevez la couche trois.

Pour plus de rendement avec moins de pureté, récupérez les couches deux à trois. Ensuite, diluez le gradient de densité en ajoutant cinq millilitres de HABG aux couches nouvellement collectées. Centrifugez-le, à 200 fois G pendant deux minutes à 22 degrés Celsius.

Au bout de deux minutes, jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans cinq millilitres de HABG, en effleurant le palais. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 200 fois G pendant deux minutes à 22 degrés Celsius à nouveau. Ensuite, jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans trois millilitres de milieu neurobasal, en effleurant le palais.

Après cela, déterminez la densité cellulaire à l’aide d’un compteur de cellules, puis diluez la suspension à 300 000 cellules par millilitre de milieu neurobasal. Agitez doucement pour répartir les cellules et la solution et ajoutez un millilitre de l’échantillon dans chaque puits dans les plaques codées à 24 puits. On voit ici l’évolution temporelle des neurones en culture, après l’ensemencement dans les puits.

Les cellules commencent généralement à adhérer à la surface dans les deux premières heures. Les axones commenceront à germer dans les premières 24 à 48 heures, les connexions entre les différents neurones et la culture atteignent généralement leur maturité à sept jours, après quoi des expériences sont généralement menées sur les neurones. Dans cette figure, la coloration nucléaire est représentée en bleu, avec la coloration cytoplasmique en vert et ici, la protéine cyctosquelettique du neurone associée à la protéine microtubulaire deux est colorée, montrant les contours et les projections axonales des neurones après une semaine de culture.

Les images fusionnées sont combinées, montrant l’abondance relative des neurones. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre heures, si elle est correctement exécutée. Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs, étudiant la physiologie et la pathologie de la moelle épinière, pour explorer le comportement des neurones de la moelle épinière dans des conditions normales et en réponse à des agents pharmacologiques ou à des facteurs de stress tels que la privation d’oxygène et de glucose, imitant simplement nos procédures chirurgicales.

Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important d’éviter de retarder ou de prolonger l’une des étapes visant à prévenir l’isolement des neurones malsains. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler des neurones sains et viables de la moelle épinière de souris néonatales qui peuvent être cultivés dans des milieux sans sérum.