Name: Tomographie par cohérence optique : Imagerie souris ganglionnaires rétiniennes cellules In Vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Découvrez la tomographie par cohérence optique pour imager les cellules ganglionnaires rétiniennes chez la souris. Cette méthode non invasive permet d'évaluer rapidement l'épaisseur rétinienne et d'étudier les neuropathies optiques.

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Ce travail a été soutenu par l’Inserm, Université de Montpellier, Retina France, Union nationale des Aveugles et Déficients Visuels (UNADEV), Association Syndrome de Wolfram, Fondation pour la Recherche Médicale, Fondation de France et le laboratoire d’Excellence EpiGenMed programme.

le protocole expérimental a été approuvé par l’Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm ; Montpellier, France), est conforme aux directives européennes et est conforme à la déclaration de l’ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmologique. Elle a été menée en vertu de l’accord du Languedoc Roussillon courtoisie d’éthique en expérimentation animale (CEEALR ; nuCEEA-LR-12123).
 1. matériel d’installation et préparation de l’imagerie pré Remarque : ici, l’OCT a été réalisée sur la rétine de souris à l’aide du système d’imagerie ophtalmique domaine spectral (SD) ( Figure 1 a). L’appareil SD-OCT se compose d’une base et un montage d’imagerie animal (AIM), avec une étape de l’alignement de rongeurs (RAS) ( Figure 1 b). La base comprend l’ordinateur, le moteur de l’OCT, la sonde de SD-OCT et la lentille de souris spécifiques. La sonde est montée sur l’objectif, qui inclut le Z-traducteur. Le RAS est utilisé pour positionnement grâce à la table avec le X - et Y-traducteur, la cassette qui peut être pivotée et pivotée, la souris et la barre amovible morsure avec la muserolle. Le logiciel fourni par le fabricant permet l’acquisition et l’analyse des dossiers de l’OCT, bien que ce dernier peut également être fait avec un programme de traitement d’image libre.
<ol><li>Fermement de placer la sonde dans le but.</li>
	<li>Connecter la lentille de souris spécifiques à la sonde.</li>
	<li>Régler les bras référence à l’objectif spécifique (ici, le pouvoir au 086 et situation 964).</li>
	<li>Faire en sorte que la souris spécifique objectif soit assez éloignée de la cassette, fixer la barre de morsure avec la muserolle sur la cassette. 
	NOTE : La distance entre la lentille et la cassette peut être réglée avec la vis Z-traducteur, située à l’arrière de l’objectif. La muserolle est une bande élastique disponible dans le commerce, et sa tension doit être ajustée selon la taille de la souris.</li>
	<li>Allumez l’alimentation (en bas à droite du chariot) et l’ordinateur.</li>
	<li>Pour lancer le programme de formation image, double-cliquez sur le raccourci appropriées sur l’écran. 
	Remarque : Cela dépend du type de lentille ; ici, la souris rétine.</li>
	<li>Créer une nouvelle étude clinique et ajoute les protocoles souhaités. Sinon, utilisez l’étude clinique existante et/ou protocoles.
	<ol><li>Ajoute une nouvelle étude en choisissant la &#34; étude NameŔ &#34; IDŔ &#34; spécifications de bras de traitement &#34; (ici, &#34; Uncategorized &#34;) ; et prédéfinie &#34; Scan des protocoles &#34;, s’ils existent.</li>
	</ol></li> <li>Choisir un &#34; examinateur &#34; dans la &#34; étude clinique &#34; section. 
	Remarque : pour une nouvelle &#34; examinateur &#34;, allez dans &#34; Setup examinateurs &#38; médecins &#34; de définir it.</li>
	<li>Ajouter un nouveau Patient dans l’examen de Patient/section en cliquant sur Ajouter Patient ; entrant dans la &#34; ID &#34;, &#34; nom &#34;, &#34; nom de famille &#34;, &#34; sexe &#34;, et &#34; date de naissance &#34; (facultatif). 
	Remarque : Le faire juste avant de tester chaque souris, si plus commode. Assurez-vous que l’ID n’est pas plu de 10 caractères. Pour la souris, l’erreur de réfraction pour les deux yeux est 0 et la longueur axiale 23,0.</li>
	<li>Cliquez sur &#34; ajouter examen &#34; et sélectionner le &#34; protocole &#34; en ajoutant &#34; Preset scanne &#34; dans la liste, à partir de le œil qui se mesurera d’abord (ici, le œil droit), ou en personnalisant les scannes.</li>
	<li>Pour personnaliser un balayage, utiliser une analyse de l’existante comme modèle et modifier ou créer de toutes pièces par le biais du &#34; ajouter numérisation personnalisée &#34; option. Après avoir ajouté tous les scans dans la liste, définir un nouveau protocole à l’aide de la &#34; Enter &#34; nouveau nom de protocole &#34; option (OS : oculus sinister, gauche oeil ; OD : oculus dexter, juste le œil). 
	NOTE : Ici, le protocole implique trois balayages : (i) une analyse radiale, avec un diamètre de 1,4 mm, décalages horizontaux et verticaux de 0 mm, 1 000 lignes de A-scans/B-scan, 100 B-scans/volume, 1 cadre/B-scan, 80 lignes d’inactif A-scans/B-scan et 1 volume ; (ii) un scan rectangulaire, avec une longueur de 1,4 mm et largeur, angle de 0°, 0 mm décalages horizontaux et verticaux, 1 000 lignes de A-scans/B-scan, 100 B-scans, 1 cadre/B-scan, 80 lignes d’inactif A-scans/B-scan et 1 volume ; et (iii) un annulaire scan, avec un diamètre maximal de 0,4 mm minimum et 0,6 mm, décalages horizontaux et verticaux de 0 mm, 1 000 lignes de 48 images/B-scan, 80 lignes d’inactif A-scans/B-scan et volume 1 A-scans/B-scan, 3 B-scans/volume,.</li>
</ol> 2. Préparation de souris <ol><li>immobilisation et la dilatation de le œil <ol><li>au moins 15 min avant l’acquisition de données, instiller des gouttes phényléphrine 10 % dans les yeux de souris, enlevez le surplus et instiller les gouttes 0,5 % tropicamide. 
		Remarque : La première dilatation peut s’effectuer en une seule fois pour toutes les souris qui seront testés dans la session. Assurez-vous que les liquides sont à température ambiante.</li>
		<li>Immédiatement après anesthésie générale induisant (étape 2.2), administrer 0,4 % oxybuprocaine chlorhydrate gouttes pour les yeux, garder en place pendant 3 s pour anesthésier et immobiliser les yeux. Ensuite, essuyez les gouttes et répétez l’instillation de tropicamide phényléphrine et 0,5 % de 10 % pour s’assurer que les yeux sont bien dilatées. 
		NOTE : Assurez-vous que les liquides soient à température ambiante et que la souris ne pas avaler l’oxybuprocaine.</li>
	</ol></li> <li>Anesthésie générale <ol><li>préparer une solution anesthésique de kétamine (20 mg/mL) et de xylazine (1,17 mg/mL) dans une solution saline. Conserver à 4 ° C pendant un maximum de 2 semaines.</li>
		<li>Environ 5 min avant l’essai, injecter par voie intrapéritonéale de 5 à 10 µL d’une solution anesthésique par 1 g de masse corporelle, selon l’âge et la taille de la souris. 
		NOTE : Young et/ou souris mince besoin moins anesthésique, prendre moins de temps à anesthésier, mais également éveiller plus rapidement. Ici, 8 µL/g (160 mg/kg de kétamine, 9,33 mg/kg de xylazine).</li>
		<li>Éventuellement lubrifier les yeux avec des gouttes pour les yeux visqueux ou un gel ophtalmique pour éviter la sécheresse cornéenne.</li>
	</ol></li></ol> 3. Positionnement de la souris <ol><li>lubrifier les yeux avec des yeux visqueux à base de glycol tombe à fournir hydratation cornéenne. 
	Remarque : Si les yeux semblent secs pendant l’examen, ré-appliquer le collyre.</li>
	<li>Envelopper la souris dans une feuille de gaze chirurgicale pour garder au chaud.</li>
	<li>à l’aide d’une mèche de coton ou une éponge, appliquer une fine couche d’un gel ophtalmique avec 0,3 % hypromellose sur chaque œil, pour minimiser la réfraction de lumière, éviter les opacités et l’hydratation cornéenne sécurisée. Ce faisant, écarter les cils et les moustaches.</li>
	<li>La position de la souris dans la cassette, avec la tête droite et pointage avant.</li>
	<li>Doucement ouvrir la morsure bar pince et placez la barre dans la bouche ; utilisez la muserolle pour fixer la position. 
	Remarque : Vérifiez que la barre de la morsure est au milieu de la cassette.</li>
	<li>Place un coton rouler sous le côté droit (gauche) s’est mis à l’essai le œil droit (gauche).</li>
	<li>Tout en gardant la pointe visée clipsable sur la lentille de souris spécifiques, apportez-le vers le œil en tournant la vis de Z-traducteur dans le sens antihoraire.</li>
	<li>En tournant et pivotant de la cassette et en tournant la barre de la morsure et les vis de X-traducteur, réglé la position de la souris, le but est d’avoir le look oeil droit directement dans l’objectif et donc d’aligner les axes optiques des yeux et la lentille. 
	Remarque : Si la souris est trop élevée ou trop basse, la vis Y-traducteur doit servir d’abord.</li>
	<li>Choisir le premier scan dans le &#34; examen &#34;, cliquez sur &#34; commencer visant &#34; et faire des ajustements plus manuelles pour l’imagerie rétinienne.
	<ol><li>à l’aide de la vis de Z-traducteur, déplacer la rétine verticalement sur le panneau de gauche ( Figure 2, l’alignement Horizontal B-scan) et horizontalement sur le right panneau ( Figure 2, l’alignement Vertical B-scan).</li>
		<li>Tourner la cassette pour amener l’ONH au centre du panneau de droit en déplaçant l’ONH vers le haut ou vers le bas. Utiliser la vis de bar de morsure pour redresser la rétine sur le panneau de droite. Faire pivoter la cassette afin de positionner l’ONH au centre du panneau gauche.</li>
		<li>Utiliser la vis X-traducteur pour niveler la rétine sur le panneau de gauche. Gardant à l’esprit les principales fonctions de chaque modulateur, ajuster davantage la position de la rétine de centraliser l’ONH. 
		Remarque : Utilisez la vis Y-traducteur à l’ONH monter et descendre sur le panneau de droite, si nécessaire. La position peut être raffinée à tout moment entre les balayages.</li>
	</ol></li></ol> 4. SD-OCT d’imagerie de l’ONH et la rétine <ol><li>une fois content avec les réglages, cliquez sur &#34; démarrage instantané &#34; pour commencer la numérisation de SD-OCT.
	<ol><li>Si une imagerie 3D n’est pas nécessaire, décochez l’option OCU.</li>
	</ol></li> <li>Enregistrer l’analyse et le rapport de.</li>
	<li>Continuer avec les prochains scans.</li>
	<li>Pour le deuxième œil de l’image, après le retrait de la lentille, mettez la cassette en conséquence et répétez les étapes 3,6 à 4,3.</li>
</ol> 5. Achèvement de l’acquisition <ol><li>lorsque l’acquisition est terminée, retirez la souris de la cassette, appliquez le gel ophtalmique avec 0,3 % hypromellose à chaque œil et placez la souris sur une plaque chauffante à wake up.</li>
	<li>Après la dernière acquisition, fermez le logiciel et éteignez l’ordinateur et la machine de l’OCT (bouton d’alimentation power).</li>
	<li>Nettoyez la cassette avec désinfectant.</li>
</ol> 6. Analyse <ol><li>pour la mesure de l’épaisseur de la couche rétinienne, utiliser le logiciel de segmentation automatique fourni par le fabricant.
	<ol><li>Cliquez sur le &#34; Patient &#34;, choisissez le désiré &#34; examen &#34; de la liste puis cliquez sur le &#34; examen examen &#34; option.</li>
		<li>Charger les données de OCT désirées sur le logiciel OCT en cliquant-droit sur l’icône de dossier dans la numérisation souhaitée.</li>
		<li>Clic droit sur le B-scan, configurer les étriers en permettant jusqu'à 10 mesure étriers ; et entrer leurs noms, les angles et les couleurs.</li>
		<li>Choisir le calibre désiré par un clic droit sur le B-scan ; Placez-le en conséquence sur la rétine pour mesure. 
		Remarque : Pour les scans centrées sur l’ONH, définissez 5 étriers sur chaque côté de celui-ci, la même distance les uns des autres. Pour l’analyse péripapillaire, assurez-vous que l’étrier n’est pas placée trop loin de l’ONH. Pour la numérisation de la radiale, analyser les 10 photos par balayage qui ont été choisis par le logiciel d’OCT. Leur nombre se trouvent dans le &#34; rapports &#34; dossier.</li>
		<li>Enregistrer les résultats d’analyse dans un logiciel de feuille de calcul en cliquant à droite sur le B-scan en cliquant sur &#34; enregistrer les résultats de &#34;. 
		Remarque : Les résultats se trouvent dans le même dossier que les données de scannage.</li>
	</ol></li> <li>Vous pouvez également utiliser la macro maison étrier &#34; MRI rétine outil &#34;, développés pour un programme de traitement d’image open source (voir la Table des matières).
	<ol><li>S’assurer que le &#34; outil de rétine MRI &#34; et la &#34; modifier l’outil Polygone Section &#34; macros sont actifs. Charger l’image. Cliquez sur la touche m pour démarrer la mesure. 
		Remarque : La macro crée automatiquement un 0,2 mm de long mesurant la cassette sur les deux côtés de l’ONH. Chaque cassette contient 5 points de mesure qui fonctionnent comme les étriers. Leur position latérale est immuable et est adaptée pour le peripapilla dans les scans radiales. La position horizontale des cassettes est prédéfinie pour mesurer l’épaisseur de la CFNR/GCL, mais il est facilement modifiable pour mesurer la couche complexe GC à la place. Si la qualité de numérisation est pauvre, la position horizontale doit être ajustée ou l’image doit être exclue de l’analyse.</li>
		<li>Pour le réglage horizontal, cliquez sur le bouton e. Dans le nouvellement ouvert &#34; Gestionnaire de ROI &#34; fenêtre, choisissez la première cassette.</li>
		<li>Cliquez sur le polygone bleu bouton et ajustez la position de la première cassette en cliquant sur les frontières de la couche déterminée dans l’image.</li>
		<li>Répétition pour la deuxième cassette de premier choix dans le &#34; ROI Manager &#34; fenêtre et puis en cliquant sur l’image appropriée. Cliquez sur le bouton r pour remesurer. Afficher les résultats dans les &#34; mesures &#34; fenêtre. 
		Remarque : Les résultats peuvent être copiés vers un logiciel de feuille de calcul à tout moment. Ils contiennent les valeurs suivantes pour la cassette droite (r), cassette gauche (l) et au total : Intden - densité intégrée au sein de la cassette ; Zone : zone de la mesure en mm 2 ; Len : longueur de la pince dans la cassette, en mm ; Moyenne : moyenne intensité du signal dans la cassette ; et Std : écart-type de l’intensité moyenne du signal de.</li>
		<li>Procéder à la prochaine image.</li>
		<li>Encore analyse les données dans un logiciel tableur. 
		Remarque : Pour trouver l’épaisseur moyenne de la couche, prendre la Len dix valeurs.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Drexler, W., Fujimoto, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-of-the-art+retinal+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">State-of-the-art retinal optical coherence tomography.</a> Prog Retin Eye Res. 27 (1), 45-88 (2008).</li>
<li>Grenier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WFS1+in+Optic+Neuropathies%3A+Mutation+Findings+in+Nonsyndromic+Optic+Atrophy+and+Assessment+of+Clinical+Severity%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">WFS1 in Optic Neuropathies: Mutation Findings in Nonsyndromic Optic Atrophy and Assessment of Clinical Severity.</a> Ophthalmology. 123 (9), 1989-1998 (2016).</li>
<li>Zmyslowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+thinning+as+a+marker+of+disease+progression+in+patients+with+Wolfram+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Retinal thinning as a marker of disease progression in patients with Wolfram syndrome.</a> Diabetes Care. 38 (3), e36-e37 (2015).</li>
<li>Fischer, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive%2C+in+vivo+assessment+of+mouse+retinal+structure+using+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography.</a> PLoS One. 4 (10), e7507(2009).</li>
<li>Grieve, K., Thouvenin, O., Sengupta, A., Borderie, V. M., Paques, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+of+the+Retina+With+Full-Field+Optical+Coherence+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Appearance of the Retina With Full-Field Optical Coherence Tomography.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (9), OCT96-OCT104 (2016).</li>
<li>Chang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+degeneration+mutants+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal degeneration mutants in the mouse.</a> Vision Res. 42 (4), 517-525 (2002).</li>
<li>Mustafa, S., Pandit, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approach+to+diagnosis+and+management+of+optic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+India%22%5BJournal%5D)">Approach to diagnosis and management of optic neuropathy.</a> Neurol India. 62 (6), 599-605 (2014).</li>
<li>Sarzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+OPA1delTTAG+mutation+induces+premature+age-related+systemic+neurodegeneration+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The human OPA1delTTAG mutation induces premature age-related systemic neurodegeneration in mouse.</a> Brain. 135 (Pt 12), 3599-3613 (2012).</li>
<li>Sarzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+steroidogenesis+promotes+early-onset+and+severe+vision+loss+in+females+with+OPA1+dominant+optic+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Increased steroidogenesis promotes early-onset and severe vision loss in females with OPA1 dominant optic atrophy.</a> Hum Mol Genet. 25 (12), 2539-2551 (2016).</li>
<li>Delettre-Cribaillet, C., Hamel, C. P., Lenaers, G., et al. Optic Atrophy Type 1. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1248/">Gene Reviews</a>. Pagon, R. A. 7 (2007), University of Washington. Seattle. (2007).</li>
<li>Lenaers, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+optic+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+J+Rare+Dis%22%5BJournal%5D)">Dominant optic atrophy.</a> Orphanet J Rare Dis. 7 (46), (2012).</li>
<li>Delettre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+gene+OPA1%2C+encoding+a+mitochondrial+dynamin-related+protein%2C+is+mutated+in+dominant+optic+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Nuclear gene OPA1, encoding a mitochondrial dynamin-related protein, is mutated in dominant optic atrophy.</a> Nat Genet. 26 (2), 207-210 (2000).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+retinal+morphologic+and+functional+changes+in+mice+following+optic+nerve+crush%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Monitoring retinal morphologic and functional changes in mice following optic nerve crush.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (6), 3766-3774 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le système de l’OCT, un non invasif en vivo méthode, d’imagerie fournit haute résolution scans rétiniens de cross-transversalement-comme. Ainsi, son principal avantage est la possibilité d’une analyse détaillée, avec l’occasion merveilleuse de transposer les protocoles couramment appliqués aux humains, aux modèles de souris.
Dans l’exemple de Opa1delTTAG souris mutantes, SD-OCT résultats ont montré une augmentation de l’épaisseur de couche complexe CFNR et GC, qui ...

OCT est un outil de diagnostic qui facilite l’examen des structures rétiniennes1, y compris la tête du nerf optique (ONH). Au fil des ans, il est devenu un indicateur fiable de la progression de la maladie chez les humains2,3, ainsi que dans les rongeurs4,5. Il utilise l’interférométrie pour créer des images en coupe transversale des couches de la rétiniens avec une résolution axiale de 2 µm. La couche la plus profonde est la fibres nerveuses rétiniennes de couche (CFNR), contenant des axones de la CJR, qui est suivie par la couche de cellules de ganglion (GCL), contenant pour la plupart des corps RGC. Ensuite est la couche plexiforme interne (IPL), confluent de dendrites RGC axones cellules bipolaires, horizontales et amacrines. Ceux-ci, ainsi que les cellules horizontales, forment la couche nucléaire interne (INL), et leurs saillies se connecter avec les axones des photorécepteurs dans la couche plexiforme externe (OPL). Ceci est suivi par la couche nucléaire externe (ONL), avec le corps des cellules photoréceptrices et est séparée de la couche des photorécepteurs de la membrane limitante externe (OLM), également appelée segment segment interne/externe (IS / OS) couche. Enfin, les dernières couches observables dans la rétine de souris sont l’épithélium pigmentaire rétinien (RPE) et la choroïde (C). La CFNR seul est normalement trop mince pour être mesurées chez la souris ; ainsi, analyser la CFNR/GCL est plutôt préférable de4,5. Une autre possibilité est la couche complexe GC, qui contient en plus de l’IPL, rendant plus épais et donc encore plus facile à mesurer sur OCT scanne4. Par conséquent, OCT peut donnent un aperçu de l’état pathologique de la rétine, comme dans les foules.
Par ailleurs, l’épaisseur de la rétine de souris est souvent analysée avec histologie post-mortem . Cependant, cette technique visages limites de prélèvement tissulaire, fixation, coupe, coloration, montage, etc. donc, quelques défauts, tels que les changements subtils d’épaisseur, ne peuvent pas être détectés. Enfin, parce que la même souris ne peuvent pas être testée à temps plusieurs points, le nombre d’animaux par étude grandement augmente, à la différence pour OCT. Dans l’ensemble, la caractère non invasif, haute résolution, possibilité de répétition, suivi de temps en temps et facilité d’utilisation de la technologie OCT rendent la méthode de choix dans les études de la maladie de la rétine.
Modèles de souris sont utilisées pour identifier les défauts de gène et à élucider les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les rétinopathies6. OPN est une forme de rétinopathie avec d’importants dégâts au nerf optique (sur), qui est constitué des axones environ 1,2 millions de RGC. OPN peut se concentrer sur le ON ou peut être secondaire à d’autres troubles, innées ou pas7, conduisant à la perte du champ visuel et plus tard, la cécité. Les traits caractéristiques de l’OPN sont perte RGC et sur les dommages, qui peuvent être observés dans les PTOM humaine que CFNR et GCL amincissement2,3. Pendant ce temps, la physiopathologie de l’OPN est encore mal comprise, et donc la nécessité de tester la rétine de souris reste.
Ce manuscrit décrit l’imagerie et la quantification de l’épaisseur de la couche rétinienne, à l’aide de l’exemple de la Opa1delTTAG souris ligne8,9, un modèle d’atrophie optique dominante (DOA)10. Pour évaluer la physiopathologie de la CJR, balayages radiaux, rectangulaires et annulaires ont été quantifiées. Cela a été fait avec étriers standards fournis par le logiciel OCT ou avec une macro maison mis au point un programme de traitement d’images open source. Les étriers standards sont difficiles à manipuler et souvent plus épais que la CFNR/GCL, tandis que les étriers de maison sont faciles à utiliser, reproductibles et plus précis. La macro effectue une mesure pour une couche automatiquement détectée, en 5 points et à des positions fixes, des deux côtés de l’ONH dans la région péripapillaire. Le protocole présenté vise à décrire l’acquisition scan OCT pour spécifier le positionnement rétinienne, en mettant l’accent sur les CGR.

<table><tbody><tr><td>Mice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opa1delTTAG souris</td><td>Institut des Neurosciences de Montpellier, INSERM UMR 1051,</td><td></td> <td>France-Opa1 knock-in mice carrying&nbsp ; Mutation OPA1 c.2708_2711delTTAG sur fond C57Bl6/J</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System</td><td>Bioptigen, Leica Microsystems, Allemagne</td><td>-</td><td>Système de tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral</td></tr><tr><td>EnVisu R2200 SD-OCT Logiciel du système d’imagerie</td><td>Bioptigen, Leica Microsystems,</td> <td>Allemagne-Logiciel</td> <td>pour l’acquisition et l’analyse OCT</td></tr><tr><td>ImageJ 1.48v</td><td>Wayne Rasband, National Institutes of Health, États-Unis-Logiciel pour l’analyse</td><td></td><td>, nécessite le téléchargement et l’installation de deux macros maison : http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool</td></tr><tr><td>Plaque chauffante autorégulante</td><td>Bioseb, France</td><td>BIO-062</td><td>Protection contre l’hypothermie</td></tr><tr><td>Nom</strong</td><td>>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>SuppliesNosering</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>-</td><td>-Élastique</td><td></td></tr><tr><td>Tampons de gaze 3 » x 3"</td><td>Curad, USA</td><td>CUR20434ERB</td><td>Protection contre l’hypothermie</td></tr><tr><td>Applicateur à embout en coton à double extrémité</td><td>Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA-Application</td><td></td> <td>de gel</td></tr><tr><td>Cotton Twists</td><td>CentraVet, France</td><td>T.7979C.CS</td><td>Positionnement de la souris</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Réactifs et médicaments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N&eacute ; osyn&eacute ; phrine Faure 10 %</td><td>Laboratoires Europhtha,</td><td></td> <td>Monaco-Dilatation oculaire</td></tr><tr><td>Mydriaticum 0.5 %</td><td>Laboratoires Th&eacute ; a, France</td><td>3397908</td><td>Dilatation oculaire</td></tr><tr><td>Cébésine 0,4 %</td><td>Laboratoire Chauvin, Bausch& Lomb, France</td><td>3192342</td><td>Anesthésie locale</td></tr><tr><td>Imalgene 1000</td><td>Merial, France/CentraVet, France</td><td>IMA004</td><td>Anesthésie générale</td></tr><tr><td>Rompun</td><td>Bayer Healthcare, Allemagne/CentraVet, France</td><td>ROM001</td><td>Anesthésie générale, analgésie, relaxation musculaire</td></tr><tr><td>NaCl 0.9 %</td><td>Laboratoire Osalia, France&nbsp ;</td><td>103697114</td><td>Sérum physiologique</td></tr><tr><td>Systene Ultra</td><td>Alcon, Novartis,</td> <td>USA-Hydratation</td> <td>des yeux</td></tr><tr><td>GenTeal’Alcon</td><td>, Novartis, USA-Gel</td><td></td> <td>ophtalmique pour minimiser la réfraction de la lumière et les opacités</td></tr><tr><td>Aniospray Surf 29</td><td>Laboratoires Anios, France</td><td>59844</td><td>Désinfectant</td></tr></tbody></table>

tomographie par cohérence optique : imagerie souris ganglionnaires rétiniennes cellules in vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Des changements structurels dans la rétine sont des manifestations fréquentes de maladies ophtalmiques. Tomographie par cohérence optique (OCT) permet leur identification en vivo— rapidement, répétitive et en haute résolution. Ce protocole décrit l’imagerie OCT dans la rétine de souris comme un outil puissant pour étudier les neuropathies optiques (OPN). Le système OCT est une alternative non invasive, basée sur l’interférométrie à commune analyses histologiques post-mortem . Il fournit une évaluation rapide et précise de l’épaisseur rétinienne, prévoyant la possibilité de suivre les changements, tels que la rétine amincissement ou épaississement. Nous présentons le processus et l’analyse d’imagerie avec l’exemple de la lignée de sourisdelTTAG Opa1. Trois types d’analyses sont proposées, avec deux méthodes de quantification : étriers standards et faits maison. Ce dernier est préférable pour une utilisation sur la rétine péripapillaire lors des balayages radiaux ; être plus précis, est préférable pour l’analyse des structures plus fines. Toutes les approches décrites ici sont conçues pour des cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC) mais sont facilement adaptables à d’autres populations cellulaires. En conclusion, l’OCT est efficace pour le phénotypage de modèle de souris et a le potentiel d’être utilisé pour l’évaluation fiable des interventions thérapeutiques.

La technologie SD-OCT permet d’imaginer rétinienne et l’analyse d’épaisseur qui est comparable à l’histologie, mais est plus rapide et plus détaillée (Figure 3). Tel que présenté avec les souris C57Bl/6 type sauvage, même si la qualité d’une analyse de SD-OCT (Figure 3 a, droite) n’est pas aussi bonne que celle d’une image d’une coupe de rétine (Figure 3 a, à gauche), il visualise plusieurs calques (...

Ce manuscrit décrit un protocole pour l’imagerie in vivo de la rétine de souris avec tomographie à cohérence optique haute résolution de domaine spectral (SD-OCT). Il se concentre sur les cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC) dans la région péripapillaire, avec plusieurs de numérisation et de quantifier les approches décrites.

Tomographie par cohérence optique : Imagerie souris ganglionnaires rétiniennes cellules In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

L'objectif général de cette expérience est d'utiliser la tomographie par cohérence optique, ou OCT, pour obtenir rapidement une évaluation précise de l'épaisseur rétinienne. L'OCT peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'ophtalmologie, comme celles relatives à la neuropathie optique. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'elle constitue une méthode non invasive permettant de détecter des modifications structurelles au niveau des cellules ganglionnaires de la rétine chez la souris.Cette technique est vraiment intéressante car elle constitue une méthode non invasive, sûre et fiable pour évaluer l'effet d'un traitement dans la neuropathie optique. Pour commencer, réglez d'abord les paramètres du bras de référence adaptés à l'objectif. Ensuite, allumez l'alimentation électrique et l'ordinateur.Lorsque l'ordinateur est prêt, lancez le programme d'imagerie. Créez une nouvelle étude clinique et ajoutez les protocoles souhaités. Accédez à la section d'examen du patient et définissez les paramètres par défaut de l'examen.Cliquez sur « Ajouter un patient » dans la section d'examen du patient pour ajouter un nouveau patient et saisir les informations pertinentes relatives au patient. Ensuite, cliquez sur « Ajouter un examen », « Démarrer l'examen », puis ajoutez des examens prédéfinis à partir de la liste afin de sélectionner le protocole souhaité, en commençant par l'œil qui sera mesuré en premier. Au moins 15 minutes avant l'acquisition des données, instillez des gouttes à température ambiante de phényléphrine à 10 % dans chaque œil de toutes les souris devant être testées.Ensuite, retirez le réactif en excès et instillez des gouttes de tropicamide à 0,5 % à température ambiante. Environ cinq minutes avant l'acquisition, induisez une anesthésie générale. Immédiatement après, administrez de l'hydrochlorure d'oxybuprocaine à 0,4 % dans chaque œil, en laissant la solution en place pendant trois secondes afin d'anesthésier et d'immobiliser les yeux.Ensuite, retirez les gouttes et répétez l'instillation de phényléphrine à 10 % et de tropicamide à 0,5 %. Lorsque les yeux sont suffisamment dilatés pour l'imagerie, lubrifiez-les avec des gouttes ophtalmiques à base de glycol visqueux afin d'assurer l'hydratation de la cornée, puis enveloppez la souris dans un morceau de gaze chirurgicale pour la maintenir au chaud. À l’aide d’une éponge ou d’un coton-tige, appliquez une fine couche de gel ophtalmique supplémenté avec de l’hypromellose à 0,3 % sur chaque œil.Pendant ce temps, mettez les cils et les vibrisses de côté. Positionnez la souris dans la cassette avec la tête droite et orientée vers l'avant, puis placez délicatement la barre d'occlusion dans sa bouche. Placez un rouleau de coton sous le côté de l'animal, du côté de l'œil qui est examiné.Ensuite, tout en maintenant l'embout d'alignement pointé sur la lentille spécifique de la souris, tournez la vis du translateur en sens inverse des aiguilles d'une montre pour rapprocher la lentille de l'œil. Préréglez la position de la souris en tournant et en pivotant la cassette, ainsi qu'en ajustant la barre de morsure et les vis du translateur en x, jusqu'à ce que l'œil expérimental soit positionné de manière à regarder directement dans la lentille. Lorsque l'axe optique des yeux et celui de la lentille sont alignés, sélectionnez la première numérisation dans l'examen.Cliquez sur Démarrer le pointage et utilisez la vis du translateur z pour déplacer la rétine verticalement dans le panneau gauche et horizontalement dans le panneau droit. En tournant la cassette, déplacez la tête du nerf optique vers le haut ou vers le bas afin de la positionner au centre du panneau droit. Utilisez la vis de la barre d’appui pour aligner la rétine dans le panneau droit et pivotez la cassette pour placer la tête du nerf optique au milieu du panneau gauche.Ensuite, utilisez la vis de translation pour aligner la rétine dans le panneau gauche et, en gardant à l'esprit la fonction principale de chaque modulateur, ajustez davantage la position de la rétine afin d'obtenir une centralisation parfaite sur la tête du nerf optique. Une fois la rétine positionnée, cliquez sur démarrer la capture pour commencer le balayage par tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral. N'oubliez pas d'enregistrer le balayage et le rapport.Ajustez la centralisation si nécessaire. Une fois l'analyse terminée, retirez l'objectif et positionnez le deuxième œil comme précédemment démontré. Après avoir analysé le deuxième œil, retirez la souris de la cassette, appliquez un gel ophtalmique contenant 0,3 % d'hypromellose sur chaque œil et placez la souris sur une plaque chauffante avec surveillance jusqu'à récupération complète.Pour vous concentrer sur les cellules ganglionnaires rétiniennes, utilisez le macro-outil MRI retina créé pour ImageJ. Ouvrez l'outil MRI retina, modifiez l'outil de sélection polygonale et chargez l'image d'intérêt. Cliquez sur M pour commencer la mesure, puis cliquez sur E pour ajuster la position horizontale. Sélectionnez la première cassette dans la fenêtre nouvellement ouverte du gestionnaire de régions d'intérêt.Cliquez sur le polygone bleu, puis sur les bords de la couche mesurée sur l'image pour ajuster la position de la première cassette. Sélectionnez la deuxième cassette dans la fenêtre du gestionnaire de zones d'intérêt et ajustez la seconde cassette. Ensuite, cliquez sur R pour mesurer à nouveau la rétine et visualiser les résultats dans la fenêtre de mesures.Bien que la qualité d'un scan OCT en domaine spectral ne soit pas aussi bonne que celle d'une image d'une coupe transversale de la rétine, l'OCT permet de visualiser davantage de couches. Les couches de la rétine sont facilement mesurées sur un scan OCT et comprennent la couche des fibres nerveuses rétiniennes et des cellules ganglionnaires, la couche nucléaire interne, la couche plexiforme externe, la couche nucléaire externe, les couches des segments interne et externe, l'épithélium pigmentaire de la rétine et la choroïde, permettant ainsi une étude complexe de l'ensemble de la rétine. La mesure par OCT de l'épaisseur rétinienne vient d'être démontrée : elle indique que des souris femelles génétiquement mutantes OPA1 présentant un déficit visuel exhibent un épaississement progressif du complexe des cellules ganglionnaires et des couches des fibres nerveuses rétiniennes péripapillaires.Une comparaison de l'épaisseur de la couche des fibres nerveuses de la rétine dans la couche des cellules ganglionnaires, effectuée à l'aide de pieds à coulisse standards et maison, montre que les pieds à coulisse standards mesurent une épaisseur significativement inférieure à celle mesurée avec les pieds à coulisse maison, car les modèles standards sont beaucoup plus épais et plus difficiles à positionner sur une fine limite de couche. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 15 minutes si elle est exécutée correctement. Après son développement, la tomographie en cohérence optique (OCT) a permis aux chercheurs dans le domaine de l'ophtalmologie d'analyser les modifications structurelles de la rétine murine.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser et analyser l'imagerie par tomographie en cohérence optique des cellules ganglionnaires de la rétine chez la souris.

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Cette vidéo présente une technique d’imagerie in vivo pour détecter et quantifier l’inflammation oculaire dans un modèle murin d’uvéite post-infectieuse. Cette technique, connue sous le nom de tomographie par cohérence optique (OCT), génère des images en coupe transversale à haute résolution de l’œil pour évaluer la progression de la maladie.

Imagerie par tomographie par cohérence optique pour l’évaluation de l’uvéite dans un modèle murin

Source : Wang, Z., et al. Imagerie transpupillaire à deux photons in vivo de la rétine de souris.  J. Vis. Exp. (2021). Cette vidéo présente une technique d’imagerie rétinienne in vivo utilisant la microscopie à deux photons. Les souris anesthésiées sont préparées pour l’imagerie en fixant leur tête, en appliquant un lubrifiant pour les yeux et en plaçant une lamelle sur l’œil. Les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) exprimant des protéines fluorescentes sont d’abord visualisées à l’aide...

Imagerie in vivo à deux photons de la rétine de la souris

Source : Jagodzinska, J., et. al., Tomographie par cohérence optique : imagerie des cellules ganglionnaires rétiniennes de souris In Vivo. J. Vis. Exp. (2017)  Dans cette vidéo, nous démontrons l’utilisation de la tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral (SD-OCT) pour imager les couches rétiniennes et évaluer les changements structurels dans un modèle de souris génétiquement modifié avec neuropathie optique.

Imagerie in vivo de la rétine de souris par tomographie par cohérence optique

Ce protocole décrit comment haute résolution techniques d’imagerie comme la tomographie par cohérence optique de domaine spectral et numérisation laser ophtalmologique peut être utilisé dans les petits rongeurs, à l’aide d’un système de plate-forme d’imagerie ophtalmique, pour obtenir des informations sur épaisseur de la rétine et microgliales cellulaire distribution, respectivement.

In Vivo Imagerie des souris journaliste Cx3cr1gfp/gfp avec domaine Spectral Optical Coherence Tomography et numérisation Laser ophtalmologique

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Ici, nous décrivons l’utilisation de la tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral (SD-OCT) pour visualiser les structures rétiniennes et oculaires in vivo dans des modèles de dégénérescence rétinienne, de glaucome, de rétinopathie diabétique et de myopie.

Évaluations structurales in vivo des maladies oculaires dans des modèles de rongeurs utilisant la tomographie par cohérence optique

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Transpupillaire Imagerie in vivo à deux photons de la rétine de souris

Nous décrivons ici une technique d’imagerie in vivo utilisant la tomographie par cohérence optique pour faciliter le diagnostic et la mesure quantitative de la rétinopathie chez la souris.

Application de la tomographie par cohérence optique à un modèle murin de rétinopathie

Le présent protocole décrit les étapes de l’alignement des images in vivo de la tomographie par cohérence optique en lumière visible (vis-OCTF) avec des images confocales ex vivo de la même rétine de souris dans le but de vérifier la morphologie observée des faisceaux axonaux des cellules ganglionnaires de la rétine dans les images in vivo.

Alignement de fibrogrammes de tomographie par cohérence optique en lumière visible avec des images confocales de la même rétine de souris

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Une préparation isolée rétinienne pour enregistrer la réponse de Lumière génétiquement marqués cellules ganglionnaires rétiniennes

Découvrez la tomographie par cohérence optique pour imager les cellules ganglionnaires rétiniennes chez la souris. Cette méthode non invasive permet d'évaluer rapidement l'épaisseur rétinienne et d'étudier les neuropathies optiques.

Tomographie par cohérence optique : Imagerie souris ganglionnaires rétiniennes cellules In Vivo

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