Protéine Film infrarouge électrochimie témoigne pour l’étude de l’oxydation de2 H une hydrogénase [NiFe]

L’objectif global de ce protocole est de sonder la chimie du côté actif d’une enzyme redox de l’hydrogénase nickel-fer dans des conditions de non-renouvellement et de renouvellement électrocatalytique à l’état stationnaire en utilisant l’électrochimie infrarouge à film protéique ou PFIRE. Le principal avantage de la technique PFIRE est qu’elle permet à la fois un contrôle électrochimique précis et un échantillonnage spectroscopique infrarouge de protéines redox immobilisées sur une électrode de carbone. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biophysique et de la bioélectrochimie sur les états de protéine redox présents lors du renouvellement catalytique à l’état d’équilibre.

Pour commencer la procédure, dans une boîte à gants anaérobie humide, suspendez 20 milligrammes de particules de noir de carbone de grande surface dans un millilitre d’eau ultrapure. Sonicez la suspension à faible puissance pendant au moins 15 minutes ou jusqu’à ce que les particules soient uniformément dispersées et qu’aucun sédiment ne se forme dans l’heure au repos. Chargez ensuite 15 microlitres d’une solution d’environ sept milligrammes par millilitre d’E.Coli hydrogénase dans une unité de filtration centrifuge de 50 kilodaltons.

Diluer la solution avec 450 microlitres d’un tampon d’échange de faible force ionique avec un pH proche du point isoélectrique de l’hydrogénase. Concentrer le mélange à 50 microlitres par centrifugation à 27 000 fois g. Reconcentrez le mélange quatre fois de plus pour terminer l’échange de tampon.

Combinez ensuite cinq microlitres de la dispersion de noir de carbone de 20 milligrammes par millilitre avec l’hydrogénase remplacée par le tampon. Conservez le mélange à zéro degré Celsius pendant la nuit pour permettre à l’hydrogénase d’absorber les particules de noir de carbone. Vérifiez périodiquement le mélange pour maintenir la dispersion des particules.

Centrifuger les particules modifiées à 27 000 fois g et vérifier que le surnageant est presque incolore, ce qui indique une bonne absorption de l’hydrogénase par les particules. L’obtention d’un niveau élevé d’absorption est essentielle au succès de l’expérience. Nous optimisons le tampon d’absorption en utilisant le tampon à faible force ionique au pH proche du point isoélectrique de la protéine comme point de départ.

Lavez les particules avec trois à cinq cycles de centrifugation et de remise en suspension dans un tampon d’échange frais. Concentrez le mélange de particules à environ cinq microlitres pour obtenir une charge de particules de 20 milligrammes par millilitre. Pour commencer à vous préparer à prendre des mesures PFIRE, nettoyez un élément de réflexion interne en silicone par sonication à faible puissance dans de l’acide sulfurique pendant 15 minutes.

Suivi d’acide nitrique pendant une heure. Ensuite, rincez l’élément dans de l’eau ultra-pure et séchez-le sous un jet d’azote gazeux sec. Utilisez un mastic silicone de qualité électrique pour fixer l’IRE dans la plaque de base d’un accessoire ATR à cinq réflexions, en prenant soin de maintenir le scellant sur les bords de l’IRE.

Laissez le scellant sécher complètement. Ensuite, placez la plaque de base dans une boîte à gants anaérobie sèche avec une fenêtre transparente IR à côté d’un spectrophotomètre FTIR. Montez la plaque de base sur l’accessoire ATR.

Acquisition d’un spectre d’arrière-plan en mode de balayage rapide. Détachez ensuite la plaque de base de l’accessoire ATR et transférez-la dans la boîte à gants anaérobie humide. Versez uniformément un microlitre de particules de noir de carbone modifié par des enzymes sur la surface de l’IRE sans laisser les particules sécher complètement.

Il est important que le mélange de particules modifiées par des enzymes ait été concentré à une charge aussi proche que possible de 20 milligrammes par millilitre. Sinon, il peut être difficile d’obtenir un film de particules bien connecté lors du dropcasting des particules dans cette étape. Placez délicatement un morceau de papier carbone imbibé d’eau ultrapure sur la surface de l’IRE, en veillant à ce que le film de particules soit recouvert sans permettre au papier d’entrer en contact avec le mastic silicone.

Montez une cellule spectroélectrochimique personnalisée sur l’IRE. Ajoutez 200 microlitres de tampon d’expérience via l’entrée de la solution pour maintenir l’enzyme hydratée pendant la préparation du système. Raccorder l’entrée et la sortie de la solution à un flacon de tampon d’expérience via le tube de la pompe péristaltique.

Transférez ensuite la cellule assemblée dans la boîte à gants secs. Montez l’ensemble de cellules sur l’accessoire ATR et connectez le tube à la pompe péristaltique. Acquérir un spectre absorbant en utilisant le spectre précédemment acquis comme arrière-plan.

Vérifiez que les bandes MI2 sont fortement visibles à 1 540 centimètres réciproques et que les pics du site actif de l’hydrogénase sont détectables dans la région de 1 850 à 2 150. Pour se préparer à l’expérience, appliquez un potentiel réducteur de moins 0,8 volt par rapport à une électrode de référence de calomel saturé au film de particules. Saturer le tampon de l’expérience avec de l’hydrogène gazeux anaérobie.

Ensuite, commencez à faire circuler le tampon à travers la cellule spectroélectrochimique à environ 12 millilitres par minute. Laissez l’échantillon sous le flux du tampon d’expérience saturé d’hydrogène pendant la nuit pour activer l’hydrogénase. Acquérez un spectre absorbant de l’échantillon activé et vérifiez que les bandes CO et CN du site actif présentent plusieurs états réduits.

Ensuite, saturez le tampon d’expérience avec de l’azote gazeux anaérobie et faites circuler le tampon à travers la cellule. Appliquez un potentiel oxydant de zéro volt par rapport à une électrode de référence de calomel saturé pendant 30 minutes et obtenez un spectre absorbant. Appliquez ensuite un potentiel réducteur pendant 30 minutes et acquérez un autre spectre.

Vérifiez que l’enzyme a été complètement oxydée puis réduite. Si ce n’est pas le cas, vérifiez les connexions électriques de la cellule. À l’aide d’un tampon anaérobie saturé d’hydrogène, acquérez une série de voltammogrammes cycliques à des débits croissants afin de déterminer le débit optimal pour l’expérience.

En utilisant ce débit, acquérez des spectres à une gamme de potentiels et de conditions de solution. Les mesures PFIRE de E. coli hydrogénase one ont été obtenues à différents potentiels dans une atmosphère inerte et en présence d’hydrogène gazeux. Les spectres acquis sous une atmosphère d’hydrogène représentaient les distributions à l’état stationnaire des états du site actif présents lors de l’oxydation catalytique de l’hydrogène.

L’oxydation anaérobie et l’activation de l’hydrogénase via la formation de l’état nickel-B à partir du nickel-Si ont ensuite été étudiées en acquérant des spectres à divers moments au cours de l’application potentielle et en préparant différents spectres par rapport au premier spectre. La conversion progressive observée du nickel-Si en nickel-B était cohérente avec la diminution monotone du courant. Des spectres ont également été acquis sur une gamme de pH de solution pour étudier les étapes de transfert de protons du cycle catalytique de l’hydrogénase.

À faible pH, l’état nickel-C était plus répandu tandis que l’état nickel-L était plus répandu à pH élevé. La dépendance au pH des concentrations relatives de nickel-C et de nickel-L a été déterminée à partir des valeurs maximales d’absorbants aux pics respectifs à chaque pH évalué dans l’expérience. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la bioélectrochimie pour explorer la cinétique à l’état d’équilibre de l’activation de l’hydrogène par hydrogenèse.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension d’une expérience PFIRE typique. La technique convient à toute protéine redox qui peut être étudiée par électrochimie de film protéique et ajoute un aperçu chimique direct à la mesure électrochimique.