Analyse du Gap Junction-dependent Transfert de miARN avec microscopie 3D-FRAP

L’objectif global de cette procédure est d’étudier le transfert de micro-ARN dépendant de la jonction lacunaire dans les cardiomyocytes vivants. Cette méthode peut aider à aborder le rôle des micro-ARN dans le système de transaction de signaux intercellulaires. Le principal avantage de cette technique est que l’échange de jonctions lacunaires des micro-ARN peut être visualisé et quantifié dans les cellules vivantes avec une haute résolution spatio-temporelle.

Après avoir isolé les cardiomyocytes selon le protocole textuel, placez les cellules sur des plaques à six puits à une densité de trois fois 10 à la cinquième cellule par centimètre carré. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, ajoutez 0,5 trypzine aux cellules et incubez les cultures pendant cinq minutes pour détacher les cellules.

Inactiver la trypzine en ajoutant du milieu de culture cellulaire. Après avoir compté les cellules, centrifugez-les à 300 fois g pendant 10 minutes. Ensuite, utilisez un tampon d’électroporation pour remettre les cellules en suspension à quatre fois 10 à la cinquième cellules par 100 microlitres.

Ensuite, mélangez 100 microlitres de suspension cellulaire avec des micro-ARN fluorescents dans un tube et chargez le mélange dans une cuvette d’électroporation. Effectuez ensuite l’électroporation à l’aide du programme G009 sur l’électroporateur. Ajoutez 500 microlitres de milieu de culture cellulaire préchauffé et transférez tout le volume de suspension cellulaire dans un puits d’une lame de chambre à fond de verre à quatre puits.

Cultivez les cellules pendant une journée à 37 degrés Celsius, dans une atmosphère de dioxyde de carbone à 5 %. Après avoir préchauffé l’incubateur du microscope et allumé le système confusique, insérez la lame de la chambre dans le porte-échantillon de la platine. Utilisez un objectif à huile de 1,4 na et une lumière d’excitation laser de 561 nanomètres, à faible puissance laser, avec une portée de détection de 570 à 680 nanomètres pour trouver l’amas de cardiomyocytes transvectés.

Ensuite, dans le gestionnaire de configuration, activez les boutons z-stack, séries chronologiques, blanchiment et régions. Ensuite, pour définir les paramètres de frap, dans le menu du mode d’acquisition, réglez la taille de l’image sur 512 par 512, le pas de ligne sur un et le temps de balayage sur moins d’une seconde. Dans le menu des canaux, ajustez les paramètres de puissance, de décalage et de gain du laser pour obtenir une fluorescence maximale à partir d’une excitation laser minimale, afin d’éviter la saturation de l’intensité.

Ensuite, réglez la taille du sténopé sur deux micromètres. Ensuite, dans le menu des régions, sélectionnez l’outil de dessin roy et utilisez le curseur pour marquer la cellule cible, la cellule de référence et la zone d’arrière-plan. Si nécessaire, sélectionnez plusieurs cellules cibles pour le blanchiment photo.

Dans le menu de blanchiment, ajustez les paramètres de blanchiment des photos. Ensuite, dans le menu z-stack, définissez les limites d’acquisition z-stack, en fonction de l’épaisseur des cellules. Ajustez le nombre de couches z à 12 tp 15, puis démarrez l’expérience de frap et enregistrez la récupération de fluorescence.

Pour analyser les données, créez une projection maximale des piles z acquises à l’aide d’un logiciel spécifique au microscope, traitement des clics, projection d’intensité maximale, sélectionnez un fichier, appliquez. Enfin, copiez les données d’intensité de fluorescence à tous les points temporels de la cible, de l’arrière-plan et de la cellule de référence, dans une feuille de calcul et effectuez l’analyse des données selon le protocole texte. On voit ici des cardiomyocytes isolés avec le motif typique d’alpha-actinine striée et de grandes plaques de connexine43, le long des frontières de cellule à cellule.

Quelques non-cardiomyocytes étaient présents dans la culture. Comme on le voit ici, la cytométrie en flux a permis d’atteindre une efficacité de transvection de 45 %. De plus, un essai sur les morts-vivants a révélé que la majorité des cellules présentaient une viabilité élevée, ce qui est important lors de l’analyse de la communication jonctionnelle lacunaire.

Pour l’analyse de la frap, les cellules cibles sont sélectionnées au sein d’un groupe de cellules et sont photoblanchies avec une puissance laser de 100 %, ce qui réduit la fluorescence des micro-ARN dans les cellules sélectionnées. L’analyse quantitative et la normalisation des données acquises ont montré une récupération moyenne de 20 %Dans cette expérience, l’inhibition de la connexine par l’intermédiaire d’un ARNi43, a entraîné une réduction de l’expression des protéines et l’inhibition de la communication jonctionnelle lacunaire. La récupération de fluorescence a été réduite de plus de 50 %, ce qui indique que l’efficacité du transfert d’ARN miro dépend fortement du couplage jonctionnel entre les cellules.

Cette figure montre un rendu de surface 3D d’une expérience de frap. Par rapport aux projections maximales, l’acquisition de z-stacks peut être utilisée pour créer des reconstructions 3D afin d’étudier la localisation et la mobilité des micro-ARN au sein des cellules. Une fois maîtrisées, les mesures de frap peuvent être effectuées en deux à trois heures si elles sont effectuées correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de choisir des cellules cibles qui ont le même nombre de cellules voisines. De plus, mes paramètres de blanchiment et mes conditions d’acquisition d’images doivent être sélectionnés pour éviter les effets phototoxiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de l’utilisation de la microscopie frap, afin de quantifier et de visualiser le mouvement des micro-ARN au sein des amas cellulaires.