PIP-on-a-chip: une étude sans étiquette des interactions protéines-phosphoinositide

L’objectif global du test PIP-on-a-chip est d’évaluer les interactions entre les membranes protéiques de manière quantitative et sans marquage. Les interactions protéiques membranaires sont au cœur de nombreux processus de la cellule et de ses agents pathogènes, mais les techniques pour étudier ces interactions sont rares. Les avantages de cette technique sont un faible volume simple, aucune exigence de marquage de ligand ou de récepteur combinée à la possibilité de tester les interactions membranaires d’une manière physiologiquement pertinente.

De nombreuses cibles thérapeutiques des virus sont des protéines membranaires, les études de ces protéines cibles sont souvent effectuées en solution à l’aide de détergents. Notre technique offre une alternative plus pertinente sur le plan biologique. Bien que vous voyiez que ce test est capable de surveiller les interactions des protéines avec les membranes, il s’agit en fait d’un test assez polyvalent qui peut être utilisé pour surveiller les interactions entre les membranes de fer, les petites molécules et même les membranes peptidiques.

Pour commencer, mélangez le prépolymère de polydiméthylsiloxane ou PDMS et l’agent de durcissement dans un rapport de 10:1, dans un grand bateau de pesée en plastique. Dégazez le mélange sous vide pendant une heure avec une intensité de vide de 500 tor ou moins. Placez le maître en silicium qui contient plusieurs répétitions du même micromotif SU8 dans un grand bateau de pesée en plastique et versez le PDMS de dégazage, puis durcissez-le dans un four sec à 60 degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, décollez délicatement le PDMS du maître en silicone à l’aide de vos mains. Marquez les limites de chaque micro-motif en rectangles à l’aide d’un scalpel chirurgical et d’une règle. Ensuite, coupez le PDMS en blocs, percez 16 trous aux deux extrémités de chaque micro canal avec un poinçon de biopsie, pour faire des trous de 1,0 millimètre de diamètre.

La pipette a calculé les volumes de phosphatidylcholine, de phosphatidylinositol 4, de 5-bisphosphate et de sonde fluorescente sensible au pH dans un seul flacon de ventilation en verre de 20 millilitres. Faites sécher le mélange dans un courant d’azote gazeux à l’intérieur de la hotte chimique pendant 10 minutes ou jusqu’à ce que le solvant s’évapore et que la fine pellicule lipidique se forme au fond du flacon. Ensuite, desséchez le mélange sous vide pendant au moins trois heures à une intensité de vide de 10 millimètres pour éliminer tout solvant organique résiduel.

Réhydratez le film lipidique séché avec cinq millilitres de tampon courant, placez le lipide réhydraté dans un bain à ultrasons à une fréquence de fonctionnement de 35 kilohertz pendant 30 minutes à température ambiante. Congelez et décongelez la suspension vésiculaire avec de l’azote liquide et le bain-marie à 40 degrés Celsius pour obtenir des vésicules unilaminaires. Répétez le gel-dégel 10 fois, extrudez la suspension de la vésicule jusqu’à une membrane en polycarbonate de 0,1 micron à bord de piste, à l’aide d’un extrudeur de lipides pour enrichir les petites vésicules unilaminaires.

Répétez l’extrusion 10 fois. Testez les entrées et les sorties du bloc PDMS pour détecter tout blocage en injectant de l’eau désionisée à travers les trous à l’aide d’une bouteille de lavage d’eau, puis séchez le bloc PDMS avec de l’azote gazeux. Ensuite, placez le bloc PDMS et la lamelle de recouvrement pré-nettoyée à l’intérieur de la chambre d’échantillonnage du système de plasma d’oxygène.

Exposez le bloc PDMS et la lamelle avec du plasma d’oxygène pendant 45 secondes avec les réglages de puissance à 75 watts, la vitesse d’écoulement d’oxygène à 10 centimètres cubes par minute et la force de vide de 200 millitors. Ensuite, placez la surface du motif du bloc PDMS en contact avec la lamelle de recouvrement immédiatement après le traitement au plasma d’oxygène. Appuyez doucement pour éliminer les bulles d’air aux points de contact.

Placez l’appareil sur une plaque chauffante de niveau à 100 degrés Celsius pendant trois minutes pour améliorer la liaison. Utilisez une lingette humide non pelucheuse avec de l’éthanol à 100 % pour éliminer toutes les particules de poussière du haut et du bas de l’appareil. Ensuite, collez l’appareil sur une lame de microscope en verre.

Transférez 100 microlitres de Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate contenant de petites vésicules unilaminaires dans un tube de microcentrifugation de 0,65 millilitre. Ajustez le pH de la solution à environ 3/2 en ajoutant 6,4 microlitres d’acide chlorhydrique normal 0,2. Pipetez 10 microlitres de la petite solution de vésicule unilaminaire au pH ajusté dans chaque canal par l’entrée et appliquez une pression à travers la pipette jusqu’à ce que la solution atteigne la sortie.

Détachez l’embout de la pipette et laissez-le attaché à l’appareil. Après avoir répété cette étape pour chaque canal, incubez l’appareil pendant 10 minutes à température ambiante, l’injection des vésicules dans les micro-canaux doit être effectuée immédiatement après l’assemblage de l’appareil. Pendant ce temps, coupez des ensembles de tubes d’entrée et de sortie, à l’aide d’une pince à épiler, connectez l’ensemble de tubes de sortie à l’appareil, puis collez l’appareil sur une platine de microscope.

Immergez une extrémité du tube d’entrée dans 25 millilitres de tampon de coulée contenu dans un tube conique et collez-le pour vous assurer que le tube est bien fixé. À l’aide d’un vérin de laboratoire, placez le tube conique sur un sol plus élevé que l’appareil afin de pousser la solution à travers les micro-canaux par gravité. Pour chaque tube d’entrée, utilisez une seringue pour prélever un millilitre de tampon de coulée à l’extrémité libre du tube.

Retirez l’embout de la pipette de l’entrée et insérez l’extrémité libre du tube d’entrée dans l’appareil. Répétez ce processus pour connecter tous les morceaux de tube d’entrée à l’appareil. L’écoulement du tampon à travers les canaux permet d’éliminer les vésicules non rompues en excès et d’équilibrer la bicouche dans les conditions expérimentales.

Ensuite, ouvrez le logiciel de contrôle du microscope. Dans le panneau de gauche, cliquez sur l’onglet microscope et choisissez l’objectif 10x. Cliquez sur en direct, puis sur les icônes d’image Alexa 568 dans la barre d’outils, à l’aide des boutons de réglage fin et grossier, concentrez-vous sur les micro-canaux.

Parcourez l’appareil pour vérifier la qualité des SLB et des canaux. Ensuite, cliquez sur l’icône de l’image fermée de l’obturateur FL dans la barre d’outils, cliquez sur l’onglet d’acquisition et, sous les réglages de base, sélectionnez le temps d’exposition. Réglez le temps d’exposition sur 200 millisecondes.

Dans le panneau de gauche, cliquez sur acquisition multidimensionnelle. Dans le menu des filtres, sélectionnez le canal rouge. Ensuite, cliquez sur le menu timelapse, réglez l’intervalle de temps sur cinq minutes, la durée sur 30 minutes et le menu lapse.

Sélectionnez l’outil cercle sous l’onglet Mesure et dessinez un cercle dans n’importe quel canal. Faites un clic droit pendant que le cercle est sélectionné et choisissez propriétés. Sous l’onglet profil, cochez tous les T pour afficher l’intensité de fluorescence en fonction du temps.

Assurez-vous que cette courbe atteint un plateau qui indique l’équilibre avant de passer à l’étape suivante, abaissez la solution tampon à un niveau égal à celui de l’appareil, pour arrêter l’écoulement. Un à la fois, détachez chaque tube de sortie et appliquez 200 microlitres de chaque dilution de protéine dans le canal de sortie à l’aide d’une pipette. N’appliquez aucune pression, laissez la gravité faire le travail.

Détachez l’embout de la pipette et laissez-le fixé au dispositif microfluidique. Répétez ce processus pour chaque canal et assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est introduite dans les canaux pendant ce processus. Ensuite, abaissez le tube d’entrée jusqu’à un sol sous le dispositif microfluidique pour commencer à faire circuler la protéine à travers les microcanaux.

Collez l’extrémité libre du tube sur un conteneur à déchets. Faites couler les dilutions du domaine d’homologie de la pleckstrine pendant 30 minutes. Sur le panneau gauche du logiciel, sous l’onglet timelapse, cliquez sur démarrer, pour recommencer l’imagerie.

Voici une vue représentative des SLB contenant du phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate dans les microcanaux. Avant et après, l’ajout du domaine d’homologie de la pleckstrine aux concentrations indiquées. Les intensités de fluorescence de la raie balayée à travers les micro-canaux sont tracées en fonction de la distance et des pixels pour les expériences de liaison à la phosphatidylcholine, au phosphate de phosphatidylinositol 4 et au phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate.

Ensuite, normaliser les données de liaison des expériences individuelles, est tracé en fonction de la concentration du domaine d’homologie de la phospholipase C delta 1 pleckstrin et ajusté à un isoterme de liaison pour extraire les constantes d’association apparentes. La comparaison des constantes d’association apparentes montre que le domaine d’homologie de la phospholipase C Delta 1 pleckstrin interagit spécifiquement avec le phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate, comme prévu. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de fabriquer de petites vésicules unilaminaires, de fabriquer des dispositifs microfluidiques, de former des bicouches lipidiques soutenues à l’intérieur de ces dispositifs microfluidiques, en tant qu’interactions de liaison entre vos membranes protéiques, en utilisant ce test avec notre approche PIP-on-a-chip.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois heures si elle est correctement exécutée. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la récupération de fluorescence après photoblanchiment peuvent être effectuées afin d’évaluer l’effet de la liaison membranaire des protéines sur la diffusion latérale des lipides. Cette technique ouvre la voie à l’étude des interactions protéiques membranaires avec l’assemblage des lipides présents dans les cellules au lieu d’un à la fois, cette approche aura donc un impact large sur la biochimie et la biologie cellulaire des interactions protéiques membranaires.