Name: Le sauvetage et la caractérisation du virus recombinant à partir dun nouveau clone infectieux du virus Zika du monde (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Découvrez la récupération du virus Zika infectieux à partir d'un clone d'ADN bicistronique. Cette méthode stable permet d'étudier la flavivirologie et le développement vaccinal.

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Les auteurs souhaitent remercier Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic et Claudia Rückert pour leur aide dans la caractérisation du virus dérivé du clone. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions de l&#39;Institut national d&#39;allergie et de maladies infectieuses, NIH sous les subventions AI114675 (BJG) et AI067380 (GDE).

1. Transformer et récupérer des plasmides de clones infectieux <ol><li> Transformez les deux plasmides (séparément) en utilisant un protocole de transformation commercial ( p. Ex . NEB 5 Minute Transformation Protocol) avec quelques modifications. Les deux plasmides contiennent un gène codant pour la résistance à l&#39;ampicilline, utilisent donc l&#39;ampicilline ou la carbénicilline pour la sélection. La carbénicilline est préférée, car elle est plus stable. <ol><li> Enlevez les cellules (voir la table des matériaux) à partir de un congélateur -80 ° C et dégonflez sur de la glace pendant 5 à 10 minutes. Préchauffer le lysogénie de bouillon (LB) (contenant 10 g / L de NaCl et 25 μg / mL de carbénicilline, appelées LB-carb) et le bouillon avec la répression des catabolites (SOC (sans antibiotiques) - à venir avec les cellules) à 37 ° C. </li><li> Ajouter entre 100 pg-10 ng dans 1 μL d&#39;ADN plasmidique à un tube contenant 50 μL de cellules compétentes; Mélanger doucement en faisant glisser le tube. </li><li> Incuber les tubes sur de la glace pendant 5 min. </li><li> Tubes de choc thermique à 42 ° C pendant 30 sDans un bain-marie. Retourner à la glace pendant 2 minutes immédiatement après un choc thermique. </li><li> Pipeter 950 μL de température ambiante dans chaque tube et mélanger par pipettage. Étaler 100 μL du mélange bactérien sur une plaque de LB-carb et incuber pendant une nuit à 37 ° C (environ 12-14 h). </li></ol></li><li> Retirer les plaques de l&#39;incubateur à 37 ° C après 12-14 heures d&#39;incubation. Placez les plaques dans un tiroir sombre à température ambiante pour permettre aux colonies de continuer à croître (environ 8-9 h). </li><li> En utilisant 5 mL de bouillon Terrific (TB, contenant 25 μg / mL de carbénicilline, appelé TB-carb), développez 5-10 petites colonies pour chaque plasmide pendant une nuit à 30 ° C dans un agitateur bactérien (environ 14-16 h). NOTE: Les petites colonies sont un indicateur que le plasmide est intact; Les colonies contenant des plasmides contenant des deletions, des réarrangements ou des mutations (appelées ici événements d&#39;instabilité) se développeront plus rapidement et seront donc plus importantes. Par conséquent, on devrait essayer de choisir les plus petites colonies sur la plaque, en particulier nonT sélectionner les plus grandes colonies présentes. Certaines colonies de taille moyenne peuvent également être sélectionnées pour l&#39;exhaustivité. La température inférieure utilisée réduit la probabilité que les cellules dépassent (OD 600 supérieure à 0,6-0,8). Comme la plupart des chercheurs effectuent une croissance du jour au lendemain, cela permet un plus grand contrôle et une réduction des chances de surcroît. </li><li> Vérifier les cultures liquides pour la turbidité (environ OD 600 de 0,6-0,8). Placez tous les tubes turbides à 4 ° C et permettez à d&#39;autres tubes de devenir turbides en augmentant pendant plus longtemps. REMARQUE: Ne pas cultiver des bactéries à des valeurs de OD 600 supérieures à celles recommandées, car des événements d&#39;instabilité plasmidique peuvent survenir. </li><li> Extraire l&#39;ADN du plasmide à partir de bactéries avec un kit de miniprep de plasmide commercial (voir la table des matériaux). Eluire dans 15 μL de tampon d&#39;élution préchauffé (à 70 ° C dans un bloc chauffant). Laisser le tampon d&#39;élution incuber sur la colonne pendant 5 min avant la centrifugation. REMARQUE: conserver au moins 1 mL de cette culture initiale à 4 ° C pourUtilisation ultérieure dans l&#39;étape suivante. </li><li> Digérer 10 μL des plasmides récupérés pour évaluer si les événements d&#39;instabilité du plasmide ont eu lieu pendant la culture. REMARQUE: Digest p1 avec SalI / NheI et p2 avec BamHI / HindIII à 37 ° C pendant 1 h. Confirmer la présence des bandes correctes après la digestion ( Figure 2a ) par électrophorèse sur gel et passer à l&#39;étape 2. Si vous préparez l&#39;ADN du plasmide par amplification du cercle roulant (RCA), réservez une partie de l&#39;éluat miniprep pour servir de modèle. </li></ol> 2. Préparation d&#39;un ADN plasmidique suffisant pour la ligature NOTE: La ligature et l&#39;électroporation subséquente nécessitent une quantité suffisante d&#39;ADN plasmidique qui doit être généré soit par le maxiprep soit par l&#39;ARC. Alors que le maxiprep est l&#39;approche traditionnellement utilisée, RCA offre l&#39;avantage de ne pas nécessiter de bactéries, éliminant ainsi le potentiel de toxicité induite par un plasmide chez les bactéries pouvant entraîner des événements d&#39;instabilité. <ol><li><stRong&gt; Effectuez la procédure de maxiprep suivante. <ol><li> Pour chaque plasmide qui a démontré le modèle correct de digestion de l&#39;enzyme de restriction dans la section précédente, ajouter 500 μL de culture de démarrage à 1 L de Carb (25 μg / mL de bouillon de carbine) et agiter pendant une nuit à 30 ° C (environ 14-16 h , Environ OD 600 de 0,6-0,8). REMARQUE: Ne permettez pas à la culture de croître sur cette valeur OD 600 . Cela entraînera potentiellement des événements d&#39;instabilité dans les plasmides. </li><li> Récolte les bactéries et effectuez les maxipreps selon le protocole du fabricant (voir la table des matériaux). </li></ol></li><li> À l&#39;aide du miniprep enregistré de l&#39;étape 1.6, procédez comme suit pour la procédure RCA. <ol><li> Transférer 1 μl d&#39;ADN plasmidique dans un tube contenant 50 μL de tampon échantillon. </li><li> Désinfecter à chaud l&#39;échantillon à 95 ° C pendant 3 min, puis incuber à 4 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit prêt à l&#39;emploi. </li><li> Préparer l&#39;amplification commercialePrémélange (voir la table des matériaux ). Mélanger 50 μL de tampon de réaction avec 2 μL de mélange enzymatique dans un ensemble de tubes sur de la glace. REMARQUE: le prémélange d&#39;amplification doit être conservé sur glace jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit prêt à l&#39;emploi. Il est conseillé de préparer un mélange maître en combinant suffisamment de réactifs pour le nombre requis de réactions d&#39;amplification. Tout prémélange inutilisé doit être éliminé. </li><li> Transférer 50 μL de prémélange d&#39;amplification préparé à l&#39;échantillon dénaturé. </li><li> Incuber les tubes de réaction à 30 ° C pendant 18 h. </li><li> Incuber les tubes à 65 ° C pendant 10 minutes pour inactiver l&#39;ADN polymérase ø29. </li><li> Conservez les tubes de réaction à 4 ° C ou -20 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient prêts à l&#39;emploi. NOTE: À ce stade, l&#39;ADN plasmidique préparé via les deux méthodes doit être quantifié (en utilisant l&#39;absorbance à 260 nm) et le génome ZIKV doit être Sanger séquentiellement entièrement pour confirmer qu&#39;aucun événement d&#39;instabilité (délits et réarrangements) n&#39;a eu lieu lors de la préparation. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Nom de l&#39;initiateur </td><td> Séquence (5 &#39;- 3&#39;) </td></tr><tr><td> ZIKV PRVABC59 1Pour. </td><td> AGTTGTTGATCTGTGTGAATCAGAC </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 632For. </td><td> GCCCATATGCTGGATGAGG </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 692Rev. </td><td> GGTTCCGTACACAACCCAAGTTG </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 1313Rev. </td><td> CTCCCTTTGCCAAAAAGTCCACA </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 1201For. </td><td> CCAACACAAGGTGAAGCCTAC </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 1663For. </td><td> GCAGACACCGGAACTCCACACT </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 2008For. </td><td> CAGATGGCGGTGGACATGC </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 2350Rev. </td><td> GTGAGAACCAGGACATTCCTCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 2605For. </td><td> TACAAGTACCATCCTGACTCCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 3499Rev. </td><td>GCCTTATCTCCATTCCATACCA </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 3961Rev. </td><td> TTGCCAACCAGGCCAAAG </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 4132For. </td><td> CATTTGTCATGGCCCTGG </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 4561Rev. </td><td> CTATTGGGTTCATGCCACAGAT </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 4665For. </td><td> GACCACAGATGGAGTGTACAGAGT </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 5189Rev. </td><td> AAGACAGTTAGCTGCTTCTTCTTCAG </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 5219For. </td><td> GAGAGTTCTTCCTGAAATAGTCCGTGA </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 6086Rev. </td><td> CTTGCTTCAAGCCAGTGTGC </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 6119For. </td><td> GCCTCATAGCCTCGCTCTATCG </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 6721Rev. </td><td> CCATTCCAAAGCCCATCTTCCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 6769For. </td><td> CCAGCCAGAATTGCATGTGTCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 7209Rev. </td><td> ATCATTAGCAGCGGGACTCCAA </td></tr><tr><td> ZIKV Conservé 7343Pour. </td><td> GTTGTGGATGGAATAGTGGT </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 8243For. </td><td> TGCCCATACACCAGCACTATGA </td></tr><tr><td> ZIKV PRVABC59 8893Rev. </td><td> TGCATTGCTACGAACCTTGTTG </td></tr><tr><td> ZIKV conservé 9133Pour. </td><td> AGCCCTTGGATTCTTGAACGAGGA </td></tr><tr><td> ZIKV PRVABC59 9673Rev. </td><td> AACGCAATCATCTCCACTGACT </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 9686For. </td><td> GATGATAGGTTTGCACATGCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 10321Rev. </td><td> GTCCATGTACTTTTCTTCATCACCTAT </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 10455For. </td><td> CAGGAGAAGCTGGGAAACC </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 10621Rev. </td><td> CAGATTGAAGGGTGGGGAAGGTC </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Amorces pour le séquençage des clones d&#39;ADNc. Les plasmides peuvent être séquencés entièrement avec les amorces répertoriées. Tampons marqués comme indiqués &quot;conservés&quot;Cate qu&#39;ils sont susceptibles de séquencer / amplifier tous les génotypes de ZIKV. Les tampons étiquetés comme &quot;PRVABC59&quot; sont spécifiques à cette souche, mais peuvent également fonctionner pour d&#39;autres souches génotypiques asiatiques et éventuellement d&#39;autres génotypes. 3. Préparation de l&#39;ARN transcrite in vitro <ol><li> Mettre en place une réaction de digestion de l&#39;ADN préparé par le maxiprep ou l&#39;ARC. <ol><li> Pour la digestion par p1, mélanger 10 μL de 10x de tampon de réaction, 3 μl d&#39;ApaLI, 3 μL de BamHI-HF, 3 μL de RSAP ou CIP et 3,3 μg d&#39;ADN p1. Ajouter ddH 2 O à 100 μL. </li><li> Pour la digestion par p2, mélanger 10 μL de 10x de tampon de réaction, 3 μl d&#39;ApaLI, 3 μL d&#39;EcoRI-HF et 13,3 μg d&#39;ADN de p2. Ajouter ddH 2 O à 100 μL. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 1-2 h. </li><li> Purifier à l&#39;aide d&#39;un gel commercial et d&#39;un kit de nettoyage par PCR (voir la table Matériaux). Eluire dans 30 μL de tampon d&#39;élution préchauffé à 70 ° C dans un bloc de chauffage (incuber leColonne pendant 5 minutes avant la filature). REMARQUE: Gardez 1 μL pour fonctionner sur un gel plus tard. </li></ol></li><li> Préparer la réaction de ligature. <ol><li> Combiner 10 μL de tampon de réaction de ligature d&#39;ADN T4 10x, 3 μL d&#39;ADN ligase T4 (400 U / μL), 29 μL de p1 purifié et 29 μL de p2 purifié. Ajouter ddH 2 O à 100 μL. </li><li> Incuber à température ambiante pendant 2 h ou 16 ° C pendant la nuit. </li><li> Purifier à l&#39;aide d&#39;un gel commercial et d&#39;un kit de nettoyage par PCR (voir la table Matériaux). Eluire dans 10 μL de tampon d&#39;élution préchauffé à 70 ° C dans un bloc de chauffage (incuber la colonne pendant 5 minutes avant le filage). REMARQUE: Gardez 1 μL pour fonctionner sur un gel plus tard. </li></ol></li><li> Exécuter des plasmides non digérés, des plasmides digérés et une ligature sur un gel d&#39;agarose. Le produit de ligature devrait avoir une bande de poids moléculaire plus élevée (environ 11 kb) que le plasmide digéré seul, ce qui indique que la ligature a réussi ( figure 2b ).</li><li> Mettre en place une réaction de transcription in vitro T7. <ol><li> Mélanger 10 μL de mélange ARCA / NTP 2x, 2 μl de mélange T7 ARN polymérase et 8 μL de réaction de ligature purifiée pour un volume final de 20 μL. REMARQUE: L&#39;ARCA inclus dans le mélange est un cap analog qui est exclusivement incorporé dans l&#39;orientation correcte. Les analogues de capuchons standard peuvent entraîner seulement ~ 50% des transcriptions ayant un capuchon dans l&#39;orientation correcte. </li><li> Incuber pendant 4 h à 37 ° C. </li><li> Mesurer la concentration d&#39;ARN par un spectrophotomètre UV. En option, exécutez un gel d&#39;agarose dénaturant pour confirmer la longueur du transcrit de l&#39;ARN. </li></ol></li></ol> 4. Rescue of Infectious Virus par Electroporation <ol><li> Jours avant l&#39;électroporation, préparer 1 flacon T182 de cellules Vero (entre T150 et T182 est acceptable, cultivé en DMEM + 10% de sérum bovin fœtal (FBS)) par construction à récupérer. Inclure 1 T182 comme un contrôle de transfection simulée. CeLls devrait être utilisé à une confluence de 70 à 80%. </li><li> Lorsque les cellules sont prêtes, placez 12 mL / réaction de DMEM + 15% de FBS + 10 mM d&#39;HEPES dans un bain d&#39;eau chauffé à 37 ° C. </li><li> Détachez les cellules par trypsinisation avec un protocole standard et récupérez les cellules dans des milieux avec 10% de FBS pour inactiver la trypsine; Centrifuger les cellules à 150 xg pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Cellules de lavage dans 1x solution salée tamponnée au phosphate (PBS), culottes à 150 xg pendant 5 min à 4 ° C. Répétez cette étape deux fois pour un total de trois lavages. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans 200 μL de RPMI 1640 + HEPES 10 mM (stérile) par nombre d&#39;échantillons. Transférer 200 μL de suspension cellulaire dans un tube stérile. Les cellules doivent être de ~ 0,5 x 10 7 cellules / ml. </li><li> Ajouter 20 μL d&#39;eau (contrôle négatif simulmé) ou 20 μL d&#39;ARN (de préférence 5-10 μg) produits à l&#39;étape 3.4 à chaque ensemble de cellules. Mélanger doucement en faisant basculer le tube et transférer le contenu du tube dans une cuvette d&#39;électroporation à intervalle de 2 mm. </li><li> Mettre un électrOpérateur à 170 V LV, oméga (résistance) à 0 et 950 μF (environ 625 V / cm et 20 ms pour les autres machines). Réglez la résistance au réglage le plus bas possible, soit 0 ou ∞ si disponible. </li><li> Pulser une fois et ajouter immédiatement 600 μL de DMEM + 15% FBS + 10 mM HEPES qui a été chauffé à l&#39;étape 4.2. Rincez à l&#39;intérieur de la cuvette à fond pour enlever toutes les cellules. Ajouter des cellules dans un flacon de culture tissulaire T75 contenant 10 ml de milieux préchauffés. Retirez les supports supplémentaires de la cuvette en utilisant le compte-gouttes inclus avec la cuvette. Veillez à maintenir la stérilité. </li><li> Flacon à spirale pour mélanger les milieux et les cellules et placer dans un incubateur à 37 ° C. </li><li> Vérifiez le lendemain pour la viabilité cellulaire, et faites-le tous les jours jusqu&#39;à ce que 50 à 75% de la mort soit observée. La mort cellulaire est observée en comparant à la maîtrise du contrôle électroporé. REMARQUE: l&#39;effet cytopathique ZIKV (CPE) est assez prononcé dans les cellules Vero, ce qui entraîne des cellules arrondies qui se détachent et flottent dans le milieu de culture. Nous avonsA observé une gamme de 8 à 10 jours comme étant idéale pour la récolte. </li><li> Récolter le surnageant dans un tube conique et centrifuger pour éliminer les débris cellulaires à&gt; 3 000 xg pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Retirer le surnageant clarifié sur un nouveau tube et compléter avec une concentration finale de 20% de FBS (à partir de 100% de stock). De plus, ajoutez de l&#39;HEPES stérile à une concentration finale de 10 mM en tant qu&#39;agent tampon pour préserver l&#39;infectiosité du virus tout en étant congelé (à partir d&#39;un stock stérile de 1 M). </li><li> Mélanger le virus par vortexage et aliquote dans des flacons à vis. Conservez à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. </li></ol> 5. Titrage du virus récupéré <ol><li> Graine le nombre approprié de plaques de 6 ou 12 puits de cellules Vero la veille du titrage. </li><li> Retirez le virus du congélateur et faites des dilutions série 10 dans DMEM + 2% de FBS dans des tubes ou des plaques à 96 puits. REMARQUE: Le titre attendu des clones récupérés est compris entre 1 x 10 6 et 5 x 10 7 PFU / mL. </li><li> Ajouter 200 oR 400 μL de chaque dilution en double dans un puits d&#39;une plaque de 12 ou 6 puits, respectivement. </li><li> Placer les plaques dans un incubateur à 37 ° C et de la roche toutes les 15 min, pour un total de ~ 1-1,5 h période d&#39;adsorption. </li><li> Enlevez l&#39;inoculum viral et ajoutez 1 ml de tampon de 12 mM (12 po) ou de 2 ml (6 puits) de DMAP-Tragacanth à chaque puits. NOTE: Il est possible d&#39;utiliser de l&#39;agarose, de l&#39;agar, de la méthylcellulose ou d&#39;autres milieux de recouvrement ici. </li><li> Incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° C pendant 5 jours. Le temps de formation appropriée de la plaque varie en fonction de la superposition utilisée. </li><li> Pour réparer les cellules, retirer les plaques de l&#39;incubateur et décoller doucement dans un désinfectant. </li><li> Ajoutez suffisamment de 20% d&#39;éthanol / 0,1% de violette de cristal (CV) à chaque puits pour couvrir et tourbillonner pour mélanger. REMARQUE: De nombreux autres fixateurs existent et peuvent être utilisés ici. De plus, si vous utilisez un agarose ou une superposition d&#39;agar, une deuxième couche de recouvrement peut être utilisée avec un rouge neutre pour visualiser les plaques sans fixation. 20% d&#39;éthanol s&#39;est avéré êtreEfficace dans l&#39;inactivation de virus enveloppés dans des études antérieures; N&#39;utilisez pas ce montant pour les virus non enveloppés car ils ne seront pas inactivés 19 . </li><li> Incuber les plaques pendant 30 à 60 minutes à température ambiante (dans un coffret de biosécurité de classe II); Jeter le CV (selon les réglementations locales) et les plaques de lavage avec de l&#39;eau du robinet. </li><li> Laisser sécher les plaques et les plaques de dénombrement manuelles. REMARQUE: la référence 20 peut être utilisée comme référence supplémentaire pour effectuer des essais en plaque. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Nous décrivons ici une méthode de récupération d’un système bipartite de clonage d’ADNc infectieux pour le virus Zika. Les clones précédemment décrits pour le ZIKV souffrent d’une atténuation ou nécessitent l’ajout d’introns, ce qui rend les plasmides plus grands et empêche le sauvetage dans les cellules d’insectes. Le virus infectieux peut être récupéré à l’aide du système de clonage à deux plasmides dans des cellules de mammifères ou d’insectes (données non présentées). De plus, le virus récupéré à partir de ce système...

Le virus Zika (ZIKV; Family Flaviviridae : Genre Flavivirus ) est un flavivirus transmis par des moustiques qui est arrivé au Brésil en 2013-14 et a ensuite été associé à une épidémie massive de maladie fébrile qui s&#39;est répandue dans les Amériques 1 . En outre, le ZIKV a été lié à des résultats sévères liés à la maladie, tels que le syndrome de Guillain-Barré chez les adultes et la microcéphalie chez les fœtus et les nouveau-nés 2 . On savait peu à propos de ZIKV avant sa propagation rapide dans l&#39;hémisphère occidental. Cela comprenait un manque d&#39;outils moléculaires, entravant ainsi la recherche mécanique. Les outils moléculaires pour les virus, tels que les clones d&#39;ADNc infectieux, facilitent le développement thérapeutique des vaccins et des antiviraux et permettent l&#39;évaluation des facteurs génétiques viraux liés à la pathogenèse virale différentielle, à la réponse immunitaire et à l&#39;évolution virale. Les clones infectieux de Flavivirus sont connus pour être très instables dans les bactéries en raison de crLes promoteurs procaryotes yptiques présents dans leurs génomes 3 . Plusieurs approches ont été utilisées pour améliorer ce problème; Y compris l&#39;insertion de répétitions en tandem en amont des séquences virales 4 , la mutation des séquences promoteurs procaryotes putatives 5 , le fractionnement du génome dans de multiples plasmides 6 , des vecteurs numériques à faible copie (y compris les chromosomes artificiels bactériens) 7 , 8 et l&#39;insertion d&#39;introns dans le génome viral 9 . Un système complet sans modifications a été décrit pour ZIKV; Cependant, ce clone semble être atténué dans la culture cellulaire et chez la souris 10 . D&#39;autres groupes ont incorporé des introns dans le génome de ZIKV, permettant une perturbation de séquences instables dans des bactéries qui peuvent être épissées dans des cellules de mammifères in vitro pour la production de virus infectieux 11, 12 . En outre, un système basé sur la PCR intitulé Infectious-Subgenomic-Amplicons a été utilisé avec succès pour sauver le prototype de souche MR766 de ZIKV 13 . L&#39;approche décrite ici ne nécessite pas de séquences étrangères, mais perturbe le génome dans la région d&#39;une forte instabilité en utilisant de multiples plasmides, qui ont déjà été utilisés avec succès avec la fièvre jaune 6 , la dengue 14 , 15 et le virus du Nil occidental 16 . En outre, l&#39;addition de la séquence de ribozyme de l&#39;hépatite D au niveau de la terminaison génomique virale facilite la création d&#39;une fin authentique 3 &#39;sans avoir besoin d&#39;ajouter un site de linéarisation. En outre, les deux plasmides sont construits dans un vecteur à nombre de copies faible (pACYC177, ~ 15 copies par cellule) pour atténuer toute toxicité résiduelle 17 . Le virus récupéré affiche un profil de croissance comparable àVirus parental dans les courbes de croissance in vitro dans 8 lignées cellulaires comprenant une variété de types de cellules dérivées à la fois de mammifères et d&#39;insectes et a présenté des profils pathogènes identiques chez la souris et les taux d&#39;infection, de diffusion et de transmission chez les moustiques 18 . Dans ce document, nous détaillons un protocole décrivant comment développer les plasmides de clones infectieux, générer de l&#39;ARN viral complet (le génome viral) in vitro et récupérer le virus infectieux dans la culture cellulaire. Tout d&#39;abord, nous décrivons la propagation de plasmides dans des bactéries ou une amplification sans bactéries à l&#39;aide de l&#39;amplification du cercle circulant (RCA). Ensuite, nous montrons comment les deux plasmides sont digérés puis ensuite ligaturés ensemble pour générer des virus complets. Enfin, nous décrivons la production de l&#39;ARN transcrit et son électroporation subséquente dans les cellules Vero, suivi du titrage du virus récupéré ( Figure 1 ). L&#39;approche décrite est rapide, ce qui permetR récupération des stocks de virus infectieux en 1-2 semaines.

<table><tbody><tr><td>NEB Stable CompetentE. coli</td><td>New England BioLabs</td><td>C3040H</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilline, sel disodique</td><td>divers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zyppy Plasmid Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4036</td><td></td></tr><tr><td>ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4202</td><td></td></tr><tr><td>SalI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3138S</td><td>20 000 unités/ml</td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3131S</td><td>20 000 unités/ml</td></tr><tr><td>ApaLI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0507S</td><td>10 000 unités/ml</td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td>20 000 unités/ml</td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3136S</td><td>20 000 unités/ml</td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3104S</td><td>20 000 unités/ml</td></tr><tr><td>illustra TempliPhi 100 Kit d’amplification</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>25640010</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel et PCR Nettoyage</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.5</td><td></td></tr><tr><td>Crevette Phosphatase alcaline (rSAP)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0371S</td><td>1 000 unités/ml</td></tr><tr><td>Phosphatase alcaline, veau intestinal (CIP)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0290S</td><td>10 000 unités/ml</td></tr><tr><td>ADN T4 Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td>400 000 unités/mL</td></tr><tr><td>HiScribe T7 ARCA Kit ARNm</td><td>New England BioLabs</td><td>E2065S</td><td></td></tr><tr><td>Cellules Vero</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr><tr><td>ECM 630 Système d’électroporation à haut débit</td><td>BTX</td><td>45-0423</td><td>D’autres machines sont acceptables.</td></tr><tr><td>LB Bouillon à l’agar (Miller)</td><td>Sigma</td><td>L3147</td><td>Peut également être fait maison.</td></tr><tr><td>Terrific Broth</td><td>Sigma</td><td>T0918</td><td>Peut également être fait maison.</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>Celltreat</td><td>229693</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de Culture</td><td>VWR International</td><td>60818-576</td><td></td></tr><tr><td>Fioles T75</td><td>Celltreat</td><td>229340</td><td></td></tr><tr><td>Fioles T182</td><td>Celltreat</td><td>229350</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 avec L-glutamine</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM avec L-glutamine et 4,5 g/L de glucose</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Atlas Biologicals</td><td>FP-0500-A</td><td></td></tr><tr><td>Tragacanth Powder</td><td>MP Bio</td><td>MP 104792</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Amresco</td><td>0528-1006</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol Denatured</td><td>VWR International</td><td>BDH1156-1LP</td><td></td></tr><tr><td>Plaque</td> <td>6 puitsCelltreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>12 plaques de puits</td><td>Celltreat</td><td>229111</td><td></td></tr><tr><td>Séquençage Oligos</td><td>IDT</td><td>voir tableau 1</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0</td><td>ThermoFisher</td><td>Qubit 3.0</td><td>d’autres méthodes sont acceptables.</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32850</td><td>d’autres méthodes sont acceptables.</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32852</td><td>d’autres méthodes sont acceptables.</td></tr><tr><td>Classe II Enceinte de biosécurité</td><td>Varie</td><td>S.O</td><td>. Ceci est nécessaire pour le travail sur les virus vivants.</td></tr></tbody></table>

le sauvetage et la caractérisation du virus recombinant à partir d&#39;un nouveau clone infectieux du virus zika du monde

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Les clones d&#39;ADNc infectieux permettent une manipulation génétique d&#39;un virus, facilitant ainsi le travail sur les vaccins, la pathogenèse, la replication, la transmission et l&#39;évolution virale. Nous décrivons ici la construction d&#39;un clone infectieux pour le virus Zika (ZIKV), qui provoque actuellement une épidémie explosive dans les Amériques. Pour éviter toute toxicité pour les bactéries qui sont communément observées avec les plasmides dérivés du flavivirus, nous avons généré un système à deux plasmides qui sépare le génome du gène NS1 et est plus stable que les constructions complètes qui ne peuvent pas être récupérées avec succès sans mutations. Après la digestion et la ligature pour rejoindre les deux fragments, l&#39;ARN viral complet peut être généré par une transcription in vitro avec de l&#39;ARN polymérase T7. Après l&#39;électroporation de l&#39;ARN transcrit dans les cellules, le virus a été récupéré qui a montré une cinétique de croissance in vitro similaire et des phénotypes de virulence et d&#39;infection in vivo chez les souris et les moustiques, respectivement.

Le protocole décrit ici permet la récupération du virus infectieux dérivé du clone Zika. La manipulation du système de clones infectieux à deux plasmides est simple lorsqu&#39;ils sont exécutés avec précaution, par rapport aux versions intégrales très instables (données non représentées). Après la digestion et la ligature des deux pièces distinctes, l&#39;ARN coiffé est produit en utilisant une transcription in vitro avec une polymerase T7 qui est ensuite électroporée d...

Ce protocole décrit la récupération du virus Zika infectieux à partir d&#39;un clone d&#39;ADNc infectieux à deux plasmides.

Le sauvetage et la caractérisation du virus recombinant à partir d&#39;un nouveau clone infectieux du virus Zika du monde

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

L'objectif général de cette procédure est de récupérer un virus infectieux à partir d'un clone d'ADN Z du virus Zika en deux parties. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la flavivirologie, telles que les stratégies vaccinales, la pathogenèse, la transmission et l'évolution du virus. Le principal avantage de cette technique est que le système en deux parties est plus stable que les approches de longueur totale.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le virus Zika, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes viraux qui se sont révélés difficiles à cloner en raison de l'instabilité des plasmides. La procédure sera démontrée par James Weger, un post-doctorant de mon laboratoire. Commencez par préparer les réactions de digestion pour les deux plasmides codant pour le génome du virus Zika, P1 et P2. Digestez 3,3 microgrammes de P1 avec ApaL1 et BamH1 High Fidelity en présence d'une phosphatase compétente, dans un volume final de 100 microlitres.Pour P2, digérez 13,3 microgrammes d'ADN P2 avec ApaL1 et EcoR1 High Fidelity dans un volume final de 100 microlitres. Incubez les deux réactions à 37 degrés Celsius pendant 1,2 heure. Après purification des plasmides digérés à l'aide d'un kit commercial de purification sur gel et PCR, ajoutez 30 microlitres de tampon d'élution préchauffé à 70 degrés Celsius sur la colonne et incubez pendant cinq minutes.Après avoir centrifugé les plasmides digérés purifiés, préparez la réaction de ligation en mélangeant 29 microlitres de P1 purifié et 29 microlitres de P2 purifié avec du tampon de réaction de ligase T4 ADN et de la ligase T4 ADN dans de l’eau doublement distillée jusqu’à un volume final de 100 microlitres. Incubez la réaction de ligation à température ambiante pendant deux heures. Après l’incubation, purifiez le plasmide ligaturé comme précédemment.Cette fois, utilisez 10 microlitres de tampon d'élution préchauffé. Ensuite, faites migrer les plasmides non digérés, les plasmides digérés et la ligature sur un gel d'agarose. Une ligature réussie doit produire un produit de ligature d'environ 11 kb.Après avoir confirmé que les plasmides migrent au poids moléculaire correct, préparez une réaction de transcription in vitro T7 en utilisant huit microlitres de la réaction de ligation purifiée et incubez pendant quatre heures à 37 degrés Celsius. Après l'incubation, mesurez la concentration en ARN à l'aide d'un spectrophotomètre UV. Un ou deux jours avant l'électroporation, préparez un flacon T182 de cellules Vero par construit à récupérer.Inclure un flacon T182 à utiliser comme témoin de faux électroporation. Lorsque les cellules atteignent une confluence de 70 à 80 %, réchauffer le DMEM contenant 15 % de FCS et 10 millimolaire de HEPES dans un bain-marie porté à 37 degrés Celsius. Détacher les cellules par trypsination selon les méthodes standard et recueillir les cellules dans le milieu contenant 10 % de FCS afin d'inactiver la trypsine.Ensuite, centrifuger les cellules à 150 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir lavé les cellules trois fois avec du PBS, suspendre chaque culot cellulaire dans du RPMI 1640 supplémenté avec 10 millimolaire de HEPES à une concentration d'environ 0,5 × 10⁷ cellules par millilitre. Transférer 200 microlitres de la suspension cellulaire dans un tube stérile.Ensuite, ajoutez 20 microlitres d'eau comme témoin négatif ou 20 microlitres d'ARN à chaque série de cellules. Mélangez délicatement les cellules en tapotant le tube, puis transférez le contenu du tube dans une cuvette d'électroporation à intervalle de deux millimètres. Réglez l'électroporateur sur 170 volts, une résistance de zéro ohm et 950 microfarads.Pulser les cellules une fois, puis ajouter immédiatement 600 microlitres de milieu préchauffé. Ajouter les cellules dans un flacon de culture tissulaire T75 contenant 10 millilitres de milieu préchauffé. Retirer tout milieu restant du cuvet en utilisant la pipette fournie avec le cuvet.Faire tourbillonner le flacon pour mélanger le milieu et les cellules, puis le placer dans l’incubateur à 37 degrés Celsius. Le lendemain et chaque jour suivant, vérifier la viabilité des cellules jusqu’à ce qu’une mort cellulaire de 50 à 75 % soit observée par rapport au témoin mock électroporé. Lorsqu’une mort cellulaire de 50 à 75 % est observée, récupérer le surnageant dans un tube conique, puis centrifuger à plus de 3 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer les débris cellulaires.Après la centrifugation, transférez le surnageant clarifié dans un nouveau tube et ajoutez du FBS pour obtenir une concentration finale de 20 %. En outre, ajoutez du HEPES stérile pour obtenir une concentration finale de 10 millimolaire en tant qu'agent tampon afin de préserver l'infectiosité du virus pendant le stockage à congélation. Enfin, mélangez le virus par vortexage et répartissez-le en aliquotes dans des tubes à vis. Conservez le virus à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure.Cette image montre l'effet similaire du virus Zika de type sauvage PRVABC59 et de celui dérivé d'un clone infectieux sur la cinétique de croissance de la lignée cellulaire de primate non humain Vero. Cette image montre l'effet des deux virus sur les cellules placentaires humaines. Des cinétiques de croissance similaires sont observées dans une lignée C6/36 dérivée de moustique.Cette courbe de survie présente des données obtenues à partir de souris âgées de quatre semaines, déficientes pour les récepteurs de l'interféron alpha, bêta et gamma, qui ont été inoculées avec 1 000 UFP de PRVABC59 ou du virus dérivé du clone infectieux. Des Aedes aegypti ont été disséqués 14 jours après un repas sanguin contenant le virus Zika. Un dosage par plaque a été utilisé pour évaluer l'infection dans le corps des moustiques, dans les pattes afin de mesurer la dissémination, ou dans les sécrétions salivaires afin de mesurer la transmission du virus infectieux.Les taux sont exprimés en pourcentage du nombre total de moustiques testés. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de séquencer l'ensemble du virus. Il est également important de se rappeler de récolter le virus entre 50 et 75 % de CPE afin de minimiser les cycles de réplication virale.Cette technique est importante pour les recherches dans le domaine de la flavivirologie afin d'explorer les vaccins, la pathogenèse et l'évolution virale du virus Zika.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Sauvetage des virus grippaux A partir de l'ADN plasmidique est une technique de base et essentiels expérimentale qui permet aux chercheurs de la grippe pour générer des virus recombinants pour étudier les multiples aspects de la biologie du virus de la grippe, et pour être utilisés comme vecteurs potentiels ou de vaccins.

Génération de virus recombinants de la grippe des ADN plasmidique

Cette vidéo montre une procédure permettant d’infecter des cellules souches neurales fœtales humaines avec le virus Zika. Les cellules infectées peuvent être utilisées pour d’autres études.

Infection par le virus Zika des cellules souches neurales fœtales

Sauvetage d'arénavirus recombinantes à partir des ADNc clonés, une approche appelée génétique inverse, permet aux chercheurs d'étudier le rôle des produits spécifiques de gènes viraux, ainsi que la contribution de leurs différents domaines et les résidus spécifiques, à différents aspects de la biologie des arénavirus . De même, les techniques de génétique inverse dans les lignées cellulaires approuvé par la FDA (Vero) pour le développement d'un vaccin fournit de nouvelles possibilités pour la...

Génération de Arenavirus recombinant pour le développement de vaccins approuvés par la FDA des cellules Vero

virus Zika (ZIKV), un pathogène émergent, est lié à des anomalies du développement fœtal et à la microcéphalie. La mise en place d’un système efficace de culture cellulaire infectieuse est cruciale pour les études sur la réplication du virus Zika ainsi que pour la mise au point de vaccins et de médicaments. Dans cette étude, divers tests virologiques relatifs au virus Zika sont illustrés et discutés.

Zika Virus système infectieuse Culture cellulaire et la<em&gt; In vitro</em&gt; Effet prophylactique des interférons

Nous décrivons ici une méthode pour établir un modèle de Zika Viro-induite microcéphalie chez la souris. Ce protocole inclut des méthodes pour l’inoculation intracérébrale embryonnaire, néonatale et adulte-stade du virus Zika.

Établir des modèles de souris pour troubles neurologiques Zika Viro-induite à l’aide de stratégies d’Injection intracérébrale : embryonnaires, néonatals et adultes

Un protocole pour évaluer les réponses de cellules T spécifiques de l’antigène dans les organes d’immunoprivileged du Ifnar1- / - modèle murin pour l’infection de virus (ZIKV) de Zika est décrite. Cette méthode est essentielle pour étudier les mécanismes cellulaires de la protection et immunopathogenèse des vaccins ZIKV et est également précieuse pour leur évaluation de l’efficacité.

Évaluation des réponses de cellules T spécifiques du Virus Zika dans les organes Immunoprivileged des Ifnar1 infecté les souris- / -

Les auteurs décrivent une méthode pour évaluer l’effet d’immunité préexistante contre le virus de la dengue sur l’infection par le virus Zika à l’aide de sérum humain, des cellules humaines primaires et quantification de l’infection par PCR en temps réel quantitative.

Quantification de l’amélioration dépendante des anticorps du Virus dans les cellules humaines primaires Zika

La récente épidémie de virus Zika souligne l'importance d'établir des approches génétiques inversées pour mettre au point des vaccins et/ou des stratégies thérapeutiques. Ici, nous décrivons le protocole pour sauver un virus Zika recombinant infectieux d'un clone d'ADNc pleine longueur assemblé dans un chromosome artificiel bactérien sous le contrôle du promoteur humain de cytomégalovirus immédiatement-tôt.

Sauvetage du virus Zika recombinant d'un clone d'ADNc chromosomique artificiel bactérien

L'objectif du protocole est de démontrer les techniques utilisées pour étudier les maladies virales en isolant et en quantifiant le virus Zika, à partir de plusieurs organes d'une souris après l'infection.

Isolement et quantification du virus Zika à partir de plusieurs organes dans une souris

Le protocole présenté peut déterminer la compétence vectorielle des populations de moustiques Aedes aegypti pour un virus donné, tel que Zika, dans un contexte de confinement.

Analyses de compétence vectorielle sur les moustiques Aedes aegypti utilisant le virus Zika

Dans ce travail, nous décrivons les protocoles utilisés dans les tests à base de réplicon et à base d’enzymes virales pour dépister les inhibiteurs de la réplication du virus Zika dans un format de dépistage à haut débit.

Tests antiviraux à haut débit pour dépister les inhibiteurs de la réplication du virus Zika

Découvrez la récupération du virus Zika infectieux à partir d'un clone d'ADN bicistronique. Cette méthode stable permet d'étudier la flavivirologie et le développement vaccinal.

Le sauvetage et la caractérisation du virus recombinant à partir d'un nouveau clone infectieux du virus Zika du monde

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