Name: PIP-on-a-chip: une étude sans étiquette des interactions protéines-phosphoinositide (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Découvrez l'essai PIP-on-a-chip pour étudier sans étiquette les interactions protéines-membranes sur une plateforme microfluidique. Cette méthode physiologiquement pertinente offre une alternative biologique aux techniques traditionnelles utilisant des détergents.

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DS et la CCE ont été soutenus, en partie, par la subvention AI053531 (NIAID, NIH); SS et PSC ont été soutenus par la subvention N00014-14-1-0792 (ONR).

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Chaque variante PIP, bien que faiblement concentrée, est présente sur la surface cytosolique d&#39;organites spécifiques où elle contribue à l&#39;établissement d&#39;une composition physique unique et de la spécificité fonctionnelle de la membrane organellaire 1 . L&#39;une des utilisations les plus importantes des PIP est une plate-forme d&#39;amarrage spécifique pour la multitude de protéines nécessitant une localisation et / ou une activation sous-cellulaire spécifiques 6</s...

De nombreuses interactions et processus biochimiques se déroulent sur des surfaces à membrane bidimensionnellement fluides. Les organites membranaires dans les cellules eucaryotes sont exclusives non seulement dans les procédés biochimiques et leur protéome associé, mais également dans leur composition lipidique. Une classe exceptionnelle de phospholipides est la phosphoinositide (PIP). Bien qu&#39;ils ne représentent que 1% du lipidome cellulaire, ils jouent un rôle crucial dans la transduction du signal, l&#39;autophagie et le trafic de la membrane, entre autres 1 , 2 , 3 , 4 . La phosphorylation dynamique du groupe de tête d&#39;inositol par les PIP kinases cellulaires donne naissance à sept groupes de tête PIP mono-, bis- ou tris-phosphorylés 5 . En outre, les PIP définissent l&#39;identité subcellulaire des membranes et servent de sites d&#39;ancrage membranaire spécialisés pour les protéines / enzymes contenant un ou plusieurs phosphoinosItide-binding domains, par exemple, Pleckstrin Homology (PH), Phox Homology (PX) et epsin N-terminal Homology (ENTH) 6 , 7 . L&#39;un des domaines de liaison au PIP le mieux étudié est le domaine de phospholipase C (PLC) -δ1 PH qui interagit spécifiquement avec le phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI (4,5) P 2 ) dans une affinité de gamme micromolaire élevée à haut nanomolaire 8 , 9 , 10 , 11 . Une variété de méthodes qualitatives et quantitatives in vitro ont été développées et utilisées pour étudier le mécanisme, la thermodynamique et la spécificité de ces interactions. Parmi les tests de liaison au PIP les plus couramment utilisés, on trouve la résonance plasmonique de surface (SPR), la calorimétrie isotherme (ITC), la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN), le test de flottation / sédimentation de liposomes et les transferts de lipides (Fat-blots / PIP-strips)12 , 13 . Bien que ceux-ci soient largement utilisés, ils ont tous de nombreux inconvénients. Par exemple, le SPR, l&#39;ITC et la RMN nécessitent de grandes quantités d&#39;échantillons, d&#39;instruments coûteux et / ou de personnel formé 12 , 13 . Certains formats de dosage tels que des lipides à base d&#39;anticorps utilisent des formes hydrosolubles de PIP et les présentent de manière non physiologique 12 , 14 , 15 , 16 . En outre, les transferts de lipides ne peuvent être quantifiés de manière fiable et ils ont souvent abouti à des observations fausses positives / négatives 12 , 17 , 18 . Pour surmonter ces défis et améliorer l&#39;ensemble d&#39;outils actuel, une nouvelle méthode sans étiquette a été établie sur la base d&#39;une bicouche lipidique supportée (SLB) dans le contexte d&#39;am<html> Icrofluidic platform, qui a été appliquée avec succès à l&#39;étude des interactions protéine-PIP ( figure 1 ) 19 . La stratégie utilisée pour détecter les interactions protéines-PIP est basée sur la détection de la modulation du pH. Cela implique un colorant sensible au pH qui a ortho -Sulforhodamine B ( o SRB) directement conjugué au groupe 20 de tête de lipide de phosphatidyléthanolamine. La sonde o SRB-POPE (figure 2A) est hautement fluorescent à faible pH et désactivé à un pH élevé avec un pKa d&#39; environ 6,7 à moins de 7,5% en moles de PI (4,5) P2 contenant SLBS (figure 5B). Le domaine de PLC-δ1 PH a été largement utilisé pour valider les méthodologies de liaison aux protéines-PIP en raison de sa spécificité élevée vis-à-vis de PI (4,5) P 2 ( Figure 5A ) 21 , 22 ,&quot;&gt; 23 , 24 , 25. Par conséquent, nous avons estimé que le domaine PLC-δ1 PH peut être utilisé pour tester sa liaison à PI (4,5) P 2 à travers le test PIP-on-a-chip. La construction de domaine PH utilisé dans cette étude a une charge positive nette (pI 8,4) et attire ainsi OH -. ions (Figure 5C) Lors de la liaison de PI (4,5) P2 contenant SLBS, le domaine PH apporte les ions OH - au surface de la membrane, ce qui module le potentiel interfacial et déplace l&#39;état de protonation de o SRB-POPE (Figure 5C) 26. en fonction de la concentration PH de domaine, la fluorescence est éteinte (Figure 6A). Enfin, les données normalisées est S&#39;adapter à une isotherme de liaison pour déterminer l&#39;affinité de l&#39;interaction PH-PI (4,5) P 2 ( Figure 6B , 6C ). &lt;/ P&gt; Dans cette étude, un protocole détaillé est fourni pour effectuer la liaison des protéines aux SLB contenant du PIP dans une plate-forme microfluidique. Ce protocole permet au lecteur d&#39;assembler le dispositif microfluidique et la préparation des vésicules à la formation de SLB et à la liaison des protéines. De plus, le mode d&#39;analyse de données pour extraire des informations affinité pour le domaine de PH PI-PLC-δ1 (4,5) P 2 interaction sont fournis.

<table><tbody><tr><td>Coverslip</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass Coverslips : Rectangles</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544B</td><td>22 x 40 x 0,16 - 0,19 mm, n° 1 1/2 ; Verre borosilicaté</td></tr><tr><td>7X Solution de nettoyage</td><td>MP Biomedicals</td><td>976670</td><td>Détergent</td></tr><tr><td>PYREX Plat de cristallisation</td><td>Corning</td><td>3140-190</td><td>Plat en verre borosilicaté à fond plat ; Diamètre x Hauteur (190 x 100 mm) ; Distributeur : VWR (89090-700)</td></tr><tr><td>Sentry Xpress 2.0</td><td>Paragon Industries</td><td>SC-2</td><td>Kiln</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>PDMS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer</td><td>Kit Dow Corning</td><td>4019862</td><td>polydiméthylsiloxane (PDMS) ; Distributeur : Ellsworth Adhesives</td></tr><tr><td>PYREX Desiccator</td><td>VWR</td><td>89134-402</td><td></td></tr><tr><td>Poinçon de biopsie</td> sous vide <td>Harris</td><td>15110-10</td><td>Harris Uni-Core ; 1,0 mm de diamètre ; Poinçon de biopsie Miltex avec piston (Cat. N° 15110-10) peut être utilisé comme alternative</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Device</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasma Cleaning System</td><td>PlasmaEtch</td><td>PE25-JW</td><td>Pompe à vide d’huile à entraînement direct à 2 étages, Service O2 (Krytox Charged)</td></tr><tr><td>Digital Hot Plate</td><td>Benchmark</td><td>H3760-H</td><td>Acheté auprès de Denville Scientific (Cat. N° 1005640)</td></tr><tr><td>Micro Slides givrées</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>Givrées, sélectionnées et prénettoyées ; Fabriqué en verre suisse ; Epaisseur : 1 mm ; Dimensions : 75 x 25 mm ; GR 144</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Mold</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>Autodesk</td><td>v.2016</td><td>Logiciel de dessin pour la conception de photomask</td></tr><tr><td>Photomask</td><td>CAD/Art Services</td><td>N/A N/A</td><td>Le design avec un fond noir et des caractéristiques claires a été imprimé à une résolution de 20k dpi sur un masque transparent (5 x 7 po) par CAD/Art Services</td></tr><tr><td>Silicone</td><td>Wafers University</td><td>1575</td><td>Prime Grade, Single Sided Polished ; 100 mm (4 inch) Diamètre ; 525 um Thickness</td></tr><tr><td>SU-8 50</td><td>MicroChem Corp.</td><td>N/A</td><td>Photorésine à tons négatifs ; Propriété de l’installation de nanofabrication de Penn State</td></tr><tr><td>SU-8 Développeur</td><td>MicroChem Corp.</td><td>N/A</td><td>Penn State Nanofabrication Facility Property</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>Numéro de catalogue</strong</td><td>>Comments</strong</td></tr><tr><td>>SUV</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457C</td><td>POPC</td></tr><tr><td>L-&alpha ;-phosphatidylinositol-4-phosphate</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840045X</td><td>PI4P</td></tr><tr><td>L-&alpha ;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840046X</td><td>PI(4,5)P2</td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850757C</td><td>POPE ; Requis pour la synthèse du chlorure de sulfonyle oSRB-POPE</td></tr><tr><td>Lissamine Rhodamine B (isomères mélangés)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L-20</td> Requis pour la synthèse de la sonde lipidique fluorescente sensible au pH <td>oSRB-POPE</td></tr><tr><td>(oSRB-POPE)</td>Synthèse interne <td></td><td>N/A</td><td>(Huang D. et al. 2013)</td></tr><tr><td>Flacon à scintillation en verre</td><td>VWR</td><td>66022-065</td><td>Capacité de 20 mL</td></tr><tr><td>Aquasonic 250D</td><td>VWR</td><td>N/A</td><td>Membrane à bain d’eau par ultrasons</td></tr><tr><td>Nuclepore gravée sur chenilles</td><td>Membrane en polycarbonate 110605 WHATMAN</td><td></td><td> ; Diamètre : 25 mm ; Taille des pores : 0,1 um ; Distributeur : Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR</td><td>CX1054-6</td><td></td></tr><tr><td>Extrudeuse LIPEX</td> de qualité HPLC <td>Transferra Nanosciences</td><td>T.001</td><td>LIPEX 10 mL Extrudeuse</td></tr><tr><td>Thermobarrel Viscotek 802 DLS</td><td>Malvern Instruments</td><td>N/A</td><td>Diffusion dynamique de la lumière ; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Data Analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>Software v.6</td><td>Logiciel d’ajustement de courbe pour l’analyse de données</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 200M Microscope à épifluorescence</td><td>Carl Zeiss Microscopie</td><td>N/A</td><td>Microscope</td></tr><tr><td>AxioCam MRm</td><td>Microscopie Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Caméra</td></tr><tr><td>X-Cite 120</td><td>Excelitas Technologies</td><td>N/A</td><td>Source lumineuse</td></tr><tr><td>Alexa 568 Jeu de filtres</td><td>Carl Zeiss Microscopie</td><td>N/A</td><td>EX/Em 576/603 nm</td></tr><tr><td>Logiciel AxioVision LE64 v.4.9.1.0</td><td>Microscopie Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Logiciel de traitement d’image</td></tr><tr><td>Name</td><td><Company></td><td> Numéro de catalogue </td><td>Comments</td></tr><tr><td>Other</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tips</td><td>VWR</td><td>10034-132</td><td>200 uL pointes de pipette ; Pointe fine et lisse pour l’application de la solution protéique dans le canal microfluidique</td></tr><tr><td>Pointes</td><td>VWR</td><td>53509-070</td><td>10 uL pointes de pipette ; Pointe fine et lisse pour l’application de la solution vésiculaire dans le canal microfluidique</td></tr><tr><td>PH-mètre Orion Star A321 PH-mètre</td><td>STARA3210</td><td></td><td>Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Micro Sonde de pH</td><td>Orion Thermo Scientific</td><td>8220BNWP</td><td>Microsonde de pH</td></tr><tr><td>N-(2-Hydroxyéthyl)-Pipérazine-N'-(Acide 2-Éthanesulfonique)</td><td>VWR</td><td>VWRB30487</td><td>HEPES, Chlorure de</td></tr><tr><td>sodium</td> acide libre <td>VWR</td><td>BDH8014-2.5KGR</td> Tube <td>NaCl</td></tr><tr><td></td><td>Fil allié & Câble</td><td>TFT-200-24 N</td><td>Diamètre intérieur : 0,020-0,026 pouces (0,051-0,066 cm) ; Épaisseur de la paroi : 0,010 pouces (0,025 cm) ; Tubes souples en polytétrafluoroéthylène à paroi mince ; </td></tr><tr><td>Azote gazeux</td> de couleur naturelle - <td>Industriel Praxair</td><td>N/A</td><td>Fournisseur local</td></tr><tr><td>Oxygène gazeux - Industriel</td><td>Praxair</td><td>N/A</td><td>Fournisseur local</td></tr><tr><td>Azote liquide</td><td>Praxair</td><td>N/A</td><td>Fournisseur local</td></tr></tbody></table>

pip-on-a-chip: une étude sans étiquette des interactions protéines-phosphoinositide

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

De nombreuses protéines cellulaires interagissent avec les surfaces membranaires pour affecter les processus cellulaires essentiels. Ces interactions peuvent être dirigées vers un composant lipidique spécifique dans une membrane, comme dans le cas des phosphoinositides (PIP), pour assurer une localisation et / ou une activation sous-cellulaires spécifiques. Les PIP et les domaines de liaison cellulaire PIP ont été largement étudiés pour mieux comprendre leur rôle dans la physiologie cellulaire. Nous avons appliqué un test de modulation du pH sur les bicouches lipidiques supportées (SLB) comme outil pour étudier les interactions protéines-PIP. Dans ces études, la phosphatidyléthanolamine conjuguée à l&#39; ortho -Sulforhodamine B est utilisée pour détecter les interactions protéine-PIP. Lors de la liaison d&#39;une protéine à une surface de membrane contenant du PIP, le potentiel interfacial est modulé ( c.-à-d. Le changement du pH local), en déplaçant l&#39;état de protonation de la sonde. Une étude de cas de l&#39;utilisation réussie du test de modulation de pH est présentée en utilisant la phospholipase C delta1 PleckstrDans le domaine de l&#39;homologie (PLC-δ1 PH) et de l&#39;interaction phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI (4,5) P 2 ) à titre d&#39;exemple. La constante de dissociation apparente ( K d, app ) pour cette interaction était de 0,39 ± 0,05 μM, similaire à K d, valeurs d&#39; application obtenues par d&#39;autres. Comme précédemment observé, le domaine PLC-δ1 PH est PI (4,5) P 2 spécifique, montre une liaison plus faible au phosphatidylinositol 4-phosphate et ne se lie pas aux SLB de phosphatidylcholine pure. Le dosage PIP-on-a-chip est avantageux par rapport aux essais traditionnels de liaison au PIP, y compris, mais sans s&#39;y limiter, le faible volume de l&#39;échantillon et les exigences d&#39;étiquetage du ligand / récepteur, la capacité de tester des interactions membranaires à haute et faible affinité avec les petits et les petits De grandes molécules et un rapport signal / bruit amélioré. En conséquence, l&#39;utilisation de l&#39;approche PIP-on-a-chip facilitera l&#39;élucidation des mécanismes d&#39;une large gamme d&#39;interactions membranaires. En outre, cette méthode pourrait être possibleDans l&#39;identification des agents thérapeutiques qui modulent la capacité des protéines à interagir avec les membranes.

Nous avons utilisé le test de modulation du pH pour étudier l&#39;interaction PLC-δ1 PH-PI (4,5) P 2 dans un micro-dispositif PIP-on-a-chip ( Figure 1 ). Grâce à un protocole détaillé, nous avons démontré comment préparer et assembler les composants des dispositifs microfluidiques, fabriquer de petites vésicules unilamellaires (VUS) ( Figure 2 ), former des SLB dans un dispositif ( Figure 3</stron...

Nous présentons ici une bicouche lipidique supportée dans le contexte d&#39;une plate-forme microfluidique pour étudier les interactions protéines-phosphoinositides en utilisant une méthode sans étiquette basée sur la modulation du pH.

PIP-on-a-chip: une étude sans étiquette des interactions protéines-phosphoinositide

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

L’objectif global du test PIP-on-a-chip est d’évaluer les interactions entre les membranes protéiques de manière quantitative et sans marquage. Les interactions protéiques membranaires sont au cœur de nombreux processus de la cellule et de ses agents pathogènes, mais les techniques pour étudier ces interactions sont rares. Les avantages de cette technique sont un faible volume simple, aucune exigence de marquage de ligand ou de récepteur combinée à la possibilité de tester les interactions membranaires d’une manière physiologiquement pertinente.De nombreuses cibles thérapeutiques des virus sont des protéines membranaires, les études de ces protéines cibles sont souvent effectuées en solution à l’aide de détergents. Notre technique offre une alternative plus pertinente sur le plan biologique. Bien que vous voyiez que ce test est capable de surveiller les interactions des protéines avec les membranes, il s’agit en fait d’un test assez polyvalent qui peut être utilisé pour surveiller les interactions entre les membranes de fer, les petites molécules et même les membranes peptidiques.Pour commencer, mélangez le prépolymère de polydiméthylsiloxane ou PDMS et l’agent de durcissement dans un rapport de 10:1, dans un grand bateau de pesée en plastique. Dégazez le mélange sous vide pendant une heure avec une intensité de vide de 500 tor ou moins. Placez le maître en silicium qui contient plusieurs répétitions du même micromotif SU8 dans un grand bateau de pesée en plastique et versez le PDMS de dégazage, puis durcissez-le dans un four sec à 60 degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain, décollez délicatement le PDMS du maître en silicone à l’aide de vos mains. Marquez les limites de chaque micro-motif en rectangles à l’aide d’un scalpel chirurgical et d’une règle. Ensuite, coupez le PDMS en blocs, percez 16 trous aux deux extrémités de chaque micro canal avec un poinçon de biopsie, pour faire des trous de 1,0 millimètre de diamètre.La pipette a calculé les volumes de phosphatidylcholine, de phosphatidylinositol 4, de 5-bisphosphate et de sonde fluorescente sensible au pH dans un seul flacon de ventilation en verre de 20 millilitres. Faites sécher le mélange dans un courant d’azote gazeux à l’intérieur de la hotte chimique pendant 10 minutes ou jusqu’à ce que le solvant s’évapore et que la fine pellicule lipidique se forme au fond du flacon. Ensuite, desséchez le mélange sous vide pendant au moins trois heures à une intensité de vide de 10 millimètres pour éliminer tout solvant organique résiduel.Réhydratez le film lipidique séché avec cinq millilitres de tampon courant, placez le lipide réhydraté dans un bain à ultrasons à une fréquence de fonctionnement de 35 kilohertz pendant 30 minutes à température ambiante. Congelez et décongelez la suspension vésiculaire avec de l’azote liquide et le bain-marie à 40 degrés Celsius pour obtenir des vésicules unilaminaires. Répétez le gel-dégel 10 fois, extrudez la suspension de la vésicule jusqu’à une membrane en polycarbonate de 0,1 micron à bord de piste, à l’aide d’un extrudeur de lipides pour enrichir les petites vésicules unilaminaires.Répétez l’extrusion 10 fois. Testez les entrées et les sorties du bloc PDMS pour détecter tout blocage en injectant de l’eau désionisée à travers les trous à l’aide d’une bouteille de lavage d’eau, puis séchez le bloc PDMS avec de l’azote gazeux. Ensuite, placez le bloc PDMS et la lamelle de recouvrement pré-nettoyée à l’intérieur de la chambre d’échantillonnage du système de plasma d’oxygène.Exposez le bloc PDMS et la lamelle avec du plasma d’oxygène pendant 45 secondes avec les réglages de puissance à 75 watts, la vitesse d’écoulement d’oxygène à 10 centimètres cubes par minute et la force de vide de 200 millitors. Ensuite, placez la surface du motif du bloc PDMS en contact avec la lamelle de recouvrement immédiatement après le traitement au plasma d’oxygène. Appuyez doucement pour éliminer les bulles d’air aux points de contact.Placez l’appareil sur une plaque chauffante de niveau à 100 degrés Celsius pendant trois minutes pour améliorer la liaison. Utilisez une lingette humide non pelucheuse avec de l’éthanol à 100 % pour éliminer toutes les particules de poussière du haut et du bas de l’appareil. Ensuite, collez l’appareil sur une lame de microscope en verre.Transférez 100 microlitres de Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate contenant de petites vésicules unilaminaires dans un tube de microcentrifugation de 0,65 millilitre. Ajustez le pH de la solution à environ 3/2 en ajoutant 6,4 microlitres d’acide chlorhydrique normal 0,2. Pipetez 10 microlitres de la petite solution de vésicule unilaminaire au pH ajusté dans chaque canal par l’entrée et appliquez une pression à travers la pipette jusqu’à ce que la solution atteigne la sortie.Détachez l’embout de la pipette et laissez-le attaché à l’appareil. Après avoir répété cette étape pour chaque canal, incubez l’appareil pendant 10 minutes à température ambiante, l’injection des vésicules dans les micro-canaux doit être effectuée immédiatement après l’assemblage de l’appareil. Pendant ce temps, coupez des ensembles de tubes d’entrée et de sortie, à l’aide d’une pince à épiler, connectez l’ensemble de tubes de sortie à l’appareil, puis collez l’appareil sur une platine de microscope.Immergez une extrémité du tube d’entrée dans 25 millilitres de tampon de coulée contenu dans un tube conique et collez-le pour vous assurer que le tube est bien fixé. À l’aide d’un vérin de laboratoire, placez le tube conique sur un sol plus élevé que l’appareil afin de pousser la solution à travers les micro-canaux par gravité. Pour chaque tube d’entrée, utilisez une seringue pour prélever un millilitre de tampon de coulée à l’extrémité libre du tube.Retirez l’embout de la pipette de l’entrée et insérez l’extrémité libre du tube d’entrée dans l’appareil. Répétez ce processus pour connecter tous les morceaux de tube d’entrée à l’appareil. L’écoulement du tampon à travers les canaux permet d’éliminer les vésicules non rompues en excès et d’équilibrer la bicouche dans les conditions expérimentales.Ensuite, ouvrez le logiciel de contrôle du microscope. Dans le panneau de gauche, cliquez sur l’onglet microscope et choisissez l’objectif 10x. Cliquez sur en direct, puis sur les icônes d’image Alexa 568 dans la barre d’outils, à l’aide des boutons de réglage fin et grossier, concentrez-vous sur les micro-canaux.Parcourez l’appareil pour vérifier la qualité des SLB et des canaux. Ensuite, cliquez sur l’icône de l’image fermée de l’obturateur FL dans la barre d’outils, cliquez sur l’onglet d’acquisition et, sous les réglages de base, sélectionnez le temps d’exposition. Réglez le temps d’exposition sur 200 millisecondes.Dans le panneau de gauche, cliquez sur acquisition multidimensionnelle. Dans le menu des filtres, sélectionnez le canal rouge. Ensuite, cliquez sur le menu timelapse, réglez l’intervalle de temps sur cinq minutes, la durée sur 30 minutes et le menu lapse.Sélectionnez l’outil cercle sous l’onglet Mesure et dessinez un cercle dans n’importe quel canal. Faites un clic droit pendant que le cercle est sélectionné et choisissez propriétés. Sous l’onglet profil, cochez tous les T pour afficher l’intensité de fluorescence en fonction du temps.Assurez-vous que cette courbe atteint un plateau qui indique l’équilibre avant de passer à l’étape suivante, abaissez la solution tampon à un niveau égal à celui de l’appareil, pour arrêter l’écoulement. Un à la fois, détachez chaque tube de sortie et appliquez 200 microlitres de chaque dilution de protéine dans le canal de sortie à l’aide d’une pipette. N’appliquez aucune pression, laissez la gravité faire le travail.Détachez l’embout de la pipette et laissez-le fixé au dispositif microfluidique. Répétez ce processus pour chaque canal et assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est introduite dans les canaux pendant ce processus. Ensuite, abaissez le tube d’entrée jusqu’à un sol sous le dispositif microfluidique pour commencer à faire circuler la protéine à travers les microcanaux.Collez l’extrémité libre du tube sur un conteneur à déchets. Faites couler les dilutions du domaine d’homologie de la pleckstrine pendant 30 minutes. Sur le panneau gauche du logiciel, sous l’onglet timelapse, cliquez sur démarrer, pour recommencer l’imagerie.Voici une vue représentative des SLB contenant du phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate dans les microcanaux. Avant et après, l’ajout du domaine d’homologie de la pleckstrine aux concentrations indiquées. Les intensités de fluorescence de la raie balayée à travers les micro-canaux sont tracées en fonction de la distance et des pixels pour les expériences de liaison à la phosphatidylcholine, au phosphate de phosphatidylinositol 4 et au phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate.Ensuite, normaliser les données de liaison des expériences individuelles, est tracé en fonction de la concentration du domaine d’homologie de la phospholipase C delta 1 pleckstrin et ajusté à un isoterme de liaison pour extraire les constantes d’association apparentes. La comparaison des constantes d’association apparentes montre que le domaine d’homologie de la phospholipase C Delta 1 pleckstrin interagit spécifiquement avec le phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate, comme prévu. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de fabriquer de petites vésicules unilaminaires, de fabriquer des dispositifs microfluidiques, de former des bicouches lipidiques soutenues à l’intérieur de ces dispositifs microfluidiques, en tant qu’interactions de liaison entre vos membranes protéiques, en utilisant ce test avec notre approche PIP-on-a-chip.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois heures si elle est correctement exécutée. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la récupération de fluorescence après photoblanchiment peuvent être effectuées afin d’évaluer l’effet de la liaison membranaire des protéines sur la diffusion latérale des lipides. Cette technique ouvre la voie à l’étude des interactions protéiques membranaires avec l’assemblage des lipides présents dans les cellules au lieu d’un à la fois, cette approche aura donc un impact large sur la biochimie et la biologie cellulaire des interactions protéiques membranaires.

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Dans cette vidéo, nous démontrons les interactions protéine-phosphoinositide dans un motif microfluidique à l’aide du test de modulation du pH, en utilisant un colorant fluorescent sensible au pH marqué sur le lipide phosphatidyléthanolamine d’une bicouche lipidique supportée, appelée plateforme microfluidique. Les modulations du pH après la liaison des protéines aux phospholipides provoquent l’extinction de la fluorescence.

Dosage de la modulation du pH sur les bicouches lipidiques supportées pour détecter les interactions protéine-phosphoinositide

Phosphoinositides sont des lipides dont l'abondance relative change rapidement en réponse à divers stimuli de signalisation. Cet article décrit une méthode pour mesurer l'abondance des phosphoinositides par les cellules métaboliquement étiquetage avec 3 H- myo-inositol, suivie par l'extraction et la désacylation. Glycéro-inositides extraites sont ensuite séparés par chromatographie en phase liquide à haute performance et quantifiés par scintillation de flux.

Radiomarquage et la quantification des niveaux cellulaires de phosphoinositides par chromatographie liquide haute performance couplée flux scintillation

PI (4,5) P2 régule diverses fonctions cellulaires, mais son organisation à l' échelle nanométrique dans la membrane plasmique de la cellule est mal comprise. Par étiquetage PI (4,5) P 2 avec une sonde fluorescente à double couleur fusionnée au domaine Pleckstrin Homology, nous décrivons une nouvelle approche pour étudier la PI (4,5) P2 distribution spatiale dans la membrane plasmatique à l'échelle du nanomètre .

Simple-molécule Super-résolution Imaging de phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate dans la membrane plasmique avec nouveaux Fluorescent Probes

Le protocole ici décrit les interactions de protéine purifiée hEAG1 de canal ionique avec la petite molécule lipidique ligand phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2). La mesure démontre que BLI pourrait être une méthode potentielle pour le dépistage de nouvelles petites molécules ion canal ligand.

Capturer la cinétique de l’Interaction d’une protéine canal ionique avec petites molécules par le dosage de l’interférométrie Bio-couche

Ce protocole se concentre sur l'identification des protéines qui se lient aux phosphates inositol ou phosphoinositides. Il utilise la chromatographie d'affinité avec les phosphates d'inositol biotinylated ou les phosphoinositides qui sont immobilisés par l'intermédiaire de streptavidin à l'agarose ou des perles magnétiques. Les protéines de liaison du phosphate d'inositol ou du phosphoinositide sont identifiées par le ballonnement occidental ou la spectrométrie de masse.

Identification du phosphate d'inositol ou du phosphoinositide Protéines interactatrices par chromatographie d'affinité couplée à la fente occidentale ou à la spectrométrie de masse

Ici, nous décrivons des protocoles utilisant des capteurs lipidiques fluorescents et des liposomes pour déterminer si une protéine extrait et transporte de la phosphatidylsérine ou du phosphatidylinositol 4-phosphate in vitro.

Mesures basées sur la fluorescence de l’échange phosphatidylsérine/phosphatidylinositol 4-phosphate entre les membranes

Nous présentons ici un protocole pour l’enrichissement des phosphoprotéines phosphatases endogènes et de leurs protéines en interaction à partir de cellules et de tissus et leur identification et quantification par spectrométrie de masse protéomique.

Une approche basée sur la spectrométrie de masse pour identifier les phosphoprotéines phosphatases et leurs interacteurs

Une nouvelle approche qui permet l'analyse de la haute résolution des interactions cellulaires du cancer avec l'acide hyaluronique exogène (HA) est décrite. Surfaces texturées sont fabriqués en combinant la chimie carbodiimide et l'impression par microcontact.

Surfaces Micropatterned pour étudier les interactions acide hyaluronique avec les cellules cancéreuses

La spectroscopie Raman est une technique appropriée pour le contact non-, sans étiquette analyse de cellules vivantes, de l'ingénierie tissulaire constructions et des tissus indigènes. Source spécifiques empreintes spectrales peuvent être générées et analysées en utilisant une analyse multivariée.

Sans contact, sans étiquette de surveillance des cellules et la matrice extracellulaire en utilisant la spectroscopie Raman

Nous décrivons une méthode de microscopie corrélative qui combine la microscopie à haute vitesse 3D de cellules vivantes fluorescent lumière et de haute résolution tomographie cryo-électronique. Nous démontrons la capacité de la méthode corrélative par imagerie dynamique, les petites VIH-1 particules en interaction avec des cellules HeLa d'accueil.

Microscopie corrélative pour l&#39;analyse structurale 3D des interactions dynamiques

Découvrez l'essai PIP-on-a-chip pour étudier sans étiquette les interactions protéines-membranes sur une plateforme microfluidique. Cette méthode physiologiquement pertinente offre une alternative biologique aux techniques traditionnelles utilisant des détergents.

PIP-on-a-chip: une étude sans étiquette des interactions protéines-phosphoinositide

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