Name: Protéine Film infrarouge électrochimie témoigne pour l’étude de l’oxydation de2 H une hydrogénase NiFe (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Découvrez la technique PFIRE pour étudier l'oxydation de l'hydrogène par l'hydrogénase [NiFe] d'E. coli. Cette méthode combine contrôle électrochimique et spectroscopie infrarouge pour analyser les états redox de l'enzyme en conditions stationnaires.

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Les travaux de K.A.V. et AAP a été pris en charge par l’European Research Council (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), l’Engineering and Physical Sciences Research Council de l’IB Catalyst award EP/N013514/1 et la biotechnologie et la recherche en Sciences biologiques Conseil (BB/L009722/1 et BB/N006321/1). R.H. était soutenue par le Ministerio de Ciencia y Centro, Universidad de Costa Rica et Lincoln College, Oxford. Les auteurs reconnaissent M. Charlie Jones, M. Charlie Evans et le personnel de l’atelier mécanique (département de chimie) pour l’assistance dans la conception et la fabrication de cellules spectroélectrochimiques utilisées dans ce travail.

1. recréer le compartiment interne d’échantillon d’un spectromètre FTIR à l’intérieur d’une boîte à gants anaérobie et sec et des conditions expérimentales générales
<ol><li>Utiliser un spectromètre FTIR commercial équipé d’un détecteur d’externe mercure cadmium telluride (MCT) et accessoire d’ATR. Purger le corps du spectromètre avec air sec ou de diazote, ou vous pouvez également utiliser un spectromètre avec un banc optique évacué.</li>
	<li>Placez le spectromètre sur une table stable et exempt de vibration à la même hauteur que l’anaérobie (< 1 ppm O2), sécher la boîte à gants (point de rosée <-75 ° C). Dévier le faisceau IR du spectromètre dans la boîte à gants, à travers une fenêtre transparente IR qui est assez grande pour accueillir le faisceau défocalisé. Remarque : Il est important que l’espace entre la boîte à gants et le spectromètre est également purgé ou évacuée, surtout si un matériau hygroscopique fenêtre, tels que NaCl ou KBr par exemple, est utilisé.</li>
	<li>
Répliquer le compartiment interne échantillon du spectromètre à l’intérieur de la boîte à gants.
	<ol>
<li>Orienter le faisceau à l’intérieur de la boîte à gants sur un miroir ellipsoïdal hors-axe, idéalement avec la même distance focale comme le miroir de mise au point interne du spectromètre. Remarque : Il est utile d’avoir deux miroirs plan supplémentaire placés devant ce miroir mise au point, afin de permettre à la hauteur et la direction du faisceau IR être ajustées à l’intérieur de la boîte à gants ; Cela compensera toute inexactitude dans la mise en place initiale du spectromètre.</li>
		<li>Placez un détecteur externe de MCT, complet avec une focalisation optique (comme une lentille de distance focale courte ZnSe, ou miroir parabolique hors-axe, avec une longueur focale courte) à l’intérieur de la boîte à gants, positionné comme pour répliquer les dimensions de l’échantillon interne compartiment du spectromètre.</li>
		<li>Ajuster le « focus » du faisceau IR à peu près équidistant entre le miroir mise au point et le détecteur MCT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cool la dewar du détecteur externe MCT à l’azote liquide.</li>
	<li>Montez l’accessoire d’ATR dans le compartiment d’échantillon de boîte à gants. Aligner l’entrée et la sortie se concentrant optique et accessoire de RTA pour atteindre un débit maximal pour le détecteur MCT. Si nécessaire, utilisez une ouverture ou autre atténuation appropriée (par exemple, une grille métallique) pour éviter la sursaturation du signal du détecteur. Remarque : pour les données présentées ici, un accessoire d’ATR de cinq-réflexion avec tous les composants optiques réfléchissantes et un TR trapézoïdale amovible élément de réflexion interne (IRE) est utilisé (Crystal GmbH, dimensions ca 5 × 8 × 1 mm3, Equerres 39,5 °). L’IRE est monté sur un socle amovible usiné à partir de polyéther éther cétone (PEEK).</li>
	<li>Utilisez une boîte à gants pour abriter le compartiment échantillon recréé avec passages appropriés pour permettre la connexion à un potentiostat logés en extérieur (connexions BNC étanches au gaz sont utiles à cet effet), l’accès de gaz et câble (s) pour transférer le signal de la MCT détecteur. Il est important de conserver un blindage du câble détecteur afin d’éviter l’introduction de bruit ou interférence aux mesures.</li>
	<li>Placer une pompe péristaltique, capable de débits supérieurs à 60 mL/min à l’intérieur de la boîte à gants. Une vue schématique du spectromètre, ATR accessoire, péristaltique pompe et potentiostat configuration est illustrée à la Figure 1.</li>
	<li>Construire une cellule spectroélectrochimiques, tel que celui illustré schématiquement à la Figure 2, qui scelle sur RTA accessoire. La cellule devrait contenir une contre-électrode de grande surface (Pt fils ou la gaze), une connexion pour l’électrode de travail (canne en carbone) et une électrode de référence miniature. La cellule doit contenir au moins deux autres ports comme entrée et sortie de flux rapide de solutions par le biais de la cellule. Remarque : Une électrode de référence au calomel saturé miniature est idéale pour cela. 36
</li>
</ol>2. préparation des particules de noir de carbone modifié avec e. coli hydrogénase 1
<ol><li>Dans une boîte à gants anaérobie « humide », mélanger 20 mg de grande surface des particules de noir de carbone (> 1 000 m3/g) avec 1 mL d’eau ultra haute pureté (résistivité > 18 cm MΩ) dans un tube de microcentrifuge. Disperser les particules de faible puissance sonication (< 100 W) pendant au moins 15 minutes, ou jusqu'à ce que la dispersion est uniforme et ne sédimentent pas moins de 1 h, pour donner une dispersion de noir de carbone avec un chargement d’environ 20 mg/mL.</li>
	<li>
Prendre une partie aliquote d’e. coli hydrogénase 1 (Hyd1, environ 50 µL, préparé selon une procédure publiée55) à une concentration de protéine ~ 7 microgrammes par millilitre et échanger dans un tampon de faible force ionique à un pH proche du point isoélectrique (pour exemple du phosphate de potassium, 15 mM, pH 5.8, pas de sel supplémentaire). Pour obtenir de meilleurs résultats, utilisez une préparation enzymatique qui est aussi active que possible. Effectuer l’échange de mémoire tampon par la concentration et de dilution, dans un dispositif de filtration centrifuge avec un poids moléculaire approprié coupure (50 œuvres de kDa bien pour Hyd1).
	<ol>
<li>Le Hyd1 s’ajoute le dispositif de filtration.</li>
		<li>Diluer avec environ 450 µL de tampon de l’échange.</li>
		<li>Reconcentrer pour un volume de 50 µL par centrifugation douce (< ~ 2700 × g) pour empêcher la précipitation irréversible.</li>
		<li>Répétez les étapes 2.2.2 et 2.2.3 jusqu'à ce que l’échange de la mémoire tampon est terminée (généralement à moins de ~ 5 cycles).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mélanger un volume de 5 µL de 20 mg/mL dispersion de noir de carbone (préparée en 2.1) avec l’aliquote de 50 µL de tampon-échangé Hyd1. Stocker le mélange enzyme-particule au réfrigérateur (entre 0 ° C) pendant la nuit pour permettre à l’enzyme d’adsorber. Il peut être nécessaire de secouer le mélange parfois pour que les particules restent dispersés.</li>
	<li>Laver les particules Hyd1 modifiés avec tampon de faible force ionique (phosphate de potassium, 15 mM, pH 5.8, pas de sel supplémentaire) par cycles successifs de sédimentation et re-dispersion dans une micro-centrifugeuse (~ 2 700 × g). Répétez cette opération 3 - 5 fois pour éliminer l’enzyme non adsorbés. Remarque : Avant le premier lavage le liquide surnageant doit être pratiquement incolore, ce qui indique la bonne adsorption de l’enzyme.</li>
	<li>Concentrer les particules pour un volume final de ~ 5 µL, pour donner un chargement final de ~ 20 mg/mL d’enzyme-modification des particules. Remarque : Les particules Hyd1 modifiés peuvent être stockés à 4 ° C pendant deux semaines s’ils restent hydratés ; Ceci est mieux réalisé en stockant des particules dilués avec environ 50 µL d’eau ultra haute pureté.</li>
</ol>3. préparation pour PFIRE mesures sur e. coli hydrogénase 1
<ol><li>Nettoyer l’IRE Si par sonication de faible puissance (< 100 W), tout d’abord en H2SO4 (< 90 % w/w) pendant environ 15 min, puis en HNO3 (70 % w/w) pour jusqu'à 1 h. Cette procédure de nettoyage devrait conduire à une surface hydrophile de la IRE. Si un nettoyage supplémentaire est nécessaire la colère peut être placée dans une solution de piranha (un ratio de 1:3 H2O2: H2SO4) pour oxyder toute matière organique restante. Remarque : Des méthodes de nettoyage acides durs peuvent ne pas convenir pour une utilisation avec tous les matériaux de l’IRE. Solution de Piranha est très corrosive et un oxydant puissant, surfaces doivent être raisonnablement propres avant utilisation de la solution de piranha et soin doit être prise pendant la préparation et l’utilisation de solution de piranha en raison du caractère exothermique du processus - toujours ajouter H2O 2 lentement à H2SO4 et consulter les procédures de sécurité appropriées pour la préparation, utilisation et élimination.</li>
	<li>Rincer l’IRE propre dans de l’eau ultra haute pureté et sécher sous un courant d’azote sec. Effectuer toute manipulation de prisme à l’aide de pinces à épiler propre pour éviter la contamination.</li>
	<li>Sceller l’IRE dans la plaque de base accessoire ATR à l’aide d’une fine bande de mastic silicone électrique-catégorie. Veiller à limiter le mastic sur les bords de l’IRE. Laisser le mastic sécher complètement.</li>
	<li>Transférer la plaque de base accessoire ATR à la boîte à gants de spectromètre et montez-la sur l’accessoire de l’ATR. Mesure un spectre de référence (arrière-plan) entre 4000-1 000 cm-1 à 4 cm de résolution-1 , en utilisant le standard rapide scan mode du spectromètre et 1024 interférogrammes moyenne (~ 3-5 min de temps de mesure). Utilisez cette partie du spectre en tant qu’entrée pour permettre le calcul de spectres d’absorbance plus loin dans l’expérience. Remarque : En raison de l’absorption de petite attendue pour le site actif de l’Hyd1 il est nécessaire de collecter des spectres avec signal élevé aux ratios de bruit.</li>
	<li>Transférer la plaque de base accessoire ATR dans la boîte à gants « humide » qui contient la dispersion de particules de Hyd1-modified préparés à l’avance (article 2). Goutte-cast une quantité de 1 µL de la dispersion de particules sur la grande face de l’IRE et les répartir uniformément sur toute la surface. Remarque : Ne pas laisser les particules de devenir complètement sec sur l’IRE.</li>
	<li>Couper un morceau de papier carbone, telles que celles utilisées comme matériau de couche de diffusion de gaz dans les piles à combustible, à une taille ~0.1 mm plus petit que les dimensions de surface de l’IRE (c.-à-d. env. 8,2 x 4,9 mm2). La surface du papier carbone doit être suffisamment grande pour couvrir les particules goutte-casting de Hyd1 modifiés, mais pas si grande pour chevaucher le mastic silicone utilisé pour sécuriser l’IRE. Tremper le papier carbone dans l’eau et placez-le délicatement sur le dessus de la pellicule de particules. Le papier carbone fournira une bonne connexion électrique à travers le film de toute particule. Remarque : Il est bénéfique préparer plusieurs morceaux de papier carbone à l’avance et les stocker préalablement trempé dans de l’eau ultra haute pureté à l’intérieur de la boîte à gants anaérobie « humide ».</li>
	<li>Monter la cellule spectroélectrochimiques (décrit dans la 1.7 et illustré schématiquement à la Figure 2) au cours de l’IRE, fixer sur la plaque de montage avec vis. Ajouter ~ 200 µL du tampon expérimental pour garder l’enzyme hydraté. Un système tampon mixte, capable de mise en mémoire tampon sur une large gamme de pH, est utile pour les études sur les hydrogénases NiFe : acétate de sodium56 , 2-[N'-morpholino] acide éthane-sulfonique (MES), N'-[2-hydroxyéthyl] pipérazine -N" -[2-éthane-sulfonique acide] (HEPES), N'-tris [hydroxyméthyl] l’acide méthyl-3-amino-propane-sulfonique (SPAC) et 2-[N'-cyclohexylamino] acide éthane-sulfonique (CHES), avec chaque composant à une concentration finale de 15 mM et contenant 0,1 M NaCl comme électrolyte, support dont le pH est ajusté à pH 6 utilisant concentrée de NaOH et HCl. Remarque : La connexion d’électrode de travail doit dépasser légèrement au-dessous du plan de la partie supérieure de cellule de spectroélectrochimiques (~0.1 mm) afin d’assurer la bonne connexion électronique avec le papier carbone (Figure 2).</li>
	<li>Connecter solution amont et aval de la cellule spectroélectrochimique à un système de flux contenant la tubulure pompe péristaltique et un flacon de la mémoire tampon expérimentale. Transférer la cellule Assemblée à la boîte à gants « sec » contenant le spectromètre.</li>
	<li>Placez le dispositif de cellule de spectroélectrochimiques sur l’accessoire de l’ATR. Connecter le travail, les compteur et les électrodes de référence pour le potentiostat. Raccordez le tuyau de la pompe péristaltique à la pompe.</li>
	<li>Enregistrer un spectre d’absorbance avec interférogrammes 1024 en moyenne à 4 cm-1 résolution spectrale allant de 4 000-1 000 cm-1, en utilisant le spectre recueillis dans 3.4 comme référence/fond. À ce stade, le spectre doit contenir significative (> 100 mO.D.) amide II bandes à ~ 1 540 cm-1 et le site actif des bandes de Hyd1 devraient être évidents dans le domaine spectral 1 850-2 150 cm-1, en grande partie dans les États oxydées, inactifs (Figure 3 ).</li>
</ol>4. intervention d’e. coli hydrogénase 1 et les essais de la cellule spectroélectrochimique
<ol><li>Appliquer un potentiel réducteur (−0, 8 V vs CPE) pour le film de particules Hyd1 modifiés. Saturer le tampon expérimental avec H2 et flux tampon lentement à travers la cellule spectroélectrochimiques. Laisser l’échantillon pendant la nuit pour activer totalement le Hyd1. Remarque : Il est important d’utiliser des anaérobies H2, N2 etc.et donc de tous les gaz anaérobies doit être passé à travers un filtre de2 O.</li>
	<li>Enregistrer un spectre d’absorbance de l’échantillon après l’activation. Les bandesCN de vdu site actif et νCO devraient maintenant afficher une distribution d’États réduits, « actives ». C’est plus facilement observable par l’utilisation d’un spectre de différence, par rapport au spectre enregistré à 3.10 (Figure 4).</li>
	<li>Tester la connexion électrique de la cellule spectroélectrochimiques. Pour ce faire, saturer le tampon expérimental avec gaz2 N. Appliquer une séquence de l’oxydant (0 V vs CPE) et la réduction (−0, 8 V vs CPE) potentiels (d’une durée de 30 min ca ) pour le film de particules Hyd1 modifiés et d’enregistrer un spectre d’absorbance à chacun. Le Hyd1 devrait devenir rapidement oxydées et réduites, et si le film de la particule est bien connecté 100 % de l’échantillon devrait répondre à du potentiel appliqué.</li>
	<li>Définir un débit approprié de la mémoire tampon expérimentale. Pour ce faire, appliquez un potentiel réducteur (−0, 8 V vs CPE) à l’échantillon et saturer le tampon expérimental avec H2. Enregistrer une série de voltampérogrammes cycliques entre-0.707 - 0.039 V vs CPE à une vitesse de balayage de 10 mV/s. Augmentez graduellement la vitesse d’écoulement de H2-tampon saturée entre voltampérogrammes jusqu'à ce que la forme d’onde catalytique qui ressemble à une rotation plane électrode55 de disques et le courant maximum est indépendant du débit (Figure 5). Remarque : La limite de solubilité de H2 dans l’eau est ~0.8 mM à 293 K et 1 bar.</li>
	<li>Comme l’échantillon est maintenant prêt pour les mesures PFIRE, recueillent des spectres à différents potentiels, dans une gamme de solution conditions (pH, température, concentration de2 H etc.). Enregistrer toutes les données électrochimiques en utilisant le logiciel potentiostat tel qu’il est important de pouvoir corréler les données spectroscopiques et électrochimiques, surtout quand l’étudiant électrocatalytique processus tels que l’oxydation de2 H de Hyd1.</li>
</ol>5. spectroscopiques manutention
<ol><li>Confirmer que le site actif n’a pas été définitivement modifié au cours des mesures en enregistrant les spectres à 0 V et −0, 8 V vs CPE à la fin de l’expérience. Ceux-ci devraient être identiques aux spectres enregistrés en 4.3, et aucune perte de site actif ne doit être observée lors de la mesure (Figure 6).</li>
	<li>Exporter des spectres d’absorbance absolu du logiciel spectromètre dans un format approprié (.csv, ASCII, « matlab », Jcamp etc.) pour le traitement à l’aide d’un logiciel comme origine ou Matlab.</li>
	<li>
Référence corriger les données, en utilisant le processus illustré à la Figure 7.
	<ol>
<li>Prendre la dérivée seconde de chaque spectre d’absorbance dans la gamme 1 800-2 150 cm-1, afin d’identifier les petits (< 1 mO.D.) bandes de site actif contre le fond de l’eau fortement courbé.</li>
		<li>Placer des points de repère de référence sur le spectre d’absorbance original et définir les points de « déclic » pour le spectre expérimental.</li>
		<li>Insérer une ligne de base à travers les points à l’aide d’une fonction d’interpolation spline cubique ou une fonction polynomiale. Soustraire cette fonction de base des données expérimentales.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrente.

PFIRE est une technique de spectroscopie IR largement applicable pour l’adressage des protéines immobilisée électrode rédox. En particulier, des réactions électrocatalytique d’enzymes d’oxydoréduction peuvent être sondées dans des conditions de renouvellement rapide. La méthode PFIRE s’appuie sur le contrôle électrochimique direct fourni par la technique de PFE, qui ne fournit aucune information structurelle directe et il les couples à la spectroscopie IR à une électrode de carbone. L’approche PFIRE donc ajoute insight chimique aux informations disponibles d’électrochimie seul et convient très bien à l’étude d’oxydoréduction protéines et enzymes impliquées dans la liaison de petites molécules et d’activation. En outre, PFIRE peut fournir des informations sur la fonction du potentiel des changements structurels dans les protéines en l’absence du chiffre d’affaires catalytique. Ces événements de transfert d’électrons non-chiffre d’affaires sont souvent difficiles à détecter en utilisant des applications « standards » de PFE, bien que l’extension du PFE de voltampérométrie AC transformée de Fourier a été utilisée avec succès. 45 , 46
La méthode PFIRE est, en principe, adapté pour l’étude de toute protéine d’oxydo-réduction qui peut être étudié à l’aide de PFE. Par conséquent, comme avec DFP, adsorption de protéines est une étape essentielle pour une expérience réussie de PFIRE. Dans le présent protocole, les auteurs décrivent une application de la technique PFIRE Hyd1 d’e. coli comme étude de cas. 36 , 43 Toutefois, nous avons également appliqué la technique PFIRE de l’hydrogénase cytoplasmique réglementaire r. eutropha,44 et de la flavine mononucléotide adsorbé sur du noir de carbone. 40 dans tous ces cas, l’adsorption physique simple au noir de carbone non modifié de grande surface (comme décrit dans le présent protocole) fournit une couverture de la surface de la protéine qui est assez élevé pour les spectres IR record de bonne qualité avec un rapport signal sur bruit élevé. Dans les cas où des niveaux élevés d’adsorption ne peut être atteints, il peut être nécessaire de modifier la surface des particules de carbone, par exemple pour permettre la fixation covalente de protéine à la surface de l’électrode. 60 , 61 , 62 l’utilisation d’une boîte à gants pour les mesures PFIRE seulement est strictement nécessaire lorsque l'on étudie des échantillons qui doivent être manipulés en anaérobiose. Cependant dans la pratique le très constant et faible (< 80 ° C point de rosée) concentrations de vapeur d’eau fournie par l’atmosphère de la boîte à gants donnent des niveaux de signal-bruit élevés qui permettent l’extraction des absorbances très petites. 44 dans de nombreux cas un environnement anaérobie, telles que celles fournies par la boîte à gants, est également souhaitable pour la mesure électrochimique (partie intégrante de la technique PFIRE) afin d’éviter des cours due à la réduction de2 O à l’électrode de travail.
Absorbances IR en raison de la masse d’eau, tampons expérimentales et les particules de carbone, sur laquelle l’échantillon est adsorbé tous contribuent de manière significative à des spectres expérimentaux et pourrait chevaucher les bandes d’intérêt, en particulier dans l’amide I, régions II et III de la spectre. 63 la région amide contient également des informations provenant des espèces organiques tels que les flavines ou nicotinamide cofacteurs, ainsi que les substrats et les produits de nombreuses réactions d’oxydation et de réduction. Dans le cas de NiFe hydrogénases, ν νetCO NC bandes du site actif tombent dans une région relativement claire du spectre, et donc la technique PFIRE convient très bien à l’étude de ces enzymes. Dans d’autres cas, cependant, spectres couplés avec des approches étiquetage isotopiques peuvent être nécessaire d’isoler les changements dus à la protéine immobilisée. Des approches similaires ont été utilisés pour identifier, par exemple, les changements de protonation, réarrangements structuraux et étudier de Michaelis-Menten complexes à l’aide de la spectroscopie IR. 64 , 65 , 66 PFIRE n’est pas, par conséquent, limité à l’étude des hydrogénases mais peut être appliqué à toute protéine d’oxydo-réduction qui contient (ou dont des substrats, des produits ou des inhibiteurs contiennent) groupes diagnostiques vibrations IR-active ; dehydrogeanses de monoxyde de carbone, nitrogenases67 ,68,14 flavoproteins,40 et formate déshydrogénase, par exemple.
La technique connexe, SEIRA, convient très bien à l’étude des protéines associées aux membranes dans un environnement biomimétique. 32 SEIRA est une adaptation de la spectroscopie IR qui utilise une configuration ATR-IR et se sert d’un effet de surface enhancement qui amplifie l’absorption IR de molécules (à moins de quelques nm) situé à proximité de la surface du prisme ATR (IRE). SEIRA est donc extrêmement sensible aux changements qui surviennent au cours de l’architecture protéique et membrane adsorbé et sont relativement exempt de signaux contradictoires du solvant et substrats/inhibiteurs présents dans la solution. C’est un peu contrairement à la technique PFIRE décrite ici qui s’appuie sur une profondeur de pénétration significativement plus élevée au-dessus de la surface de l’IRE (~ 1 µm), ce qui signifie que PFIRE est plus sensible aux substrats, produits ou inhibiteurs présent dans la solution. Cette sensibilité accrue au « en vrac » solvant peut être avantageuse ; Si le substrat ou le produit peut être observée directement par IR, spectres PFIRE rapport sur les deux cinétique d’état d’équilibre des espèces actives de longue durée de vie et de la formation de produit connexe durant électrocatalyse. 69 la capacité d’observer l’état d’équilibre des concentrations de substrat et le produit sera particulièrement utile pour les enzymes telles que le monoxyde de carbone déshydrogénase (enzyme qui catalyse l’oxydation réversible du CO à CO2, un absorbeur de IR fort) ou formate déshydrogénase (enzyme qui catalyse l’oxydation réversible du formiate de CO2).
À l’heure actuelle, PFIRE est limitée aux études cinétiques stationnaire d’enzyme électrocatalyse en raison les électrodes de carbone macroscopique utilisées pour « concentrer » l’enzyme sur la surface d’une IRE pour la collecte de données dans et de la géométrie de l’ATR-IR. À cet égard les études PFIRE NiFe hydrogénases sont complémentaires aux travaux de Dyer et ses collaborateurs,49,50 , qui utilisent la spectroscopie IR lumière déclenchée l’absorption transitoire pour étudier la cinétique des chiffre d’affaires. Travail est en cours de miniaturiser la cellule spectroélectrochimiques,40 , et à l’aide de microélectrodes résolution au moment de l’ordre de microsecondes doit être réalisable. Cela permettra aux étude de cinétique sous chiffre d’affaires pour les enzymes avec des fréquences de rotation jusqu'à ca 100-500 s-1et permettra l’étude des processus réductrices et oxydants.
Dans l’ensemble, le PFIRE est une technique spectroscopique qui permet la caractérisation chimique des réactions électrocatalytique d’enzymes d’oxydoréduction en vertu de l’état d’équilibre. L’approche PFIRE permet plusieurs titrages chimiques et électrochimiques à effectuer sur le même échantillon d’enzyme, car les électrodes de grande surface utilisées fournissent une solide adsorption de protéines et de la géométrie de l’ATR-IR permet un échange facile solution. La capacité de recueillir ces informations structurelles sur place pendant le fonctionnement de l’enzyme est un outil précieux pour la communauté bioelectrochemistry.

Un défi majeur dans l’étude de la fonction de protéine implique le développement de méthodes in situ permettant l’observation directe des protéines effectuant leurs rôles physiologiques, soit in vivo ou en utilisant isolées d’échantillons de protéines. Cela nécessite l’intégration de contrôle ou de déclencher des processus dans des procédures expérimentales et l’utilisation de la combinaison des techniques qui permettent tous deux la réactivité d’être évalués et des étapes chimiques individuels au cours de la fonction des protéines à mesurer, en même temps. Dans le cas de protéines redox cela équivaut souvent à la combinaison des techniques électrochimiques, qui précisément contrôlent le potentiel appliqué mais ne fournissent aucune information chimique directe, avec des techniques spectroscopiques qui réagissent chimiquement spécifiques changements liés à la fonction des protéines. 1 , 2 , 3 spectroélectrochimie est un terme général pour une gamme des méthodes spectroscopiques et électrochimiques couplés qui englobent une variété de techniques spectroscopiques et de niveaux de contrôle électrochimique. Beaucoup de protéines peut échanger des électrons avec les donneurs d’électrons artificiels, soluble et accepteurs et cela a été exploitée dans les études qui utilisent des petites molécules pour négocier le transfert d’électron, y compris le couplage avec UV-visible,4,5 , 6 , 7 dichroïsme circulaire magnétique8 et infrarouge5,9,10,11,12,13,14 (IR) spectroscopies. Dans un nombre limité de cas il s’est avéré possible d’exploiter l’échange sans médiation, contrôlée par la diffusion des électrons entre les protéines et les électrodes. 15 , 16
Pour réactions catalytiques réalisée par les enzymes redox, solution électrochimie approches présente un désavantage évident. Contrôlée par la diffusion électronique transfert via redox médiateurs en solution est susceptible de devenir la limitation du débit. Informations cinétiques et mécanistes de l’enzyme peuvent être perdu, ou au moins devenir difficiles à deconvolute des artefacts de diffusion résultant de la méthode expérimentale. Directement, sans médiation contrôle électrochimique est donc un outil important pour l’étude des enzymes et des protéines d’oxydo-réduction. La technique de l’électrochimie de film de protéine (PFE) emploie des protéines immobilisée électrode rédox, de telle sorte que les électrons sont transférés directement vers ou depuis les cofacteurs d’oxydo-réduction dans la protéine que l’électrode est polarisée à une série de potentiels. 17 , 18 , 19 PFE est particulièrement utile pour l’étude des réactions d’oxydation ou de réduction catalysée par les enzymes redox, transfert d’électron interfaciale peut être atteints à un rythme très élevé. Par exemple, le taux de roulement électrocatalytique de l’hydrogénase ([NiFe]) de nickel-fer de Allochromatium vinosum a été mesuré par le DFP comme ca 1 000-10 000 s−1 d’oxydation de2 H. 20 le potentiel de l’électrode agit comme un déclencheur pour allumer la catalyse « on » ou « off » et les rapports actuels électrocatalytique sur l’activité enzymatique. PFE est donc une méthode utile pour l’analyse de la réactivité des enzymes complexes qui dépendent intimement de potentiel, tels que les réactions du site actif di-fer de [FeFe]-hydrogenases avec CO et O2,21 ou induite par le potentiel réactions d’inactivation des hydrogénases, déshydrogénase de monoxyde de carbone de22 ,23 et autres enzymes redox complexes. 24
La barrière principale à la combinaison de techniques spectroscopiques avec le contrôle électrochimique direct accordé par DFP découle de la faible couverture de surface des enzymes d’oxydoréduction, sur l’ordre de 1-2 pmol cm-2 pour l’hydrogénase [NiFe] de a. vinosum, 20 par rapport aux études de science des surfaces in situ des adsorbats de petites molécules sur des électrodes de métal vrac. Cela représente un défi pour la sensibilité de la mesure spectroscopique. Plusieurs méthodes de spectroélectrochimiques ont été rapportés pour l’étude immobilisé des protéines d’oxydo-réduction à une gamme d’électrodes différentes : spectroscopie UV-visible à électrodes d’oxyde métallique transparent ; 25 , 26 , 27 la spectroscopie de fluorescence à électrodes en or ; 28 , spectroscopie d’absorption infrarouge surface améliorée (SEIRA) 29 à électrodes en or ; 30 , 31 , 32 , 33 et surface amélioré les techniques de spectroscopie Raman, principalement aux électrodes d’argent. 34 , 35
Nous décrivons ici une méthode de couplage de PFE avec spectroscopie IR, dans une technique dite de l’électrochimie infrarouge film protéine (PFIRE). 36 méthode le PFIRE étudie les enzymes redox immobilisées sur une électrode de travail de carbone de grande surface en conjonction avec une géométrie de réflexion totale atténuée IR (ATR-IR), exploitant de la facilité de l’adsorption d’une gamme de protéines sur surfaces en carbone. Spectroscopie IR est utile dans les études des protéines et enzymes redox comme beaucoup de petites molécules, de ligands et de cofacteurs ont des absorbances diagnostiques qui peuvent être utilisés pour évaluer l’état de réactivité, de liaison, l’inhibition et oxydo-réduction. Exemples : liaison des N° aux centres fer-soufre,37 étude de flavoproteins,38,39,40 petites molécules de liaison vers les centres de l’hème etc.. 41 la géométrie de l’ATR-IR permet la construction d’une cellule électrochimique de trois électrodes (spectro) optimisé42 et fournit donc excellent contrôle électrochimique. Résistance de la solution et de la dérive potentielle sont réduits au minimum en plaçant une électrode de référence à proximité de l’électrode de travail. Grande surface compteur électrodes sont utilisées qui sont compatibles avec les courants de haute électrocatalytique produites par chiffre d’affaires rapide enzymatique à l’électrode de travail. Débit de solution par le biais de la cellule spectroélectrochimique permet un contrôle facile sur la concentration des substrats, inhibiteurs et pH. 36 , 43 , 44 méthode le PFIRE permet donc aux spectres IR d’être enregistré sur place pendant électrocatalyse enzyme soutenue. 36 , 44 PFIRE est également capable de fournir des informations chimiques en l’absence de catalytique actuel,43 contrairement aux PFE où il peut être difficile d’extraire des informations de processus non catalytique en enzymes d’oxydoréduction. 45 , 46
Nous avons démontré la méthode PFIRE pour l’étude de l’oxydation électrocatalytique H2 par les hydrogénases [NiFe], qui contiennent des ligands CO et CN intrinsèques à Fe a coordonné à un site actif bimétallique. 36 , 43 , Les hydrogénases [NiFe] du 44 sont donc particulièrement bien adaptées à l’étude par PFIRE. La méthode PFIRE fournit des informations sur les espèces qui sont présentes durant le turnover de l’état d’équilibre et fournit donc cruciale vision mécaniste en plus de la richesse de la littérature sur la spectroscopie IR des hydrogénases sans contrôle expérimental sur chiffre d’affaires. 47 , 48 en Dyer et ses collaborateurs ont employé des méthodes de IR résolue en temps à l’étude de NiFe hydrogénases,49,50,51 en utilisant un déclencheur de lumière soit appliquer un petit pas de potentiel négatif (par utilisation des médiateurs de la solution et une source d’électrons « en cage ») ou photolyse un hydrure lié. Bien que la méthode PFIRE ne peut pas, à l’heure actuelle, fournir la résolution de temps pour correspondre à ces mesures,40 il permettre d’étudier des procédés catalytiques réductrices et oxydants, accédé à un éventail de potentiels bien définis et exemptes de transports en commun limitations.
La méthode PFIRE se distingue par des études SEIRA des protéines d’oxydo-réduction, qui également utilisent une géométrie ATR-IR et emploient une électrode métallique rugueuse à l’échelle nanométrique pour améliorer l’absorption IR de molécules adsorbées à la surface de l’électrode. 30 SEIRA est une technique extrêmement précieuse pour l’étude des protéines membranaires, en particulier adsorbés sur ou dans la membrane mimétique les architectures,32 , mais la nécessité d’une électrode métallique peut limiter le champ substrat et inhibiteur en raison de la réactivité de l’appui de l’électrode vers petites molécules telles que CO, CN–, CO2 etc. Réduction des protons et la désorption des monocouches auto-assemblées peuvent être problématiques sur des surfaces métalliques à des potentiels très négatifs,1,52 bien que les électrodes de métaux enzyme électrocatalyse sur non protégés a été signalé. 53 , 54 un désavantage de PFIRE par rapport à SEIRA est la difficulté relative de l’incorporation des protéines membranaires dans les architectures de membrane native ou mimétique. Cependant, la relative inertie chimique des électrodes carbone aux réactions d’activation petites molécules concurrentes rend PFIRE une excellente technique pour l’étude des enzymes électrocatalyse, particulièrement dans le domaine de faible potentiel pertinent d’oxydo-réduction biologique processus tels que la réduction des protons par hydrogenases. 1 , 43
Cet article vise à introduire la méthode PFIRE comme technique pour l’étude des protéines immobilisée électrode rédox, NiFe hydrogénase 1 (Hyd1) d’Escherichia coli en prenant comme exemple. Les considérations de préparation de l’échantillon, l’exigence de substrat bon débit et le traitement des données sont examinées. PFIRE est une technique largement applicable, bien adaptée pour étudier toute protéine d’oxydo-réduction (avec les absorbances de IR caractéristiques) qui peut être adsorbé sur les électrodes de carbone, soit directement ou à l’aide de modification de surface, tel qu’il peut échanger des électrons avec les électrode.

<table><tbody><tr><td>Spectromètre</td><td>Agilent</td><td>680-IR</td><td>avec détecteur MCT externe</td></tr><tr><td>Accessoire ATR</td><td>Pike Technologies</td><td>GladiATR</td><td>Personnalisé pour une utilisation avec une boîte à gants Si IRE à 5 réflexions</td></tr><tr><td></td><td>Glove Box Box Technology Ltd.</td><td>N/A</td><td>Boîte « humide » et « sèche » conçue sur mesure pour la manipulation et la mesure anaérobies d’échantillons</td></tr><tr><td>Fenêtre KBr</td><td>Crystran</td><td>Custom</td><td>Pour permettre le couplage de la boîte à gants avec le faisceau externe du spectromètre FTIR</td></tr><tr><td>Optiques supplémentaires</td><td>Agilent</td><td>N/A</td><td>Composants d’un accessoire PM-IRRAS</td></tr><tr><td>Silicium IRE</td><td>Crystal GmbH</td><td>Custom</td><td>Trapézoïdal : 8,4 mm x 5 mm (grande face), 1 mm d’épaisseur, angle de face d’environ 39 degrés</td></tr><tr><td>Potentiostat</td><td>Metrohm</td><td>Autolab PGSTAT 128N</td><td></td></tr><tr><td>Nova 10.1</td><td>Metrohm</td><td></td><td>Logiciel pour contrôler le potentiostat</td></tr><tr><td>Pompe péristaltique</td><td>Williamson Manufacturing Company Ltd</td><td>QL-1000-024-300</td><td></td></tr><tr><td>Pt fil</td><td>Surepure Chemetals</td><td>3272</td><td>99,95 % Fil de platine pur, 0,014 pouce de diamètre</td></tr><tr><td>Tige de carbone</td><td>WH Smith 30729209</td><td></td><td>0,7 mm HB mine de crayon</td></tr><tr><td>Noir carbone</td><td>Cabot Corporation</td><td>Black Pearls 2000</td><td></td></tr><tr><td>Bain à ultrasons</td><td>Ultrawave</td><td>U100</td><td>35 W</td></tr><tr><td>Filtre centrifuge</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC5050BK</td><td>Amicon Ultra, 50 KDa MW</td></tr><tr><td>coupure Microcentrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5452000018</td><td>MiniSpin</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Fisher</td><td>S/9240/PB17</td><td></td></tr><tr><td>HNO3</td><td>Fisher</td><td>N/2300/PB17</td><td></td></tr><tr><td>mastic silicone</td><td>Cow Corning Toray Co., Ltd.</td><td>SE 4486</td><td></td></tr><tr><td>Papier carbone</td><td>Toray</td><td>TGP-H-030</td><td></td></tr><tr><td>H2 gaz</td><td>BOC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2 gaz</td><td>BOC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 2015</td><td>OriginLab</td><td></td><td>Logiciel d’analyse de données/graphique</td></tr><tr><td>Résolutions Pro 4.0</td><td>Varian Logiciel pour</td><td></td><td>le contrôle du spectromètre FTIR</td></tr></tbody></table>

protéine film infrarouge électrochimie témoigne pour l’étude de l’oxydation de2 h une hydrogénase [nife]

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Comprendre la chimie d’oxydoréduction protéines demandes méthodes qui fournissent un contrôle précis sur l’oxydo-réduction des centres au sein de la protéine. La technique de l’électrochimie de film de protéine, dans laquelle une protéine est immobilisée sur une surface de l’électrode, telle que l’électrode remplace donneurs d’électrons physiologiques ou accepteurs, a fourni la perspicacité fonctionnelle dans les réactions d’oxydo-réduction d’un éventail de différents protéines. Compréhension complète chimique nécessite contrôle électrochimique pour être combiné avec d’autres techniques qui peuvent ajouter des données structurelles et mécanistiques supplémentaires. Nous démontrons une technique, l’électrochimie infrarouge film de la protéine, qui combine l’électrochimie de film de protéine avec un échantillonnage spectroscopique infrarouge des protéines d’oxydo-réduction. La technique utilise une géométrie de réflexion totale atténuée de réflexions multiples pour sonder une protéine redox immobilisée sur une électrode de noir de carbone de grande surface. Incorporation de cette électrode dans une cellule d’écoulement permet de pH de la solution ou des concentrations de soluté à être changé pendant les mesures. C’est particulièrement puissant dans la lutte contre les enzymes redox, où rotation catalytique rapide peut être soutenue et contrôlée à l’électrode permettant l’observation spectroscopique d’espèces intermédiaires qui vivent longtemps dans le mécanisme catalytique. Nous démontrons la technique avec des expériences sur e. coli hydrogénase 1 dans des conditions de non-chiffre d’affaires et chiffre d’affaires (oxydation de2 H).

Ici, nous décrivons une technique, l’électrochimie infrarouge film de la protéine, qui permet aux protéines redox immobilisé à étudier par spectroscopie sous contrôle électrochimique direct à une électrode de carbone. Les spectres infrarouges d’un échantillon de protéine unique peuvent être enregistrées à une gamme de potentiels appliqués et dans une variété de conditions de solution.

Protéine Film infrarouge électrochimie témoigne pour l’étude de l’oxydation de2 H une hydrogénase [NiFe]

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

L'objectif général de ce protocole est d'étudier la chimie du site actif d'une enzyme redox hydrogénase nickel-fer sous des conditions sans renouvellement et en régime permanent de renouvellement électrocatalytique, en utilisant la spectroélectrochimie infrarouge sur film protéique, ou PFIRE. Le principal avantage de la technique PFIRE est qu'elle permet un contrôle électrochimique précis simultané à un échantillonnage spectroscopique infrarouge de protéines redox immobilisées sur une électrode en carbone. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans les domaines de la biophysique et de la bioélectrochimie concernant les états des protéines redox présents durant le renouvellement catalytique en régime permanent.Pour commencer la procédure, suspendre 20 milligrammes de particules de noir de carbone à haute surface spécifique dans un millilitre d'eau ultrapure, à l'intérieur d'une enceinte anaérobie humide équipée de gants. Soniquer la suspension à faible puissance pendant au moins 15 minutes, ou jusqu'à ce que les particules soient uniformément dispersées et qu'aucun sédiment ne se forme après une heure de repos. Ensuite, charger 15 microlitres d'une solution d'hydrogénase 1 d'E.Coli d'environ sept milligrammes par millilitre dans une unité de filtration centrifuge de 50 kilodaltons.Diluer la solution avec 450 microlitres d'un tampon d'échange de faible force ionique ayant un pH proche du point isoélectrique de l'hydrogénase. Concentrer le mélange à 50 microlitres par centrifugation à 27 000 fois g. Re-concentrer le mélange quatre fois supplémentaires pour achever l'échange de tampon.Ensuite, mélanger cinq microlitres de la dispersion de noir de carbone à 20 milligrammes par millilitre avec l'hydrogénase ayant subi un échange de tampon. Conserver le mélange à zéro degré Celsius pendant la nuit afin de permettre à l'hydrogénase de s'adsorber sur les particules de noir de carbone. Vérifier périodiquement le mélange afin de maintenir la dispersion des particules.Centrifuger les particules modifiées à 27 000 fois g et vérifier que le surnageant est presque incolore, ce qui indique une bonne absorption de l'hydrogénase par les particules. Une absorption élevée est essentielle à la réussite de l'expérience. Nous optimisons le tampon d'absorption en utilisant comme point de départ un tampon de faible force ionique à un pH proche du point isoélectrique de la protéine.Lavez les particules à l’aide de trois à cinq cycles de centrifugation et de resuspension dans un tampon d’échange frais. Concentrez le mélange de particules jusqu’à environ cinq microlitres afin d’obtenir une charge de particules de 20 milligrammes par millilitre. Pour commencer les préparatifs des mesures PFIRE, nettoyez un élément interne de réflexion en silicone par sonication à faible puissance dans de l’acide sulfurique pendant 15 minutes.Puis traitez à l'acide nitrique pendant une heure. Rincez ensuite l'élément à l'eau ultrapure et séchez-le sous un courant d'azote sec. Utilisez un scellant en silicone de qualité électrique pour fixer l'élément de réflexion interne (IRE) sur la platine de base d'un accessoire ATR à cinq réflexions, en veillant à appliquer le scellant uniquement sur les bords de l'IRE.Laisser le scellant sécher complètement. Ensuite, introduire la plaque de base dans une enceinte anaérobie sèche équipée d'une fenêtre transparente dans l'infrarouge, située à proximité d'un spectrophotomètre FTIR. Monter la plaque de base sur l'accessoire ATR.Acquérir un spectre de fond en mode balayage rapide. Ensuite, détacher la plaque de base de l'accessoire ATR et la transférer dans la boîte à gants anaérobie humide. Déposer par goutte une microlitre de particules de noir de carbone modifiées par l'enzyme uniformément sur la surface de l'IRE sans laisser les particules sécher complètement.Il est important que le mélange de particules modifiées par l'enzyme ait été concentré à une charge aussi proche que possible de 20 milligrammes par millilitre. Sinon, il peut être difficile d'obtenir un film de particules bien connecté lors de la déposition par goutte de ces particules à cette étape. Placez délicatement un morceau de papier au carbone imprégné d'eau ultrapure sur la surface de l'IRE, en veillant à ce que le film de particules soit recouvert sans laisser le papier entrer en contact avec le scellant en silicone.Placer une cellule spectroélectrochimique personnalisée au-dessus de l'IRE. Ajouter 200 microlitres de tampon expérimental par l'entrée de solution afin de maintenir l'enzyme hydratée pendant la préparation du système. Relier l'entrée et la sortie de solution à un flacon contenant le tampon expérimental à l'aide de tubulures de pompe péristaltique.Ensuite, transférez la cellule assemblée dans la boîte à gants sèche. Montez l'ensemble de la cellule sur l'accessoire ATR et raccordez les tubes à la pompe péristaltique. Enregistrez un spectre absorbant en utilisant le spectre précédemment enregistré comme fond.Vérifiez que les bandes de MI2 sont fortement visibles à 1 540 centimètres réciproques et que les pics du site actif de l'hydrogénase sont détectables dans la région de 1 850 à 2 150. Pour préparer l'expérience, appliquez un potentiel réducteur de moins 0,8 volt par rapport à une électrode de référence au calomel saturé sur le film de particules. Saturez le tampon d'expérience avec du gaz hydrogène anaérobie.Ensuite, commencez à faire circuler le tampon à travers la cellule spectroélectrochimique à environ 12 millilitres par minute. Laissez l'échantillon sous flux de tampon expérimental saturé en hydrogène toute la nuit pour activer l'hydrogénase. Enregistrez un spectre d'absorption de l'échantillon activé et vérifiez que les bandes CO et CN du site actif présentent plusieurs états réduits.Ensuite, saturer le tampon d'expérience avec du gaz azote anaérobie et faire circuler le tampon à travers la cellule. Appliquer un potentiel d'oxydation de zéro volt par rapport à une électrode de référence au calomel saturé pendant 30 minutes et enregistrer un spectre d'absorption. Puis appliquer un potentiel de réduction pendant 30 minutes et enregistrer un autre spectre.Vérifiez que l'enzyme a été complètement oxydée, puis réduite. Si ce n'est pas le cas, vérifiez les connexions électriques de la cellule. À l'aide d'un tampon saturé en hydrogène anaérobie, enregistrez une série de voltammogrammes cycliques à des débits croissants afin de déterminer le débit optimal pour l'expérience.À l’aide de ce débit, acquérez des spectres à une gamme de potentiels et de conditions de solution. Des mesures PFIRE de l’hydrogénase une d’E.coli ont été obtenues à divers potentiels, sous atmosphère inerte et en présence de gaz hydrogène. Les spectres acquis sous atmosphère d’hydrogène représentaient les distributions à l’état stationnaire des états du site actif présents durant l’oxydation catalytique de l’hydrogène.L'oxydation anaérobie et l'activation de l'hydrogénase par formation de l'état nickel-B à partir du nickel-Si ont ensuite été étudiées en enregistrant des spectres à différents instants pendant l'application d'un potentiel et en préparant différents spectres par rapport au premier spectre. La conversion progressive observée du nickel-Si en nickel-B était conforme à la diminution monotone du courant. Des spectres ont également été enregistrés sur une gamme de pH de la solution afin d'étudier les étapes de transfert de protons du cycle catalytique de l'hydrogénase.À pH bas, l'état nickel-C était plus prévalent, tandis que l'état nickel-L l'était davantage à pH élevé. La dépendance au pH des concentrations relatives du nickel-C et du nickel-L a été déterminée à partir des valeurs maximales d'absorbance aux pics respectifs à chaque pH évalué dans l'expérience. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs du domaine de la bioélectrochimie pour explorer la cinétique en régime permanent de l'activation de l'hydrogène par les hydrogénases.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension d'une expérience typique de PFIRE. Cette technique convient à toute protéine redox pouvant être étudiée par électrochimie en film protéique et apporte une information chimique directe aux mesures électrochimiques.

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