Tomographie par cohérence optique : Imagerie souris ganglionnaires rétiniennes cellules In Vivo

L'objectif général de cette expérience est d'utiliser la tomographie par cohérence optique, ou OCT, pour obtenir rapidement une évaluation précise de l'épaisseur rétinienne. L'OCT peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'ophtalmologie, comme celles relatives à la neuropathie optique. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'elle constitue une méthode non invasive permettant de détecter des modifications structurelles au niveau des cellules ganglionnaires de la rétine chez la souris.

Cette technique est vraiment intéressante car elle constitue une méthode non invasive, sûre et fiable pour évaluer l'effet d'un traitement dans la neuropathie optique. Pour commencer, réglez d'abord les paramètres du bras de référence adaptés à l'objectif. Ensuite, allumez l'alimentation électrique et l'ordinateur.

Lorsque l'ordinateur est prêt, lancez le programme d'imagerie. Créez une nouvelle étude clinique et ajoutez les protocoles souhaités. Accédez à la section d'examen du patient et définissez les paramètres par défaut de l'examen.

Cliquez sur « Ajouter un patient » dans la section d'examen du patient pour ajouter un nouveau patient et saisir les informations pertinentes relatives au patient. Ensuite, cliquez sur « Ajouter un examen », « Démarrer l'examen », puis ajoutez des examens prédéfinis à partir de la liste afin de sélectionner le protocole souhaité, en commençant par l'œil qui sera mesuré en premier. Au moins 15 minutes avant l'acquisition des données, instillez des gouttes à température ambiante de phényléphrine à 10 % dans chaque œil de toutes les souris devant être testées.

Ensuite, retirez le réactif en excès et instillez des gouttes de tropicamide à 0,5 % à température ambiante. Environ cinq minutes avant l'acquisition, induisez une anesthésie générale. Immédiatement après, administrez de l'hydrochlorure d'oxybuprocaine à 0,4 % dans chaque œil, en laissant la solution en place pendant trois secondes afin d'anesthésier et d'immobiliser les yeux.

Ensuite, retirez les gouttes et répétez l'instillation de phényléphrine à 10 % et de tropicamide à 0,5 %. Lorsque les yeux sont suffisamment dilatés pour l'imagerie, lubrifiez-les avec des gouttes ophtalmiques à base de glycol visqueux afin d'assurer l'hydratation de la cornée, puis enveloppez la souris dans un morceau de gaze chirurgicale pour la maintenir au chaud. À l’aide d’une éponge ou d’un coton-tige, appliquez une fine couche de gel ophtalmique supplémenté avec de l’hypromellose à 0,3 % sur chaque œil.

Pendant ce temps, mettez les cils et les vibrisses de côté. Positionnez la souris dans la cassette avec la tête droite et orientée vers l'avant, puis placez délicatement la barre d'occlusion dans sa bouche. Placez un rouleau de coton sous le côté de l'animal, du côté de l'œil qui est examiné.

Ensuite, tout en maintenant l'embout d'alignement pointé sur la lentille spécifique de la souris, tournez la vis du translateur en sens inverse des aiguilles d'une montre pour rapprocher la lentille de l'œil. Préréglez la position de la souris en tournant et en pivotant la cassette, ainsi qu'en ajustant la barre de morsure et les vis du translateur en x, jusqu'à ce que l'œil expérimental soit positionné de manière à regarder directement dans la lentille. Lorsque l'axe optique des yeux et celui de la lentille sont alignés, sélectionnez la première numérisation dans l'examen.

Cliquez sur Démarrer le pointage et utilisez la vis du translateur z pour déplacer la rétine verticalement dans le panneau gauche et horizontalement dans le panneau droit. En tournant la cassette, déplacez la tête du nerf optique vers le haut ou vers le bas afin de la positionner au centre du panneau droit. Utilisez la vis de la barre d’appui pour aligner la rétine dans le panneau droit et pivotez la cassette pour placer la tête du nerf optique au milieu du panneau gauche.

Ensuite, utilisez la vis de translation pour aligner la rétine dans le panneau gauche et, en gardant à l'esprit la fonction principale de chaque modulateur, ajustez davantage la position de la rétine afin d'obtenir une centralisation parfaite sur la tête du nerf optique. Une fois la rétine positionnée, cliquez sur démarrer la capture pour commencer le balayage par tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral. N'oubliez pas d'enregistrer le balayage et le rapport.

Ajustez la centralisation si nécessaire. Une fois l'analyse terminée, retirez l'objectif et positionnez le deuxième œil comme précédemment démontré. Après avoir analysé le deuxième œil, retirez la souris de la cassette, appliquez un gel ophtalmique contenant 0,3 % d'hypromellose sur chaque œil et placez la souris sur une plaque chauffante avec surveillance jusqu'à récupération complète.

Pour vous concentrer sur les cellules ganglionnaires rétiniennes, utilisez le macro-outil MRI retina créé pour ImageJ. Ouvrez l'outil MRI retina, modifiez l'outil de sélection polygonale et chargez l'image d'intérêt. Cliquez sur M pour commencer la mesure, puis cliquez sur E pour ajuster la position horizontale. Sélectionnez la première cassette dans la fenêtre nouvellement ouverte du gestionnaire de régions d'intérêt.

Cliquez sur le polygone bleu, puis sur les bords de la couche mesurée sur l'image pour ajuster la position de la première cassette. Sélectionnez la deuxième cassette dans la fenêtre du gestionnaire de zones d'intérêt et ajustez la seconde cassette. Ensuite, cliquez sur R pour mesurer à nouveau la rétine et visualiser les résultats dans la fenêtre de mesures.

Bien que la qualité d'un scan OCT en domaine spectral ne soit pas aussi bonne que celle d'une image d'une coupe transversale de la rétine, l'OCT permet de visualiser davantage de couches. Les couches de la rétine sont facilement mesurées sur un scan OCT et comprennent la couche des fibres nerveuses rétiniennes et des cellules ganglionnaires, la couche nucléaire interne, la couche plexiforme externe, la couche nucléaire externe, les couches des segments interne et externe, l'épithélium pigmentaire de la rétine et la choroïde, permettant ainsi une étude complexe de l'ensemble de la rétine. La mesure par OCT de l'épaisseur rétinienne vient d'être démontrée : elle indique que des souris femelles génétiquement mutantes OPA1 présentant un déficit visuel exhibent un épaississement progressif du complexe des cellules ganglionnaires et des couches des fibres nerveuses rétiniennes péripapillaires.

Une comparaison de l'épaisseur de la couche des fibres nerveuses de la rétine dans la couche des cellules ganglionnaires, effectuée à l'aide de pieds à coulisse standards et maison, montre que les pieds à coulisse standards mesurent une épaisseur significativement inférieure à celle mesurée avec les pieds à coulisse maison, car les modèles standards sont beaucoup plus épais et plus difficiles à positionner sur une fine limite de couche. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 15 minutes si elle est exécutée correctement. Après son développement, la tomographie en cohérence optique (OCT) a permis aux chercheurs dans le domaine de l'ophtalmologie d'analyser les modifications structurelles de la rétine murine.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser et analyser l'imagerie par tomographie en cohérence optique des cellules ganglionnaires de la rétine chez la souris.